杜仲抗骨质疏松药效物质基础及机制研究

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1、中国分类号：R944.9单位代码：10660UDC：615.2学号：10660S120135学科专业代码：100702#级：公开贵阳医学院2015届硕士学位论文(科学学位）杜仲抗骨质疏松药效物质基础及机制研究StudiesofpharmacodynamicmaterialbasisofEucommiaulmoidesOliv研究生：兰波导师：李勇军教授兰燕宇教授年级：2012级专业：药剂学二〇一五年五月贵阳医学院学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立送行砑究Z作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品

2、。对本文的研究做出重要贡献的A人和集体，均己在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属贵阳医学院。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名（手写）：导师签名（手写）：iKh年y月&妇年$月巳学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定.同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权贵阳医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打“V”）：1、

3、保密□，在_年解密后适用本授权书。2、不保密作者签名（手与）：.导师签名（手写）：於K•年贫月2^曰…/今~年歹月>7日中国分类号：R944.9单位代码：10660UDC：615.2学号：10660S120135学科专业代码：100702密级：公开贵阳医学院2015届硕士学位论文（科学学位）杜仲抗骨质疏松药效物质基础及机制研究StudiesofpharmacodynamicmaterialbasisofEucommiaulmoidesOliv论文作者：兰波指导教师：李勇军教授兰燕宇教授申请学位：医学硕士培养单位：药学院学科专业：药剂学研究方向：天然药物活性及中药新药制备工艺、质量标准研究起止日

4、期：2012年9月至2015年3月论文评阅人：盲评答辩委员会主席：林亚平论文答辩日期：2015年5月20日二〇一五年五月杜仲抗骨质疏松药效物质基础及机制研究专业：药剂学研究生：兰波导师：李勇军教授、兰燕宇教授摘要目的：以杜仲药材有效部位提取物为研究对象，在细胞水平上考察其抗骨质疏松药效作用，阐明杜仲药材抗骨质疏松作用的药效物质基础及作用机制。方法：（1）采用大孔树脂吸附法分离杜仲化学组分并用高效液相（UPLC）进行图谱比对以探究组分制备的合理性；以对MC3T3-E1subclone14成骨细胞及SAO-2人成骨细胞存活率、碱性磷酸酶活性、骨保护素（OPG）活性的影响，筛选杜仲抗骨质疏松有效活性

5、组分（2）在杜仲各化学组分UPLC图谱比对的基础上,借助超高液相色谱–电喷雾–串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)联用技术对杜仲促成骨细胞增殖有效组分的化学成分进行质谱分析研究。（3）采用MC3T3-E1subclone14成骨细胞存活率来筛选杜仲有效活性化学成分，然后应用实时荧光定量PCR技术和Westernblot(蛋白质印迹)技术从分子水平研究杜仲有效部位中的主要化合物对MC3T3-E1subclone14成骨细胞中OPG,RANKL,RUNX-2,Osterix及TRACP等基因表达的影响，同时使用酶联免疫法检测杜仲有效组分2+中的主要化合物对MC3T3-E1subclone14成

6、骨细胞中Ca，ALP，M-CSF及OTC等因子活性的影响。结果：通过比对杜仲各化学组分高效液相(UPLC)图谱发现水煎煮提取法明显优于乙醇回流提取法，水煎煮提取物经D101大孔树脂分段后各组分基本无交叉。杜仲水提取物经D101大孔树脂分离所得40%乙醇组分对成骨细胞具有促进增殖、促分化成熟及促进OPG分泌水平的作用。利用超高液相色谱–电喷雾–串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)联用技术对40%乙醇组分进行质谱分析比对，共指认10个化合物：京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷、刺五加苷E、松脂醇单葡萄苷、紫云英苷、黄芩苷。分子生物学实验结果表明，京尼平苷酸、咖啡酸、

7、紫云英苷、黄芩苷2+具有促成骨细胞增殖的作用并且能显著提高Ca、ALP、M-CSF及OTC因子2+的表达，具有促进成骨细胞成熟分化的能力。紫云英苷、黄芩苷能促进Ca及OTC的分泌。4个化合物中只有京尼平苷酸能明显抑制M-CSF因子减少成骨细胞的转换。Westernblot实验结果表明，紫云英苷、黄芩苷、咖啡酸和京尼平苷酸能显著的上调OPG/RANKL系统的表达。黄芩苷、紫云英苷还能提高RUNX-2