牛病毒性腹泻—细小病毒病二联疫苗的研制

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1、ｐ＂＂１１ＩｒＩ牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗的研制Bovineviraldiarrhea-parvovirusdiseasebivalentvaccinedevelopment作者姓名：刘辉专业名称：兽医博士研究方向：兽医技术服务指导教师：丁壮教授学位类别：兽医博士培养单位：动物医学学院论文答辩日期：2015年12月4日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位盲审专家正高级甘肃农业大学主席：王洪斌教授东北农业大学盲审专家正高级广西大学委员：钱爱东教授吉林农业大学盲审专家正高级吉林大学张西臣教授吉林大学盲审专家副

2、高级中国农业大学张乃生教授吉林大学盲审专家正高级中国农业科学院高丰教授吉林大学李建华教授吉林大学冯海华教授吉林大学未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本，均不得对本论文的全、电子版本的任何单位和个人部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限。）。否则，应承担侵权的法律责任吉林大学博±（或硕±）学位论文原创性声明人在指导教师的指导下，，是本本人郑重声明：所呈交学位论文内容外，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的本论文不包含任何其他个人或集

3、体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中Ｗ明确方式标明由本人承担。。本人完全意识到本声明的法律结果学位论文作者签名：刮择日期；＞年／文月个日／／中文摘要牛病毒性腹泻（Bovineviraldiarrhea，BVD）又称牛病毒性腹泻-黏膜病，通过牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）引发的牛群间的一种常发、多见的传染病。该病主要临床特征可发生牛群的持续性感染，表现为犊牛腹泻，成牛多发性黏膜病，同时产生严重的免疫抑制，母畜流产等症状。牛细小病毒病是由牛细小病毒(Bo

4、vineparvovirus，BPV)引起，可以在牛群相互接触时进行传播的一种重要的传染病。该病主要临床特征是妊娠母牛发生流产和新生犊牛发生呼吸道和消化道等病症。在美国各类兽用疫苗中排在前十位的产品中有9个产品为多价或多联疫苗，多联苗在国外牛用疫苗备受关注，同时也是发展方向。但目前国内外尚无针对牛病毒性腹泻、牛细小病毒病的二联疫苗的研制报道。本研究通过细胞培养法分离到两株牛细小病毒，建立牛细小病毒株、牛病毒性腹泻病毒株疫苗开发用毒种种子批，并且对毒种种子批是否存在内外源因子污染，两个毒株在不同细胞中的复制动力学及毒株的免疫原性进行研究。牛病毒性腹泻-细小病毒病

5、二联疫苗工艺研究方面，通过对病毒培养过程的工艺参数、病毒收获液的灭活条件等的实验数据进行分析，确定了疫苗的制备工艺参数。最后对疫苗进行了效力和安全检查，证实通过上述工艺制备的疫苗是安全和有效。首先本研究从国内牛血清中成功分离获得两株牛细小病毒，分别命名NB0801、NB1202。这两株牛细小病毒均具有凝集豚鼠､马､人的红细胞的特性。使用Reed-Muench法进行病毒毒力测定，NB0801、NB1202两株牛细小病毒的毒６９力分别达到1.5×10TCID50/ml、1.2×10TCID50/ml，本实验保存的NM0901株牛病毒性腹泻病毒的毒力为1.6×107

6、TCID50/ml。建立了NB1202株、NM0901株疫苗开发用毒种库，对毒种库进行了内外源因子检测及毒种免疫原性方面的研究。内外源因子检测结果显示牛细小病毒NB1202株、牛病毒性腹泻病毒NM0901株无内外源因子污染。毒种免疫原性结果显示：牛细小病毒NB1202株体外抗体中和效价达到1:160，牛病毒性腹泻病毒NM0901株体外抗体中和效价达到1:40，证实两个毒株均具备较好的免疫原性。通过牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒在不同细胞中的复制动力学的研究。最终确II定：牛陀螺状细胞(Bovineturbinatecells，BT）细胞株作为牛细小病毒疫苗生产用

7、细胞，马-达氏牛肾细胞（Madin-DarbyBovineKidneyCells，MDBK）作为牛病毒性腹泻病毒疫苗生产用细胞。结果显示：NB1202株、NM0901株毒种库符合牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗的研发使用。牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗工艺研究方面，对牛细小病毒NB1202株、牛病毒性腹泻病毒NM0901株在3L转瓶培养过程中，不同温度参数、不同接毒剂量与病毒增殖的相关性进行研究。确定牛细小病毒NB1202株、牛病毒性腹泻病毒NM0901株在3L转瓶培养过程中的最适培养温度参数和病毒接种量。通过甲醛灭活验证试验，确定甲醛灭活最适宜浓度为0.7

8、mg/ml。通过铝佐剂剂量的筛选试验，