甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1（cda1）的鉴定与分析

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1、^^if^fAGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1(CDA1)的鉴定与分析学位申请人：孙晓彤指导教师：郭巍教授学科专业：农业昆虫与舍虫防治学位类别：农学硕士授予单位.•河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月二日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均

2、已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：1^1、只签字日期：7U丨t年&月^円学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）签字円期：匆《年学位论文作者毕业后去向工作单位通讯地址:邮编:分类号：Q966单位代码：10086密级：公开学号：2012311甜菜夜蛾几

3、丁质脱乙酰酶1（CDA1）的鉴定与分析CharacterizationofChitinDeacetylase1（CDA1）identifiedfromSpodopteraexigua（Hübner）（Lepidoptera:Noctuidae）学位申请人：孙晓彤指导教师：郭巍教授学科专业：农业昆虫与害虫防治学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月二日摘要甜菜夜蛾（SpodopteraexiguaHübner），属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布的害虫。其取食范围非常广泛，对多种粮食作物、蔬菜、经济作物和油料作物等造成严重危害。昆虫

4、几丁质脱乙酰酶（Chitindeacetylase，CDA）是几丁质的修饰酶之一，可水解几丁质中的乙酰胺基，将几丁质降解成脱乙酰几丁质，是昆虫几丁质代谢中的一种关键酶，在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。本研究以甜菜夜蛾S.exigua5龄幼虫中肠为材料提取总RNA，利用RT-PCR及RACE技术，扩增得到甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1（chitindeacetylase1）基因的cDNA全长序列，GenBank登录号为KJ621414。该基因全长1659bp，包括一个1554bp的开放阅读框，编码518个氨基酸，N-端具有23个氨基酸的信号肽序列，预测蛋白

5、（SeCDA1）分子量为61.5kDa，等电点为4.83；NCBIBLAST分析结果表明，SeCDA1含有低密度脂蛋白结合区（LDLa）、几丁质结合区（ChBD）和脱乙酰基酶催化区（CDA），属于GroupⅠ类CDA蛋白。氨基酸序列分析发现，该序列分别含有3个N-联糖基化位点和5个O-联糖基化位点。secda1基因能够在原核细胞中表达61.5kDa目的蛋白，免疫家兔获得SeCDA1蛋白的特异性抗体。secda1基因在毕赤酵母细胞中表达80kDa的目的蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-secda1，Westernblot分析表明secda1

6、基因在昆虫细胞BTI-Tn-5B1-4（HighFive）中成功表达80kDa蛋白。脱乙酰基酶活性测定结果显示昆虫细胞表达的SeCDA1蛋白及毕赤酵母表达的SeCDA1蛋白均具有脱乙酰基酶活性，分别为1.88U/mL及1.35U/mL。利用SeCDA1特异性抗体对SeCDA1进行免疫组织定位显示，SeCDA1蛋白在卵、幼虫和蛹期中均有表达。qPCR结果显示secda1基因在卵、幼虫和蛹期中均有表达，而在卵中表达量最高，在5龄幼虫头、中肠、马氏管、脂肪体中也有表达，且在体壁中表达水平最高，推测SeCDA1可能参与卵的孵化及幼虫蜕皮过程。为进一步验证SeC

7、DA1蛋白功能，利用RNA干扰（RNAi）技术将secda1536bp保守序列克隆至pGEM-T载体，成功构建了RNAi重组质粒，大量提取纯化重组质粒，经线性化后合成dsRNA-secda1，为下一步功能研究提供了材料。关键词：甜菜夜蛾；几丁质脱乙酰酶；基因鉴定；脱乙酰基酶活性；RNA干扰CharacterizationofChitinDeacetylase1（CDA1）identifiedfromSpodopteraexigua（Hübner）（Lepidoptera:Noctuidae）Mastercandidate:SunxiaotongSupe

8、rvisor:ProfessorGuoWeiMajor:AgriculturalEntomol