脑源性神经营养因子对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机制的初步研究

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1、■巧古单位化文脑源性神鐘营养因子对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机制的巧步研究杜凤娇二〇－五年六月．’．．４，．．？？，．－ｒｍ＾ｙ■：巧【－＾：：辣職雖；祗辦徽＾这锭敛！安恥報娩站｜｜释＾＾＾游若裹臀１＾＾＾＾＾８分类号Ｓ８２３乂密级公开ＵＤＣ硕壬学位论文脑源性神经营养因子对水牛巧母细胞体外成熟的影响及其作用机制的初步研究ｆｔ凤娇学科专业动物遗传育种与繁殖指导教师陆凤花研究员李湘萍研究员论文

2、答巧日期２０－２６授予日期１１＾５答辩委员会主席卢克焕广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除己特别加标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归。目本人授权广

3、西大学拥有学位论文的部分使用权：属广西大学，Ｐ学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行、检索和传播，可Ｗ采用影印缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。識密。＂＂（请在上相应方框内打Ｖ）论文作者签名；＾巧＾日期；指导教师签名；日期人＾脑源性神经营养因子对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机制的初步研究摘要脑源

4、性神经营养因子（ＢＤＮＦ）是神经营养因子家族成员，不仅在神经系统广泛表达，在哺乳动物的卵巢中也表达。研巧表明，ＢＤＮＦ对哺乳动物卵泡发育。、卵母细胞成熟及早期脏胎发育起重要作用本研究旨在探讨ＢＤＮＦ对水牛卵母细胞体外成熟的影响，并对其相关作用机制进行初步研一究，期进步优化卵母细胞体外成熟培养体系，提高胚胎体外生产的效率。１．水牛ＢＤＮＦ基因克隆、序列分析及其在不同组织中的表达模式。测序结果显示，克隆获得的水牛ＢＤＮＦ基因全长８００ｂｐ，编码区７５３ｂｐ，编码２５０

5、个氨基酸，其核昔酸和氨基酸序列与多个物种的同源性都很高；蛋白结构预测分析显示，ＢＤＮＦ定位在细胞内且为含有信号狀序列的分泌型蛋白，－－其Ｈ级结构由多个ａ螺旋、３对反向平行的Ｐ折叠结构等构成活性中也，即Ｔ－ＰＣＲＢＤＮＦ在ＮＧＦ功能结构域，胎儿及成年水牛的也；ｑＲ检测结果显示、肝脏１０脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、皮肤、肌肉、卵巢、睾丸种组织中均有表达，在卵巢上高表达；受体ＴｒｋＢ、在胎儿及成年水牛各组织一Ｂ＾中的表达模式与ＢＤＮＦ并不完全致，但Ｔｒｋ在卵巢中高表达，而７５在

6、１卵巢中表达很低。２．ＢＤＮＦ及其受体在水牛卵泡、卵母细胞及早期胜胎中的表达模式。ＩＲＴ－ＰＣ民等方法的检测结果发现利用免疫组化、ＥＬＩＳＡ、免疫巧光染色及ｑ，ＢＤＮＦ在水牛卵泡发育各时期均有表达，且主要在卵母细胞、颗粒细胞及卵５细胞中表达，同时在直径的卵泡中，卵泡液ＢＤＮＦ浓度、卵泡颗粒细胞ＢＤＮＦｍＲＮＡ及ＴｒｋＢｍＲＮＡ的表达水平均最高，ａ？７ｍｍ的次之，２苗＆斗ｍｍ的最低，且存在显著性差异（户０．０５），而ｐ７５ｍＲＮＡ表达水平很低ＣＯＣｓｈ），

7、ＢＤＮＦ；水牛在体外成熟过程中（Ｏｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｍＲＮＡ在卵母细胞及卵丘细胞上表达呈逐渐上升庭势，ＴｒｋＢｍＲＮＡ在卵丘细胞上表达呈先上升后下降趋势，但在卵母细胞上不表达，ｐ７５ｍＲＮＡ在卵母细胞及卵丘细胞上表达呈先降低后快速上升道势；水牛早期胚胎在发育过程中（２ｃｅｌｌ、４ｃｅｌＫ８ｃｅｌｌ、桑椎胚、囊胚），ＢＤＮＦｍＲＮＡ表达呈先上升ｌｌｌｌ后下降趋势，４ｃｅ表达最高，ｐ７５ｍＲＮＡ表达呈逐渐下降趋势，２ｃｅ表达最高，而ＴｒｋＢ在化胎发育过程，ＢＤＮＦ

8、及ｐ７５在桑巧胚及裹胚表达都很低中不表达。３．ＢＤＮＦ对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机制。在体外成熟液中添加ｌＯｎｇ／ｍｌ的ＢＤＮＦ能显著提高卵母细胞的成熟率（巧．０７％ＶＳ〇４８．９６％，戶＜０．０５）及随后ＩＶＦ早期胚胎的堯胚率．２９／〇ｖｓ１５．５８％，戶＜０．０５），Ｕ３＞但对裸卵成熟无显著影响（５０．８２％ＶＳ５０．８６％，巧０．０５）在体外成熟液中；－－ｒｋＢ７５的抑制剂Ｋ２５２ａ与Ｐｅ－５分别添加Ｔ和ｐｐ，ＢＤＮＦ＋Ｋ２５２ａ组的成熟