猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究

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1、，也京诚如皆ｆ促中＠聲５钟《獻＞硕±研究生学位论文北京协和医学院研究生院学校代码；１００２３：拍０学号１２０１９０１１硕±学位论文猪峨吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究所院：输血研究所姓名；张少丹指导教师：李武平教授导师小组：李武平刘忠张磊亮教授学科专业：病原生物学研究方向：呼吸道上皮细胞原代培养完成日期；２０１５年５月中国医学科学院北京协和医学院硕±研究生学位论文目录摘要２ＡＢＳＴＲＡＣＴ３缩略词表（ＡＢＢＲＥＶＩＡＴＩＯＮＩＮＤＥＸ）５前胃６１人呼吸道上皮细胞６２呼吸

2、道模型的研究进展６３猪呼吸道模型９４研究目的与意义９材料端法１０１实验材料１０２实验方法１５结果３２１猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立３２２猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的鉴定３３ＡＡＶ６－ＧＦＰ的制备及定３重组腺相关病毒ｒ量％４ＡＡＶ６可Ｗ有效地转导猪呼吸道上皮细施３７讨论３８结４０参考篤４１综述４７个人简历５９硕±阶段论文发表情况６０致谢６１独创声明６２１中国医学科学院北京协和医学院硕±研究生学位论文猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究摘要

3、背景目前体外分化的人呼吸道上皮细胞（Ｈｕｍａｎａｉｒｗａｙ巧ｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ＨＡＥＣ）己被广泛应用于新发呼吸道病毒的鉴定、宿主与呼吸道病原体间相互作用和呼吸系统疾病的研究中。猪是许多人呼吸道病毒感染的天然宿主，在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型Ｗ及受体分布都与人类有相似之处，因此猪可作为研究呼吸道病毒感染和呼吸系统疾病药物筛选的理想模型。目的构建猪呼吸道上皮细胞（Ｐｏｒｃｉｎｅａｉｒｗａｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ＰＡＥＣ体外分化模型，）鉴定其形态学和生理学特征及其在转导外源基因方面的应用。方法本研究采用蛋白酶低温消化分离猪

4、气管和支气管上皮细胞，接种至Ｉ／ＩＩＩ型胶原蛋白包被的细胞培养皿中，使用添加多种细胞生长因子的无血清培养基进行原代培养ＩＶ型胶原蛋白包被的半透膜支持物上，采用气液界面培养法进。细胞接种至行猪呼吸道上皮细胞的体外分化培养。采用扫描电镜法、电生理和免疫组化等方法检测和鉴定培养物的细胞组成和形态学特性Ｗ及其表面典型的细胞标志蛋白。腺相关病毒Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｍｓ，ＡＡＶ）具有免疫原性低和可介导外源基因长期表达的（特性，在基因治疗领域有广阔的应用空间。本实验研究中将ＰＸＸ６８０，ｐＸＲ６，？３（：－５邱？；种质粒按照６：３３了４化；的比例转染至巧细胞，

5、培养后，收获含重组腺相关病毒ｒＡＡＶ６－ＧＦＰ的２９３Ｔ细胞。利用两步氯化飽梯度离也纯化重组ＡＡＶ－ｒ６ＧＦＰ病毒并感染分化成熟的猪呼吸道上皮细胞，研究ＡＡＶ６在该模型上的转导效率，验证ＡＡＶ６能否有效地介导外源基因表达。结果结果显示分化成熟的ＰＡＥＣ模型为多层上皮结构，其顶端表面含有纤毛细跑、一黏液分泌细胞和基底层细胞ＰＡＥＣ模－上皮细胞跨膜电阻在。型的电生理学特性定时期内保持稳定，表明ＰＡＥＣ细施间连接的形成和跨细胞间离子运输的平衡。本研－ＧＦＰ究通过Ｈ质粒共转染法成功制备了重组腺相关病毒ｒＡＡＶ６，其能够通过顶端表面感染ＰＡＥＣ，有效地转导呼吸道上皮细

6、胞。结论本文构建的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型能够模拟人呼吸道的生理学和形态学特征，为呼吸道病原体感染机制、呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础。关键字：猪呼吸道上皮细胞；气液界面培养；腺相关病毒；２中国医学科学院北京协和医学院硕止－研究生学位论文Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄ乂ｐｐＨｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｖｉｔｒｏＤｉｆｆｅｒｅｎ村ａｔｉｏｎＭｏｄｅｌｏｆＰｏｒｃｉｎｅＡｉｒｗａＥｉ化ｅｌｉａｌＣｅｌｌｓｙｐＡＢＳＴＲＡＣＴＢａｃｋｇｒｏｕ凸ｄ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｈ

7、ｕｍａｎａｉｒｗａｙｅｐｋｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｅｍｅｒｉｎｒｅｓｉｒａｔｏｒｙｖｉｒｕｓｅｓｓｔｕｄｏｆｈｏｓｔ／ｒｅｓｉｒａｔｏｒａｔｈｏｅｎｆｙｇｇｐ，ｙｐｙｐｇ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎ过ｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｓｔｅｍｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅｒｅｃｏｎｉｔｉｏｎｏｆ１ｔｐｙｙｇ；ｈｅｐｉｇｓｎａｕｒａｌｓｕｓ