肾细胞癌中原肌球蛋白1的表达水平及其临床和肿瘤学意义

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1、内容提要原肌球蛋白（tropomyosin,TPM）是组成细胞骨架结构微丝的重要成分，主要调节肌细胞的收缩和非肌细胞的细胞骨架稳定性。以往的观点都认为这些TPM蛋白与多种良性肌肉病变的发生密切相关，比如重症肌无力和家族性肥厚性心肌病等。但近年，越来越多的研究开始关注TPM1在肿瘤的发生发展过程中的作用，进而发现TPM1在乳腺癌等肿瘤中扮演了肿瘤抑制基因（tumorsuppressorgene,TSG）的角色。这种抑癌作用具体表现在，TPM1参与了细胞变形、侵袭、迁移、抗凋亡等一系列恶性肿瘤的生物学行为。对其作用和调控机理的深入认识会使TPM1运用到肿瘤的诊断和治疗，

2、并将使之发展为新的肿瘤标志物或药物治疗靶点成为可能。最近研究发现TPM1可能是miRNA-21的靶基因之一，而miRNA-21是在各种实体肿瘤中研究得最多的miRNA，它在各种实体肿瘤包括肾癌中都是高表达的。然而，对于TPM1在肾细胞癌中的表达水平如何以及TPM1在肾癌中是否也发挥抑癌基因的作用等问题，由于以前没有进行过系统的研究，目前这些情况仍然是不清楚的。但根据现有的事实与理论推测TPM1在肾细胞癌中应该是被下调的，并且在肾细胞癌中发挥着抑癌基因的作用，可能参与了肿瘤细胞的转移和侵袭等恶性生物学行为。为了证实以上推测，本实验运用实时定量PCR、免疫蛋白印记（We

3、sternblotting）和免疫组织化学染色的方法检测了TPM1在肾癌组织和肾癌细胞系OSRC-2及786-O中的表达水平。结合肾细胞癌患者的临床资料，分析了TPM1的表达水平与病理类型、肿瘤分期、肿瘤核分级和术后生存率等临床特征的相关性。构建pcDNA3.1-TPM1重组真核表达质粒，运用lipofectamine2000做媒介瞬时转染OSRC-2和786-O肾癌细胞，研究TPM1在肾癌中的肿瘤生物学功能。使用CCK-8试剂盒检测TPM1转染后的细胞增殖状态；利用划痕实验以及Transwell迁移实验检测TPM1对肾癌细胞迁移能力的影响；使用Transwell基

4、质胶侵袭实验检测TPM1转染前后肾癌细胞侵袭能力的变化；使用流式细胞术PI/AnnexinV双染色和PI单染色法分别检测了TPM1对肾癌细胞凋亡和细胞周期的调控作用。实验结果显示：与正常肾组织相比，TPM1在肾细胞癌中的mRNA和蛋白质表达水平显著且特异的下调。TPM1的表达水平与肾细胞癌患者的肿瘤大小、Fuhrman核分级和疾病特异性生存率相关。在肾癌细胞系中增加TPM1的表达会显著地抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，TPM1还可以促进肾细胞癌细胞的凋亡和非特异性的细胞周期阻滞，这些都提示TPM1是肾细胞癌中潜在的肿瘤抑制基因。8中文摘要肾细胞癌中原肌球蛋白1的表达水平及

5、其临床和肿瘤学意义目的：探索原肌球蛋白1（tropomyosin1,TPM1）在肾细胞癌（renalcellcarcinoma,RCC）组织和细胞系中的表达水平，本实验从mRNA、蛋白质和组织三个层面评估了TPM1的表达水平。分析TPM1的表达水平与肾细胞癌临床特征的相关性，比如肿瘤大小、肿瘤分级、肿瘤分期和存活状态等。同时在两株肾癌细胞系中进一步观察了TPM1的肿瘤生物学意义。材料与方法：利用实时定量PCR（real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR）、免疫印迹法（Westernblot）和免疫组织化学法(immunohisto

6、chemistry,IHC)检测49例肾癌患者组织标本中的TPM1表达水平。在这些分析中所使用的组织块和病历资料来自于局部肾切除术或肾癌根治术术后的患者。在细胞实验部分，对OSRC-2和786-O肾癌细胞的处理方式是利用TPM1表达质粒进行瞬时转染。使用CCK-8试剂盒、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验以及流式细胞术（flowcytometery,FCM）来分别检测转染后的细胞存活、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的状态。结果：RCC肿瘤组织中TPM1的表达水平在mRNA、蛋白质和组织层面整体上都是显著下调的（p=0.0297,p=0.0074和p<0.0001

7、），而在OSRC-2和786-O两株细胞系中都是上调的（p=0.006和p=0.003）。TPM2、TPM3和TPM4的mRNA表达水平在这些肾癌组织中相比于正常肾组织而言则无显著差异（p=0.591,p=0.104和p=0.191）；然而，几乎它们所有成员都在OSRC-2和786-O两株细胞系中有不同方向的显著变化（p=0.025,p=0.019,p<0.001和p<0.001,p=0.23,p=0.006）。明显降低的TPM1mRNA表达水平（下降超过两倍以上）与较大的肾肿瘤尺寸（大于4.5厘米）显著相关（p=0.011）。相似地，较低的TPM1染色I减弱程