深色有隔内生真菌（dse）重金属抗性菌株exophiala pisciphila （h93）zip基因的克隆与功能分析

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1、分类号密级编号碛士研究生嗲像儉式题目深色有隔内生离蔺蓴金属抗性基因的克隆与功能分析学院（所、中心）云南省生物资源保护与利用霣点实验室一省部共建国家熏点实验寒堉肓棊地专业名称生物工程研究生姓名陈迪学号导师姓名赵之侘职称教授李涛职称副研究员年月论文独创性声明及使用授权本论文是作者在导师指导下取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，不存在剽窃或抄袭行为。与作者一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。现就论文的使用对云南大学授权如下学校有权保留本论文（含电子版），也可以采用

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3、sterofMicrobiologicalSciencesPresentedbyDiChenAdvisedbyProf.Dr.ZhaoZhiwei&ARTaoLiMay,2015摘要摘要云南素有；‘有色金属王国”的美誉，然而历史上矿产资源的无序幵釆导致矿区重金属污染严重，特别是土壤镉（污染己成为当地的重大环境问题。本实验室前期研究发现，会泽县者海镇镉（严重污染的铅锌矿区，常有深色有隔内生真菌定殖于自然生长的植物根部，并且对重金属镉（表现出很强的耐性和抗性，在促进植物适应重金属胁迫的矿区环境中很可能发挥着重要作用。因此研宄对镉的耐性及其相关机理，有利于阐明在重

4、金属严重污染如特殊生态系统中的功能地位，进而诠释污染矿与植物重金属耐性的关系。转运蛋白家族是一类种类繁多、分布广泛、转运底物多样的跨膜转运器。已有的研究表明转运家族与二价金属阳离子的转运有密切的联系，但是真菌中只有少数几个物种的转运蛋白基因得到克隆并验证了功能，中有关家族基因的克隆和功能研宄尚未见报道。本论文以分离自会泽铅锌矿区的嗜鱼外瓶霉实验室编号为为研宄对象，利用转录组高通量测序技术，对在无重金属胁迫和浓度为的重金属胁迫条件下培养的菌株进行转录组测序，发现其中有个基因功能注释为基因家族相关基因，通过选取差异表达最为显著的基因（为目的基因，对其进行克隆、生

5、物信息学分析、酵母异源互补功能验证、亚细胞定位和不同重金属胁迫条件下差异表达分析，得出以下结果：中基因的克隆与生物信息学分析采用反转录技术卑隆出基因的幵放阅读框（，将其命名为，该全长，可编码个氨基酸，合成蛋白的分子量约为，等电点约为。生物信息学分析结果表明组成该蛋白的氨基酸大部分为疏水性氨基酸，含有个信号肽和家族典型的个跨膜结构域，预测表明其表达部位仅为细胞膜，可初步推断其为跨膜转运蛋白。系统进化分析表明该基因与其他不同来源的基因家族成员有较高的同源性。基因的功能验证釆用酵母功能互补验证方法，将基因区（即基摘要因）融合到特异性表达质粒中，构建重组质粒。利用醋

6、酸锂转化法，通过野生型酵母、铁缺陷型酵母和锌缺陷型酵母在特定筛选培养基上的生长状况，对基因编码蛋白进行、转运功能验证。发现基因的表达使得锌转运缺陷型酿酒酵母（在低锌（螯合）培养基恢复生长，但转化的重组子酵母却在低铁（螯合）培养基无法生长。我们的结果表明印中发挥部分或者完全的转运锌离子的功能，但不能吸收和转运二价铁离子。基因亚细胞定位与表达分析通过构建含有基因区（即基因）的重组质粒，使其在酿酒酵母中诱导表达，荧光显微镜观察结果表明基因所编码蛋白定位在细胞膜上。研宄结果表明，在重金属、胁迫处理条件下，随着重金属浓度的升高，菌株中办基因分别呈现出了不同程度的下调表

7、达趋势，基因的表达受细胞外二价阳离子、浓度的调控。基因编码蛋白在中可能起到将胞外二价阳离子吸收或转运到胞内的功能。关键词：深色有隔内生真菌；嗜鱼外瓶霉；基因家族；基因克隆；功能验证AbstractAbstractYunnanprovince,knownas“’’，，，，，，AbstractthatEpZiplgenehasahighhomologytotheotherfamilymembersofZipgenes.2.ThefunctionalcomplementaryofEpZiplgeneWeusedthemethodsofyeastfunctional

8、complementaryvalidationtoc