甜菜夜蛾几丁质结合蛋白secbp66生化特性分析

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1、河北农业大学硕士学位论文甜菜夜蛾几丁质结合蛋白SeCBP66生化特性分析姓名：刘彬申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：郭巍20120529摘要围食膜(peritrophicmembrane，PM)是覆盖于昆虫中肠上皮细胞的非细胞几丁质．蛋白质复合物结构层，主要由蛋白质和糖类(主要为几丁质)物质组成。昆虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定能够为深入研究害虫的生防机制，寻找生物防治新靶标，以及进一步明确围食膜与病原微生物之间相互作用的分子机理等提供前提和基础。本研究对甜菜夜蛾围食膜几丁质结合蛋白SeCBP66进行了消化酶作用位点分析及生化特性研究，并对SeC

2、BP66蛋白进行了甜菜夜蛾幼虫的组织免疫定位。首先在酵母细胞中表达SeCBP66蛋白。分析SeCBP66氨基酸序列结构，确定其信号肽编码序列，设计引物扩增编码SeCBP66成熟蛋白的核酸序列。以含有G【一factor信号肽的pPIC9k质粒为载体构建重组质粒pPIC9k．厶J—secbp66，并将其转化到缺陷型毕赤酵母GSll5中，通过质粒上携带的aoxl基因与酵母基因组中的aox基因交换将其整合到酵母基因组中，利用aoxl基因特性，在甲醇环境中诱导表达SeCBP66蛋白，Westernblot检测蛋白最终无法表达出特异的蛋白。构建SeCBP66蛋白在昆虫细胞

3、系中的表达载体，设计secbp66全长基因序列引物，并在基因末端去除终止密码子，添加6×HisTag。将扩增得到的基因片段克隆入pFastBacTMl载体构建得到pFastBac—secbp66，并将其转化大肠杆菌DHl0Bac，利用载体质粒携带的Mini．attTn7转座子将目的基因转座插入到Bacmid中构建得到Bacmid．secbp66。以Cellfectin为媒介，将重组Bacmid转染昆虫细胞系Sf9，得到含有secbp66的重组病毒株VSeCBP66．1，进一步侵染昆虫细胞系Sf9扩增病毒株得到VSeCBP66．2并将病毒株侵染昆虫纽胞系BTI—

4、Tn一5B1．4(HighFive)表达SeCBP66蛋白，以Anti．His抗体为一抗Westernblot检测SeCBP66蛋白的表达，确定其在72h表达量最高。利用再生几丁质检测SeCBP66蛋白几丁‘质结合活性，确定其只能被Calcoflour类竞争性结合剂或2％SDS+5％13-Me等强变性剂洗脱，说明SeCBP66蛋白在围食膜结构中稳定结合几丁质。利用再生几丁质纯化SeCBP66蛋白，并从棉铃虫围食膜抗血清中纯化制备特异抗体。解剖甜菜夜蛾幼虫，取其组织进行SeCBP66蛋白的免疫定位，结果显示蛋白在中肠以及围食膜中都存在，且在围食膜中检测到分子量更

5、小的蛋白片段，说明SeCBP66蛋白是由整个中肠分泌，在围食膜形成过程中可能部分降解，但仍然保留其几丁质结合活性片段来成围食膜。关键词：围食膜；SeCBP66；毕赤酵母表达；细胞表达；几丁质结合PhysiologicalandBiochemical’CharacteristicsofChitinBindingProteinSeCBP66fromSpodopteraexiguaPeritrophicMembraneMastercandidate．．LiuBinSupervisor：ProgessorGuoWeiMajor：AgiculturalInsectand

6、PestControlAbstractTheperitrophicmatrix(orperitrophicmembrane，PM)isasemi—permeableextracellularmatrixthatoftenlinesthemidgutofinsectsseparatingthecontentsofthegutlumenfromthedigestiveepithelialcellsliningthemidgut．Itiscomposedofanetworkofchitinandproteinstowhichenzymesandothercompon

7、entsassociate．Isolationandidentificationofintestinalpefitrophicmembraneproteinprovidestheprerequisiteandbasisforthefurtherstudyofpestbiocontrolmechanism，lookingforbiologicalcontroltarget，andthemolecularmechanismoftheinteractionbetweenthemembraneandpathogenicmicroorganisms．Inthisstud

8、y,Spodopteraexiguap