早发型重度子痫前期合体滋养细胞外囊泡的差异蛋白质组学研究

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—－，、气：’—■分类号Ｒ７１４．７密级公开＃学号１０Ｑ２Ｑ１２１３９学校代码９００３１Ｉ洋５辛皆火‘聲博击学佐冷文早发型重度子癖前期合体滋养细胞外囊泡的＃差异蛋白质组学研究李红梅指导教师李力教授导师组成员喻而丽副教授韩健讲师培养单位第王军医大学第王附属医院野战外科研究所担产科临床医学申请学位类别博壬专业学位专业名称妇产科学论文提交日期２０１５１５年１１月论文答辩日期２０年１２月答辩委员会主席王和教授卫评阅人张社，孙丽洲，陈友国，周容，刘彩霞二〇—五年十一月＊本课题受国家自然科学基金项目（３１４７０８８６及８１２７０００８）资助。 第王军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学棱严谨的校风和科研作风，本人申巧所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人臣经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使巧过的材料，与我同工作的周志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料著有不实之处一，本人承捏巧相关责任。心！．＜＾幸茲曰期［林多论文作者签名：条：第Ｈ军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第兰军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离，后校表论文或使用论发文工成果医。作时署葦单位为第三军大学学校有权或论保留并向国家有关部口磁，查机构送交论文的复印件和盘文允许被＾公■借。！阅阅学校乂全（和可布学位论文或巧容容除），的部部分保密巧可外Ｌ、段乂采巧影或。印缩印其他手保存论文论：文作者签名．教：扛指师签《导＇，－Ｓ日化二期 目录缩略语表..............................................................................................................................1英文摘要..............................................................................................................................3中文摘要..............................................................................................................................8论文正文早发型重度子痫前期合体滋养细胞外囊泡的差异蛋白质组学研究...........12第一章前言........................................................................................................12第二章早发型重度子痫前期STB-EVs的分离与鉴定...........................................162.1材料与方法..................................................................................................162.2实验结果.....................................................................................................232.3讨论.....................................................................................................262.4小结.....................................................................................................27第三章早发型重度子痫前期STB-EVs的差异蛋白组研究....................................283.1材料与方法..................................................................................................283.2实验结果.....................................................................................................363.3讨论.....................................................................................................513.4小结.....................................................................................................54第四章Siglec-6致血管内皮功能障碍的作用研究..................................................554.1材料与方法..................................................................................................554.2实验结果.....................................................................................................654.3讨论.....................................................................................................764.4小结.....................................................................................................78全文总结........................................................................................................................79参考文献........................................................................................................................79文献综述滋养细胞碎片在子痫前期中的研究进展......................................................85参考文献........................................................................................................................96攻读博士学位期间的研究成果........................................................................................104致谢...........................................................................................................................105 第三军医大学博士学位论文缩略语表英文缩写英文全称中文全称PEpre-eclampsia子痫前期sPEseverepre-eclampsia重度子痫前期STBsyncytiotrophoblast合体滋养细胞EVsextracellularvesicles细胞外囊泡MPsmicroparticles微粒MVsmicrovesicles微泡EXOsexosomes外泌体iTRAQisobarictagsforrelativeandabsolute同位素标记的相对与绝对quantitation定量2DLC-MS/MStwo-dimensionalliquid二维液相色谱-串联质谱chromatography-tandemmassspectrometrSiglec-6sialicacidbindingimmunoglobulin-like唾液酸结合的免疫球蛋白lectin-6样凝集素6HUVEChumanumbilicalveinendothelialcells人脐静脉内皮细胞IL-6interleukelin-6白细胞介素6VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子TNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子αPBSphosphatebufferedsolution磷酸缓冲液SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠Tristris(hydroxymethyl)三羟甲基氨基甲烷ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定SEMscanningelectronmicroscope扫描电子显微镜TEMtransmissionelectronmicroscope透射电子显微镜Ggravity重力mgmilligram毫克ngnanogram纳克mlmilliliter毫升1 第三军医大学博士学位论文µLmicroliter微升dday天hhour小时minminute分钟nmnanometer纳米FCMflowcytometry流式细胞仪AFMatomicforcemicroscopy原子力显微镜DLSdynamiclightscattering动态光散射技术NTAnanoparticletrackinganalysis纳米颗粒追踪技术2 第三军医大学博士学位论文Differentialproteomicanalysisofsyncytiotrophoblastextracellularvesiclesfromearly-onsetseverepre-eclampsiaAbstractBackgroundandObjective：Hypertensivedisorderscomplicatingpreganancy(HDCP)isagroupofidiopathicdiseasesduringpregnancy.TheaveragemorbidityofHDCPis5to8percentinChina,and10to16percentofmaternaldeathswerereportedtobeduetoHDCP.Pre-eclampsia(PE)/eclampsiaisthemostdangeroustypeofHDCP,whichisapregnancy-specificdiseasecharacterizedbynew-onsethypertensionandproteinuriaafter20weeksgestation,evensecondarymaternalmultipleorgandysfunctionandfetalcomplications.PEisdividedintomildandseveretypeaccordingtotheseverityofthedisease,andalsodividedintoearly-onset(﹤34weeks’gestation)andlate-onset(≥34weeks’gestation)subtypes.Theearly-onsetsPEisparticularlyharmfultomaternalandperinatalhealth,bothinshort-andlongtermadverseeffect.However,asthepathogenesisofPEremainsnotwellilluminatedandlackedthesimple,effective,reliableandeconomicalpredictionmethods,symptomatictreatmentcombinedwithterminationofpregnancyistheonlydefinitivetreatment,andtheoutcomeisnotoptimistic.Newtreatmentstrategiesdependonthebetterunderstandingofetiologyandpathogenesis.Itisgenerallyaccepted‘two-stage’theoryaswellastherecentlyformed‘three-stage’etiologytheory.PlacentaderivedpathogenicfactorsreleaseisthekeypathophysiologicalprocessofPEonset,andendothelialinjuryistheterminalpathwayandthecenterpartofthedisease.Syncytiotrophoblastextracellularvesicles(STB-EVs)aremembranevesicle-likestructures,whichcontinuouslyshedandsecretedfromtheplacentalsyncytiumintothematernalcirculation.STB-EVscomprisedsyncytiotrophoblastmicrovesicles(STBM)andsyncytiotrophoblastexosomes(STBE).STB-EVsrangedfrom1.5percentto3percentofthetotalmicroparticlesinplasma.Asaplacentaderivedfactor,STB-EVshasbeenextensivelystudiedmorethantwentyyears.ThereleasebehaviorofSTB-EVsisaphysiologicalphenomenoninnormalpregnancy.STB-EVscanleadto3 第三军医大学博士学位论文maternalmoderateinflammatoryreactionandphysiologicalhypercoagulablestate,whichisbenefitfornormalpregnancy.However,whenthequantityandqualityofSTB-EVsreleasedfromtheplacentaweredifferentfromnormalpregnancy,STB-EVsmayhaveeffectsonvascularendothelialinjury,proinflammatory,procoagulantandimbalanceofimmunetolerance.ThesemayexplaintheprincipalpathophysiologicalprocessesandclinicalfeaturesofPE.ThedifferencesofSTB-EVsbetweenPEandnormalpregancymaybetheimportantreasonforthedisease.ItisgenerallybelievedthatthenumberofSTB-EVsfromPEwassignificantlyincreased.Atpresentmostoftheinvivoorinvitro/exvivoexperimentsonSTB-EVswereaboutphenomena,veryfewstudieshavebeendonetoexplorethespecificmechanisms,thismayduetothecompositionofSTB-EVswasunclearandtheessentialfactorsaboutPEwereunknown.Early-onsetPEisgenerallyconsideredasaprimarilyplacentaldisease,andtheetiologyandpathogenesisisdifferentwithlate-onsettype.VeryfewstudieshavebeenperformedtocomparethecomositonofSTB-EVsbetweenearly-onsetsPEandnormalpregnancy,whichmaylimitexploringthepathogenicmechanismofSTB-EVsinPE.Asproteinsarethemoleculesthatexecuteavastarrayoffunctions,theremaybemultipledifferentproteinscarriedbySTB-EVsbetweenearly-onsetsPEandnormalpregancy.AnalysisofthedifferentcompositionofSTB-EVsmayprovideimportantguaranteeforthefurtherstudyofitsspecificmechanisms,earlydiagnosisandtheevaluationoftherapeuticeffect.Furthermore,theessentialproteinsmayresultintargetsforinterventionandblockadethatprovidingnewtherapeuticstrategies.Differentialproteomicsfocusesonthescreeningandidentificationofdifferentproteinsbetweenvariousspeciesandvariousstates,whichmayhavebrightapplicationintheearlydiagnosis,monitorandtreatmentofdiseases.Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation(iTRAQ)isanewmethodologyandwidelyappliedinquantitativeproteomics,whichischaracterizedbyhighthroughput,highsensitivity,lowdetectionlimit,powerfulseparationability,wideanalysisrange,etc.WeaimtoestablishacomparativeproteomeprofileoftheSTB-EVsfromearly-onsetsPEandnormalpregnanciesusing8-PlexiTRAQquantitativeproteomics,andfurthertostudytheroleofsialicacid-bindingIg-likelectin6(Siglec-6)invascularendothelialinjuryanditsrelatedmechanism.4 第三军医大学博士学位论文MaterialsandMethods:1.Placentaewerefromearly-onsetsPEandnormalpregnantwomen.STB-EVswerepreparedfromplacentaebytheinvitroexplantculturecombinedwithafour-stepcentrifugation/ultracentrifugationmethod.Thenscanningelectronmicroscopy,immunoelectronmicroscopyandwesternblottingtechnologieswereappliedtoverifythemorphologyandimmunityofSTB-EVs.2.WeusedtheiTRAQquantitativeproteomicstechnologycombinedwithbioinformaticsanalysistostudythedifferentialexpressionproteinsofSTB-EVsbetweenearly-onsetsPEandnormalpregnantwomen.Somedifferentialexpressionproteinswereverifiedbywesternblotting.3.Weacquiredplasmafromnon-pregnancy,early-onsetsPEandnormalpregnantwomen,beforeandafterdelivery.Firsofall,weappliedwesternblottingtoanalysistheexpressionofSiglec-6intheplasmabetweenearly-onsetsPEandnormalpregnantwomenbeforedelivery.Then,weusedELISAtoassaytheSiglec-6intheplasmafromnon-pregnancy,early-onsetsPEandnormalpregnantwomen,beforeandafterdelivery.4.Wechosehumanumbilicalveinendothelialcellline(HUVEC)forthemainresearchplatforms.TheCCK-8cellproliferationassaywasusedtodetecttheimpactofdifferentlevelsanddifferentincubationtimesofSiglec-6proteinonHUVECproliferationfunction.ThewoundhealingassayandtranswellchambermigrationassaywereusedtodetecttheabilityvariationofhorizontalmigrationandnaturalmigrationinHUVECwithdifferentlevelofSiglec-6,respectively.TheTUNELassaywasperformedtodetecttheimpactofdifferentlevelsofSiglec-6proteinoncellapoptosis.ELISAanalysiseswereusedtodectectthesecretionofIL-6,TNF-αandVEGFinHUVECwithdifferentlevelofSiglec-6protein.ToexploretheprobalblemechanismofSiglec-6inendothelialdysfunction,weusedwesternblottingtoanalysistheexpressionofPI3KandphosphorylationofAKTinHUVECwithSiglec-6.Results:1.ThescanningelectronmicroscopyandimmunoelectronmicroscopyshowedthatpurifiedSTB-EVswereround,spherical,narrow,cupevenirregularstructuresandheterogeneousinsize,rangingfromapproximately30to1700nm,andtheytendtoclumptogether.Themorphologyandsizedistributionwereconsistentwithpreviouslydescribed5 第三军医大学博士学位论文STB-EVs.ImmunoelectronmicroscopyalsodemonstratedthetrophoblastsourceofSTB-EVs.Westernblottingshowedthepresenceofheatshockprotein70(Hsp70),tumorsusceptibilitygene101(Tsg101)andFlotillin-1proteins,whicharecommonlyusedasmarkersforEVs.2.WeperformedadifferentialproteomicanalysisonSTB-EVsderivedfromearly-onsetsPEandnormalpregnantwomen,usingiTRAQquantitativeproteomicstechnology.Weidentified194differentiallyexpressedproteinsinSTB-EVsderivedfromearly-onsetsPEpatients,122ofwhichwereup-regulatedand72ofwhichweredown-regulated.Furtherbioinformaticsanalysisrevealedthatmitochondrion,transmembranetransportandtransmembranetransporteractivitywerethemostabundantcategoriesinCC,BPandMF,respectively.Glycolysis/gluconeogenesis,citratecycle,fattyacidelongation,steroidhormonebiosynthesisandoxidativephosphorylationwerethefivesignificantlyrepresentedpathways.Up-regulateddifferentiallyexpressedproteinscorrelatedwithinflammatory,coagulation,angiogenesisandimmunoregulationmayparticipateinthemainpathophysiologicalprocessesofPE,andthecandidateproteinsare:S100-A8,C4b-B,CD63,ATPsynthasesubunitbeta,cDNAFLJ14908fis,endoglin，interleukin-27subunitbeta,F11receptor,isoformCRA_a,dynamin-2,proteinSEC13homolog,calnexin,serpinB9,stomatin-likeprotein2,phosphoinositide3-kinaseadapterprotein1anddolichyl-diphosphooligosaccharide-proteinglycosyltransferase48kDasubunit.Siglec-6wasthemostup-regulatedproteinintheSTB-EVsofearly-onsetsPE.Westernblottingverifiedthatfourdifferentiallyexpressedproteins(Siglec-6,calnexin,CD63andS100-A8)expressedhighlevelsintheearly-onsetsPEgroupandshowedthesametrendsastheiTRAQresults.3.WesternblottingdemonstratedthatSiglec-6expressedhighlevelintheplasmaofearly-onsetsPEgroup.ELISAdetectedSiglec-6intheplasmaofnonpregnancywasverylow(0.08±0.0007ng/ml).Forearly-onsetsPEandnormalpregnantwomenbeforedelivery,thelevelswere0.80±0.23ng/mland0.21±0.04ng/ml,respectively.Afterdelivery,theexpressionofSiglec-6decreasedrapidly,thelevelswere0.09±0.007ng/mland0.09±0.01ng/ml,whichwereclosetothelevelofnonpregnancy.4.TheCCK-8cellproliferationassaydemonstratedthatSiglec-6promotesHUVECproliferation,andthepromotioneffectpeakedwithSiglec-6concentrationof2.0ng/mland6 第三军医大学博士学位论文stimulationtimeof48h(P<0.05).ThemigrationassayshowedthatSiglec-6(2.0ng/ml)significantlyreducedboththehorizontalmigrationandthenaturalmigrationofHUVEC(P<0.05),andthewoundhealingassayalsoshowedthatSiglec-6concentrationof5.0ng/mlsignificantlyreducedthenaturalmigrationmorethantheconcentrationof2.0ng/ml(P<0.05).Siglec-6(2.0ng/ml,48h)promotedtheapoptosisofHUVEC.Siglec-6promotedHUVECtosecreteIL-6andTNF-αinadose-dependentandtime-dependentmanner(P<0.05).Siglec-6suppressedHUVECtosecreteVEGF,andthesuppressionwasnotrelatedtothedoseandstimulationtimeofSiglec-6.WesternblottingshowedthatSiglec-6(2.0ng/ml,48h)significantlyreducedtheexpressionofPI3K(P<0.05),andalsosignificantlyreducedthephosphorylationofAKT.Conclusions:1.ProteinsofSTB-EVsderivedfromearly-onsetsPEweredifferentfromnormalpregnantwomen.Siglec-6wasthemostup-regulateddifferentialexpressionproteinintheSTB-EVsofearly-onsetsPE.2.ThelevelofSiglec-6intheplasmaofearly-onsetsPEwassignificantlyincreased,anditwasaboutfourtimesofnormalpregnantwomen.Afterdelivery,theexpressionofSiglec-6decreasedrapidly,whichwasclosetothelevelofnonpregnancy.Terminationofpregnancyistheonlydefinitivetreatmentforearly-onsetsPE,andthechangeofSiglec-6inplasmaprovidedanexperimentalevidenceforit.3.Siglec-6mayinjuryvascularendotheliumbyinhibitingtheproliferationandmigrationofendothelialcells,promotingendothelialcellsapoptosisaswellassecretionofIL-6andTNF-α,andinhibitingthesecretionofVEGF.TheseeffectsmaybeachievedbyinhibitingthePI3K-AKTsignalingpathway.Siglec-6maybeoneofthekeyproteinsinthepathogenesisofearlyonsetsPE.Keywords:early-onsetseverepre-eclampsia；syncytiotrophoblastmicrovesicles；syncytiotrophoblastextracellularvesicles；exosomes；iTRAQ；Siglec-6；endothelialcells7 第三军医大学博士学位论文早发型重度子痫前期合体滋养细胞外囊泡的差异蛋白质组学研究摘要背景：妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的一组疾病，我国的发病率约5%-8%，是导致孕[1]产妇死亡的重要原因，约占妊娠相关死亡总数的10%-16%。子痫前期(pre-eclampsia,PE)/子痫(eclampsia)是妊娠期高血压疾病中最严重的类型，特指妊娠20周后新出现的高血压和蛋白尿，常继发母体多器官功能受损及胎儿并发症。按照病情的轻重分为轻度子痫前期(mildpre-eclampsia,mPE)和重度子痫前期(severepre-eclampsia,sPE)，以妊娠34周发病为界限，又分为早发型(﹤34周)和晚发型(≥34周)两种亚型，尤其以早发型重度子痫前期(early-onsetsPE)危害性大，严重威胁母儿近期及远期的健康和生存质量。然而，PE的确切病因和发病机制仍未阐明，目前缺乏简便、有效、可靠和经济的疾病预测方法，临床治疗陷于被动，长期以来以“对症治疗结合终止妊娠”为主，母儿结局并不乐观。新的治疗策略及方案有赖于对PE病因和发病机制的深入挖掘。学术界广泛接纳[2]PE发病的“两阶段”假说，以及近年来在此基础上发展形成的“三阶段”病因学说[3,4]认为胎盘源性不良因子的释放是PE发病关键的病理生理环节，血管内皮损伤是发病的终末通路和中心环节。合体滋养细胞外囊泡(syncytiotrophoblastextracellularvesicles,STB-EVs)是自胎盘脱落直接进入母体血循环的带膜囊泡状结构，主要包括合体滋养细胞微粒(syncytiotrophoblastmicrovesicles,STBM)和合体滋养细胞外泌体[5](syncytiotrophoblastexosomes,STBE)，占血浆总微粒的1.5%-3%。作为重要的胎盘源性因子，STB-EVs已被发现了二十余年，其释放行为是正常妊娠过程中的一种生理现象，可调控母体适度的炎性反应和生理性高凝状态等，利于正常妊娠的维持。然而，当胎盘释放的STB-EVs在数量和质量上发生变化时，STB-EV具有损伤血管内皮、促炎症反应、促凝血以及诱导免疫耐受失衡等特性，在PE的发生发展中发挥至关重要[6-9]的作用。既往研究认为STB-EVs在数量上的差异性可能是其致病的重要原因，PE患者外周血中STB-EVs的数量显著增多，但迄今为止大部分的体内实验或体外实验多为现象的观察与描述，较少涉及STB-EVs具体致病机制的深入探讨，这可能与8 第三军医大学博士学位论文STB-EVs的成分构成不清、参与重要病理过程的关键致病因子不明有关。早发型重度子痫前期是一种胎盘源性疾病，其病因及发病机制不同于晚发型，更鲜有研究针对早发型重度子痫前期患者和正常妊娠妇女胎盘STB-EVs成分构成的对比分析，限制了STB-EVs对于PE尤其是早发型sPE致病机制的进一步探索。生物体内最终执行功能的是蛋白质，PE患者体内产生的STB-EVs可能在“质量”[10]即蛋白质成分构成上不同于正常妊娠状态。因此全面解析PE及正常妊娠时STB-EVs的差异蛋白质表达谱，在此基础上挖掘关键的致病因子，为进一步探索STB-EVs导致PE发病的具体机制、疾病的早期诊断及临床疗效的评估等奠定重要的研究基础。此外，对STB-EVs相关致病因子进行干预和阻断，也将为PE的临床治疗提供新的思路与策略。差异蛋白质组学着重于筛选和鉴定不同种类或不同状态下各样本间蛋白质组的区别和变化，在疾病的早期诊断、病情进展的监控和临床治疗效果的判断等方面具有光明的应用前景。同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)是近年来运用广泛的一种新型蛋白质组学定量研究技术，具有高通量、高灵敏度、低检测限、分离能力强、分析范围广等特点。本研究采用iTRAQ定量蛋白组学相关技术分析早发型重度子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘合体滋养细胞外囊泡的差异表达蛋白，并进一步研究差异表达蛋白唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素6(sialicacid-bindingIg-likelectin6,Siglec-6)在血管内皮损伤中的作用及相关机制。材料与方法：1、获取早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女胎盘组织，采用绒毛组织块培养结合四步差速/超速离心法体外制备胎盘STB-EVs，应用扫描电镜、免疫电镜及Westernblotting方法进行形态学及免疫来源的鉴定。2、通过iTRAQ定量蛋白组学技术结合生物信息学方法分析早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女胎盘STB-EVs中差异表达的蛋白质，并应用Westernblotting方法对差异表达的蛋白进行验证。3、获取健康未孕妇女、早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女分娩前及分娩后的血浆。通过Westernblotting方法分析早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女血浆中Siglec-6蛋白的表达情况，并进一步用ELISA法测定Siglec-6在健康未孕妇女、早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女分娩前及分娩后血浆中的含量。4、以人脐静脉内皮细胞HUVEC为实验平台，利用CCK-8细胞增殖实验检测9 第三军医大学博士学位论文Siglec-6在不同的处理浓度及处理时间条件下对HUVEC细胞增殖的反应；利用细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验检测不同的Siglec-6处理对HUVEC细胞水平迁移和固有迁移能力的影响；利用TUNEL法检测Siglec-6处理对HUVEC细胞凋亡的影响；利用ELISA法测定不同的Siglec-6处理对HUVEC细胞分泌IL-6、TNF-α及VEGF的影响；采用Westernblotting检测Siglec-6处理后HUVEC细胞中磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)的表达及蛋白激酶B(proteinkinaseB,PKB/AKT)磷酸化水平的变化情况。结果：1、扫描电镜和免疫电镜显示STB-EVs呈圆形、球形、狭长型、杯形甚至不规则形，大小各异，多个囊泡聚集成团，囊泡大小在30nm-1700nm之间，与前期研究相吻[9]合。免疫电镜证实了STB-EVs的滋养细胞来源特性。Westernblotting检测表明STB-EVs中存在Hsp70、Tsg101及Flotillin-1等囊泡标志蛋白。2、运用iTRAQ定量蛋白质组学相关技术对早发型重度子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘STB-EVs进行差异蛋白质分析，共鉴定出194个差异表达的蛋白，其中122个差异蛋白在病例组表达上调，72个表达下调。进一步的生物信息学分析表明这些差异表达蛋白参与细胞组成、生物过程和分子功能分别富集于线粒体、跨膜转运和跨膜转运蛋白活性方面。差异表达蛋白参与的主要代谢及信号通路为糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、脂肪酸延伸、类固醇激素生物合成以及氧化磷酸化。在早发型重度子痫前期组表达上调的差异表达蛋白涉及炎症反应、凝血过程、抗血管生成、免疫调节等子痫前期发病的主要病理生理过程，候选蛋白包括S100-A8,C4b-B,CD63,ATPsynthasesubunitbeta,cDNAFLJ14908fis,endoglin,interleukin-27subunitbeta,F11receptor,isoformCRA_a,dynamin-2,proteinSEC13homolog,calnexin,serpinB9,stomatin-likeprotein2,phosphoinositide3-kinaseadapterprotein1和dolichyl-diphosphooligosaccharide-proteinglycosyltransferase48kDasubunit。Siglec-6是早发型重度子痫前期胎盘STB-EVs中上调最为显著的蛋白。Westernblotting方法检测差异表达蛋白CD63、S100-A8、Siglec-6以及Calnexin的表达，验证了其与iTRAQ定量分析的结果一致。3、Westernblotting方法证实早发型重度子痫前期患者血浆中Siglec-6蛋白的水平显著高于正常妊娠妇女。ELISA检测Siglec-6在健康未孕女性外周血中几乎无表达(0.08±0.0007ng/ml)，在未分娩的早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女血浆中的含量分别为0.80±0.23ng/ml和0.21±0.04ng/ml，且分娩后Siglec-6的表达迅速降低，分别为0.09±0.007ng/ml及0.09±0.01ng/ml，接近未孕水平。10 第三军医大学博士学位论文4、CCK-8细胞增殖实验表明Siglec-6处理可抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞的增殖，在测试的浓度和时间中，以2.0ng/ml的Siglec-6处理48h对细胞增殖的抑制作用最强(P<0.05)；Transwell小室迁移实验显示2.0ng/ml的Siglec-6显著抑制HUVEC细胞在水平方向迁移能力(P<0.05)；细胞划痕实验显示2.0ng/ml的Siglec-6可抑制HUVEC细胞的固有迁移能力(P<0.05)，浓度升高至5.0ng/ml时对HUVEC细胞固有迁移能力的抑制作用更明显(P<0.05)；TUNEL法检测结果表明2.0ng/ml的Siglec-6可促进HUVEC细胞的凋亡(P<0.05)；ELISA测定结果显示：Siglec-6以剂量和时间依赖模式促进HUVEC细胞分泌IL-6与TNF-α(P<0.05)，Siglec-6抑制HUVEC细胞分泌VEGF(P<0.05)，且这种抑制作用与Siglec-6的剂量和作用时间不相关。Westernblotting检测结果显示，Siglec-6可致HUVEC细胞中PI3K的表达以及AKT磷酸化水平降低(P<0.05)。结论：1、早发型重度子痫前期与正常妊娠妇女胎盘STB-EVs的蛋白质表达谱存在差异。筛选发现Siglec-6是早发型重度子痫前期STB-EVs中上调最显著的差异表达蛋白。2、Siglec-6在早发型重度子痫前期患者外周血中的表达水平显著高于正常妊娠组，其含量约为正常妊娠妇女的4倍，且分娩后表达迅速降低，接近未孕水平。血浆中Siglec-6的水平变化为临床终止妊娠是早发型重度子痫前期唯一有效的治疗手段提供了实验佐证。3、Siglec-6可能通过调控PI3K-AKT信号通路，抑制血管内皮细胞的增殖和迁移、促进血管内皮细胞的凋亡及炎性因子IL-6及TNF-α的分泌、抑制VEGF的分泌，导致血管内皮损伤。Siglec-6可能是诱发早发型重度子痫前期发病的关键蛋白之一。关键词：早发型重度子痫前期；合体滋养细胞微粒；合体滋养细胞外囊泡；外泌体；iTRAQ；Siglec-6；内皮细胞11 第三军医大学博士学位论文早发型重度子痫前期合体滋养细胞外囊泡的差异蛋白质组学研究第一章前言子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种多系统功能紊乱的重要产科并发症，几乎仅在人类妊娠过程中发生，严重威胁孕产妇和围产儿健康。PE特指妊娠20周以后新出现的高血压、蛋白尿、水肿等症状，继发多器官功能受损，严重者出现颅内病变、抽搐甚至死亡。全球发病率为2-8%，约2%的PE进展为子痫(eclampsia)，引起抽搐和母胎死亡。2006年世界卫生组织报道发展中国家约16%的母胎死亡归因于高血压疾病，2010年美国报道的数据表明子痫前期/子痫导致孕产妇的死亡率占妊娠相关疾病的[11]12.3%，与2013年法国报道的10%相当。子痫前期按照病情严重程度可分为轻度(mildpreeclampsia,mPE)和重度(serevepreeclampsia,sPE)，后者指血压持续升高(收缩压≥160mmHg和/或舒张压≥110mmHg)、尿蛋白持续升高(≥5.0g/24h或随机蛋白尿≥+++)，发生母体脏器功能不全或胎儿并发症。近年来又按妊娠34周发病为界限，将PE分为早发型(﹤34周)和晚发型(≥34周)两种亚型。[2]迄今为止，PE的发病机制仍不清楚，学术界广泛接受PE发病的两阶段假说，[3,4]以及在此基础上发展形成的三阶段假说：第一阶段为胚胎着床期(孕3-8周)，母体对同种异体胚胎存在免疫耐受不全；第二阶段为胎盘形成期(孕8-18周)，滋养细胞侵入不足，子宫螺旋动脉重塑障碍，胎盘浅着床、合体滋养层发育不良，即胎盘形成不足，为后期发病提供解剖病理基础；第三阶段为晚孕期，胎盘低灌注，氧化应激增加，胎盘缺血缺氧导致滋养细胞的凋亡与坏死增加，胎盘来源的不良因子大量释放到母体血循环中，诱发母体过度的系统性炎症反应、血管内皮损伤以及免疫耐受失衡，最终导致PE。然而，一旦胎盘娩出，子痫前期患者出现的一系列临床症状和体征迅速消退或减轻，提示诱发子痫前期/子痫的致病因子可能主要来自于胎盘。胎盘产生的可溶性血管内皮细胞生长因子受体-1(sFlt-1)、可溶性内皮因子(sENG)、胎盘生长因子(PLGF)、过氧化物类和类花生酸类分子、各种细胞因子及STB-EVs均可能构成母体临床反应的诱发因素。胎盘因素在子痫前期发病中的地位和作用已取得学术界的广泛共识，子痫前期是一种胎盘诱导的放大了的母体失代偿改变，尤其早发型重度子痫前期更是一种[12,13]胎盘源性疾病，有望用胎盘来源的生物标记物进一步完善PE的经典定义。12 第三军医大学博士学位论文细胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)是由原核生物、真核生物以及植物等细胞以一种进化保守的方式向细胞外释放的含膜小囊泡，主要由含磷脂双分子层的膜和膜内[14]容物组成，其生成、丰度、大小、内含物和生物学功能等均存在异质性。已有的报道证实了网织红细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞、血小板、树突状细胞、神经元、神经胶质细胞、各种上皮细胞(大小肠、尿路、支气管)、肝细胞以及各种肿瘤细胞等均可产生EVs。此外，EVs还可出现在血液、各种类型的体液以及细胞培养液中，目前已从血浆和血清、眼房水、脑脊液、唾液、乳汁、滑液、鼻腔及支气管分泌物、胆汁、[9]尿液、羊水、精液、胸水与腹水、多种原代或细胞系培养液中分离出EVs。学术界[14-17]将EVs主要分为三类：(1)微泡/微粒/核外粒体：由细胞膜向外芽生及断裂产生，为较大EVs，直径0.2-2um，呈圆形、椭圆形或狭长形，电子密度可变和/或含半透明的内容物；(2)外泌体：形成于胞内体网络，并由多泡体与细胞膜融合释放，为较小的EVs(直径30-100/150nm)，呈杯状；(3)凋亡小体：细胞凋亡过程中细胞膜起泡/碎裂产生，也称之为凋亡小泡或凋亡囊泡，凋亡小体的大小范围更广，直径从300nm到3um不等，且含有细胞器。前面两种类型是当前聚焦的热点。研究表明，除了膜表面携带母体细胞抗原、脂质外，EVs内还包含多种蛋白质、mRNA、microRNA和DNA等，EVs可参与细胞间信号传递、细胞粘附、凝血、免疫调节、炎症、血管生成、废弃物处理等多种生理或病理过程，同自身免疫性疾病、血栓形成、心血管疾病、肿瘤等多种疾病的[16,18]发生发展密切相关。近年来EVs在肿瘤领域的应用尤为广泛与深入，不仅可以作[19]为早期诊断的标记物，还可以为临床靶向治疗提供新的策略。Rabinowits等研究表[20]明外泌体miRNA可作为肺癌的诊断标志物，Pisitkun等用尿液中的外泌体蛋白辅助鉴别诊断多种肾脏疾病。来源于树突状细胞(DCs)的EVs运用于肿瘤的免疫治疗，间充[17]质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)来源的EVs用于心肌梗死的组织修复。基于EVs的肿瘤疫苗已通过I期临床试验；树突状细胞来源的EVs用于非小细胞肺癌的治疗也即将进入Ⅱ期临床试验；将EVs作为潜在的运载工具，运载姜黄素用以治疗结肠癌[21]也正处于Ⅰ期临床试验。Alvarez等第一次成功利用EVs治疗了鼠的阿尔茨海默病模型。与传统基因靶向治疗的候补载体如脂质体、病毒以及聚乙烯亚胺为基础的纳米[22]颗粒相比，EVs的安全性、靶向能力和免疫反应性等方面更具优势，因此，EVs有望成为基因靶向治疗最理想的载体。为更好的推进这一领域的发展，学术界已成立数个组织及杂志对该研究成果进行统筹归纳与公开发表。2011年国际上致力于EVs研究的科学家们成立了国际微泡学会(InternationalSocietyforExtracellularVesicles,ISEV)，其官方杂志为“JournalofExtracellularVesicles(JEVA)”，官方网站为13 第三军医大学博士学位论文http://www.journalofextracellularvesicles.net/index.php/jev。另外有两个数据库可供参考：ExoCarta(http://exocarta.org)和Vesiclepedia(http://microvesicles.org)。胎盘介于母体和胎儿之间，是维持胎儿宫内生长发育的重要器官，具有高度血管化的特点。胎盘不仅参与气体交换、营养供应、激素合成，还是一个重要的免疫场所。滋养细胞是构成胎盘的主要成分，妊娠晚期与母体血液直接接触的胎盘部分几乎全被合体滋养细胞(syncytiotrophoblsat,STB)所覆盖，STB在活化与更新过程中可持续产生和分泌大小、形态和功能各异的细胞外囊泡至母体循环中，即合体滋养细胞外囊泡(syncytiotrophoblsatextracellularvesicles,STB-EVs)，主要包括合体滋养细胞细胞微粒/微泡(syncytiotrophoblsatmicroparticles/microvesicles,STBM)和合体滋养细胞外泌体[5](syncytiotrophoblsatexosomes,STBE)，占血浆总微粒的1.5%-3%。“三阶段”病因学假说明确了胎盘源性不良因子的释放是PE发病的关键病理生理环节，胎盘娩出后，子痫前期患者出现的一系列临床症状和体征迅速消退或减轻，提示诱发子痫前期/子痫的致病因子可能主要来自于胎盘，而STB-EVs可能是一类主要的胎盘源性因子。该领域的研究最早由牛津大学团队开启，近年来不断有来自世界各国的团队致力于其中，归纳文献命名为STBM包括：合体滋养细胞微粒(syncytiotrophoblastmicroparticles,[23][24]STBM)、合体滋养细胞微泡(syncytiotrophoblastmicrovesicles,STBM)、合体滋养[25]细胞微绒毛(syncytiotrophoblastmicrovilli,STBM)、合体滋养细胞微绒毛膜[26](syncytiotrophoblastmicrovillousmembrane,STBM)、合体滋养细胞来源小囊泡[27](syncytiotrophoblastderivedvesicles,STBM)以及合体滋养细胞外囊泡[28](syncytiotrophoblastextracellularvesicles,STBM)。限于目前的技术与方法，体外制备的STBM中均混有外泌体，结合EVs的研究进展，用STB-EVs来命名更为恰当。二十余年来的研究表明，STB-EVs不是简单的细胞脱落物，而是携带有多种生物学信息且具有多种重要生物学活性的分子载体，STB-EVs的释放行为本身是正常妊娠过程的一种生理现象，参与维持正常妊娠时母体适度的炎性反应和生理性高凝状态等。然而，当胎盘释放的STB-EVs在数量和质量上发生改变，STB-EVs具有促血管内皮损伤、促炎症反应、促凝血以及导致免疫耐受失衡等特性，与PE的发生发展密切相关。既往研究认为STB-EVs在数量上的差异性可能是其致病的重要原因，PE患者外周血中STB-EVs的数量显著增多，但迄今为止大部分的体内实验或体外实验多为现象的观察与描述，较少涉及STB-EVs具体致病机制的深入探讨，这可能与STB-EVs的成分构成不清、参与重要病理过程的关键致病因子不明有关。早发型重度子痫前期是一种胎盘源性疾病，其病因及发病机制不同于晚发型，更鲜有研究针对早发型重度子痫前14 第三军医大学博士学位论文期患者和正常妊娠妇女胎盘STB-EVs成分构成的对比分析，限制了STB-EVs对于PE致病机制的进一步探索。生物体内最终执行功能的是蛋白质，PE患者体内产生的[10]STB-EVs可能在“质量”即蛋白质成分构成上有别于正常妊娠状态。因此全面解析PE及正常妊娠时STB-EVs的差异蛋白质表达谱，在此基础上挖掘关键的致病因子，为进一步探索STB-EVs致PE发病的具体机制奠定重要的研究基础。蛋白质组学(Proteomics)是一个组合词汇，由蛋白质(protein)与基因组学(genomics)两个词语形成的缩合体，以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平探索细胞模式、疾病机制及功能关系等。蛋白质组学主要包括两种研究策略：一种是蛋白质组学兴起初期的“完全”蛋白质组学，目的是检测细胞或组织样本内基因组所表达的所有蛋白质；另一种是着重于筛选和鉴定不同种类或不同状态下各样本间蛋白质组的区别和变化的“差异”蛋白质组学，在疾病的早期诊断、病情进展的监控和临床治疗效果的判断等方面具有广泛和明确的应用前景。随着生物技术的飞速发展，蛋白质组学领域的研究也不断拓展与深入，一些新的研究方向应运而生，如细胞外囊泡、线粒体等亚细胞蛋白质组学及定量蛋白质组学。定量蛋白质组学是鉴定和准确定量基因组或混合体系中全蛋白一门学科。按照蛋白质的分离技术将定量蛋白质组学研究分为两类：一类是基于凝胶电泳和质谱相关技术；另一类是基于同位素标记和色谱串联质谱检测技术，同位素标记又细分为体内标记技术和体外标记技术。体内标记技术主要用于培养的细胞体系中，其应用范围并不广泛。近年来由美国应用生物系统公司研发推广的同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)采用体外标记技术，是一种新的蛋白质组学定量研究方法。近年来iTRAQ技术在肿瘤领域应用尤其广泛，而在胎盘及滋养细胞方面的研究正逐渐开展。iTRAQ主要的特点为：(1)高通量：可同时对多个时间点不同处理的8个样本进行分析，可比性强；(2)分离能力强、分析范围广：可对任何类型的蛋白质进行鉴定，不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白；(3)高灵敏度、低检测限：可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白；(4)结果可靠：定量与定性分析结果更加可靠；(5)自动化程度高：液相色谱串联质谱，自动化操作，分析速度快，分离效果好。本研究采用iTRAQ定量蛋白质组学技术结合相关的生物信息学方法，全面解析早发型重度子痫前期患者和正常妊娠孕妇的胎盘STB-EVs差异表达蛋白，筛选在PE发病中发挥主要作用的关键分子并予以验证。为进一步探索STB-EVs导致PE发病的具体机制、疾病的早期诊断及临床疗效的评估等奠定了重要的基础，对相关致病因子进行干预和阻断，也将为PE的临床治疗提供新的策略。15 第三军医大学博士学位论文第二章早发型重度子痫前期STB-EVs的分离与鉴定早发型重度子痫前期由于其病因未明、母胎孕期结局较差、远期并发症更多、家庭和社会的负担更重等原因，已经成为全世界妇产科学者研究的重点。胎盘因素在子[12]痫前期尤其是早发型重度子痫前期发病中的作用与地位已取得广泛共识。大量的研究显示，STB-EVs与重度子痫前期的发病密切相关。发生早发型重度子痫前期时，胎盘释放的STB-EVs不仅数量显著升高，而且成分构成也可能发生了改变。STB-EVs最理想的获取途径是抽取孕妇的外周血，但是由于其在外周血所占比例低、大多与内皮细胞及单核细胞等相结合，难以纯化出游离的STB-EVs用于实验研究，体外制备出足够数量和质量的STB-EVs是对其深入研究的基础。然而目前为止，关于细胞外囊泡的分离和纯化尚缺乏国际统一的标准和流程。归纳文献，目前STB-EVs共有[6,29]四种体外制备方法：(1)机械法(mechanicaldissection,mSTBM)；(2)胎盘绒毛小叶灌注法(placentalperfusion,pSTBM)；(3)胎盘绒毛组织块培养法(explantculture,eSTBM)；(4)滋养细胞系来源。本部分实验研究中，临床获取典型的早发型重度子痫前期患者及正常妊娠孕妇的胎盘组织，通过胎盘绒毛组织块培养结合四步差速离心法分离得到STB-EVs，采用扫描电镜、免疫电镜以及Westernblotting鉴定其形态及滋养细胞来源，为下一步STB-EVs差异蛋白组的解析提供实验保障。2.1材料与方法2.1.1实验材料2.1.1.1临床胎盘组织样本本实验研究内容和研究方案均获得第三军医大学大坪医院伦理委员会批准。选取2013年7月～2014年4月在第三军医大学大坪医院和西南医院妇产科住院并经剖宫产分娩的产妇36例，其中早发型重度子痫前期患者24例，正常妊娠孕妇12例，均已签署知情同意书，均在胎盘娩出后5min内取样。所有研究对象均为单胎妊娠。早发型重度子痫前期的诊断主要依据第23版《威廉姆斯产科学》以及第8版《妇产科学》，即：孕20周后，至少两次连续监测(间隔4小时)BP≥160/110mmHg；尿蛋白≥5g/L或大于3+(无泌尿道感染)；伴上腹不适、头痛等不适；妊娠34周以前发病。年龄≤35岁，16 第三军医大学博士学位论文排出慢性高血压、慢性肾炎、糖尿病、肥胖、凝血功能异常、肿瘤、自身免疫性疾病、肝病、营养不良、多胎妊娠等病史。选择瘢痕子宫妊娠或胎位异常(如臀位妊娠)等具有剖宫产分娩指征的产妇作为正常妊娠组。研究对象的相关信息如表2-1所示。表2-1研究对象特征ControlgroupsPEgroupSubjectsparticipatingintheiTRAQstudySamplename123123Age(y)222722263126BMI24.426.223.230.432.026.8Gestation(days)257257237233232236MaximumsystolicBP(mmHg)12010996198162165MaximumdiastolicBP(mmHg)70745812797105Proteinuria---+++++++++Birthweight(kg)350029502800135714501520Placentaweight(kg)500500500350380300SubjectsparticipatingintheWesternBlotstudySamplenumbern=12n=24Age(y)32.2±2.131.6±4.6BMI23.8±1.929.4±3.0*Gestation(days)265±8.7231±6.9*MaximumsystolicBP(mmHg)112.8±10.4172.4±10.7*MaximumdiastolicBP(mmHg)75.3±6.9119.7±8.6*Proteinuria-+++*注：sPE组与正常妊娠相比，p<0.05。2.1.1.2实验主要仪器及耗材(1)超净工作台：中国苏州安泰空气技术有限公司(2)手术镊、眼科剪等高压消毒手术器械：中国上海医疗仪器厂(3)精密电子天平：瑞士MettlerToledo公司(4)超纯水处理系统：美国Millipore公司(5)0.22um一次性针头滤器：美国Millipore公司(6)100mm细胞培养皿：美国Coring公司(7)二氧化碳培养箱：美国SHELLAB公司(8)15ml/50ml离心管：美国Coring公司(9)低温高速离心机：美国Beckman公司17 第三军医大学博士学位论文(10)低温超速离心机：日本日立公司(11)扫描电镜：日本日立公司(12)透射电镜：荷兰Philips公司(13)超低温冰箱：美国Thermo公司(14)电泳槽及电泳仪：美国Bio-Rad公司(15)PVDF膜：美国Millipore公司(16)核酸蛋白测定仪：美国BioTek公司2.1.1.3实验主要试剂(1)DMEM/F12培养基：美国Gibico公司(2)胎牛血清：美国Gibico公司(3)抗生素和抗真菌溶液(三抗)：美国Gibico公司(4)抑肽酶：美国Sigma公司(5)肝素钠：中国江苏万邦生化医药公司(6)BCA蛋白定量试剂盒：中国上海碧云天生物技术公司(7)ECL化学发光底物试剂盒：美国Pierce公司(8)小鼠抗人滋养细胞蛋白单克隆抗体(NDOG1)：美国Abcam公司(9)兔抗人Hsp70多克隆抗体：美国Thermo公司(10)小鼠抗人Tsg101单克隆抗体：美国SantaCruz公司(11)兔抗人Flotillin-1多克隆抗体：美国SantaCruz公司(12)山羊抗兔IgG：美国Pierce公司(13)山羊抗小鼠IgG：美国Pierce公司(14)山羊抗小鼠纳米金IgG：美国Nanoprobes公司(15)Silverenhance溶液：美国Nanoprobes公司(16)正常山羊血清：美国invitrogen公司(17)甘氨酸：美国Sigma公司(18)牛血清白蛋白：美国Sigma公司(19)SDS-PAGE凝胶配制试剂盒：中国上海碧云天生物技术公司(20)RIPA裂解液：中国上海碧云天生物技术公司(21)蛋白预染Marker：美国Pierce公司(22)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2×)：中国上海碧云天生物技术公司2.1.1.4计算机软件18 第三军医大学博士学位论文(1)Image-ProPlus6.0：美国MediaCybernetics公司(2)Labwork4.6：美国UVP公司(3)GraphPadPrism5.0：美国GraphPad公司2.1.2实验方法2.1.2.1主要溶液的配制(1)抑肽酶溶液：抑肽酶粉末5mg，完全溶于10ml无菌超纯水，1ml分装，于-20℃冰箱中保存。按照说明书1mg抑肽酶相当于5TIU活性单位，抑肽酶活性单位的换算公式：1TIU=1300U，配制的抑肽酶浓度为3500U/ml。(2)DMEM/F12完全培养基：取Gibico公司DMEM/F12培养基90ml，加入胎牛血清10ml及三抗1ml，混匀，封口膜封口，标记培养基种类及配制时间，于4℃冰箱中保存。(3)0.1MPBS(pH=7.2～7.4)溶液的配制：取0.1MPBS粉末一袋，加入超纯水溶解并定容至1000ml(pH=7.4)，分装成250ml/瓶，高压灭菌后于4℃冰箱中保存。(4)2.5%戊二醛溶液：取25%戊二醛溶液10ml，加入50mlPBS溶液后，再用超纯水定容至100ml，于4℃冰箱中保存。(5)4%多聚甲醛溶液：称取多聚甲醛4g，加入0.1MPBS溶液100ml。(6)5%BSA-PBS(w/v)溶液：称BSA粉末500mg，加入10mlPBS溶液，充分溶解后，经0.22um滤膜过滤，1ml分装，于4℃冰箱中保存2天。(7)1%BSA-PBS溶液：取5%BSA-PBS溶液1ml，加入4mlPBS溶液，经0.22um滤膜过滤，1ml分装，于4℃冰箱中保存2天。(8)0.5%BSA-PBS溶液：取5%BSA-PBS溶液1ml，加入9mlPBS溶液，经0.22um滤膜过滤，1ml分装，于4℃冰箱中保存2天。(9)0.1%BSA-PBS溶液：取1%BSA-PBS溶液1ml，加入9mlPBS溶液，经0.22um滤膜过滤，1ml分装，于4℃冰箱中保存2天。(10)50mM甘氨酸-PBS溶液：甘氨酸分子量75g/mol，50mM甘氨酸：75×0.05=3.75g/L，即每升PBS溶液中加入甘氨酸3.75g。取10mlPBS溶液，称取甘氨酸37.5mg，加入10mlPBS溶液，充分溶解，经0.22um滤膜过滤，1ml分装，于4℃冰箱中保存2天。(11)10%山羊血清-5%BSA-PBS：取5%BSA-PBS溶液4.5ml，加入500µL山羊血清溶液，经0.22um滤膜过滤，1ml分装，于4℃冰箱中保存2天。(12)5×电泳缓冲液：分别称取Tris15.1g，甘氨酸94g和SDS5g，加入500ml超纯19 第三军医大学博士学位论文水，充分溶解后再用超纯水定容至1000ml，4℃冰箱中保存。(13)1×电转缓冲液：现用现配，分别称取Tris3.02g，甘氨酸14.42g，量取甲醇溶液200ml，加入500ml超纯水，充分溶解后再用超纯水定容至1000ml。(14)TBST溶液：现用现配，取TBS粉末一袋，溶于超纯水，定容至2000ml，再入加20%Tween溶液2ml。2.1.2.2胎盘绒毛组织块的分离及培养(1)剖宫产术中胎盘娩出5min内，迅速取胎盘母体面中央区绒毛组织6块(避开坏死及钙化区)，每一块大小约1.0cm³，置于装有无菌冰PBS液的试剂瓶中，再将试剂瓶放在冰盒内迅速带回实验室。(2)超净工作台预先经紫外灯照射30min消毒。用无菌冰PBS溶液清洗绒毛组织块4-6遍，仔细分离去除蜕膜、凝血块等，称重约200mg绒毛组织块，转移到含30ml上述DMEM/F12完全培养基的细胞培养皿中，剪至1-2mm大小，再加入25U/ml肝素以及50U/ml抑肽酶，轻轻摇匀，共8个培养皿置于37℃细胞培养箱内(5%CO2)。(3)在放入培养箱后24h、48h及72h时，分别在倒置显微镜下进行观察，并轻摇培养皿。2.1.2.3STB-EVs的分离(1)上述绒毛组织块培养72h后，吸取上清至无菌的50ml离心管内，放入低温离心机内按四步差速离心法进行：第一步以1000g离心20分钟，在超净台内小心吸取上清液并转移到另一个无菌的50ml离心管内，丢弃底部沉淀及距沉淀1.5cm的上清液。(2)第二步离心：将步骤(1)得到的上清液以10000g离心20min，再吸取上清液并转移到无菌超速离心管内(容积约33ml/管)，丢弃底部沉淀及距沉淀1.5cm处的上清液。(3)第三部离心：将步骤(2)得到的上清液以100000g离心60min，留取2ml上清液用于检测有无污染，尽量吸净剩余的上清液，底部乳白色沉淀用无菌冰PBS溶液(经0.22um滤膜过滤)重悬后转移到无菌超速离心管内。(4)第四步离心：将步骤(3)得到的无菌冰PBS重悬液再以100000g离心60min，吸净上清，底部乳白色沉淀再用300µL无菌冰PBS(经0.22um过滤)溶液重悬，将各个超速离心管内的悬液合并、混匀，500µL/管共分装2管，剩余按100µL/管分装，标记清楚，封口膜封口后于-80℃冰箱中保存备用。2.1.2.4STB-EVs的扫描电镜检查(1)取STB-EVs悬液100µL，加入等体积2.5%戊二醛，充分混匀后置于4℃冰箱固定2小时。20 第三军医大学博士学位论文(2)用95%酒精预处理云母片，待其完全干燥后，取10µL步骤(1)中STB-EVs与戊二醛的混悬液滴至云母片上，待其自然风干。(3)步骤(2)的云母片干燥后，进行抽真空、镀金等处理。(4)扫描电镜上机观察。2.1.2.5STB-EVs的免疫电镜检查(1)取STB-EVs悬液100µL，加入等体积4%多聚甲醛，充分混匀，4℃固定20min。(2)取20µL上述STB-EVs与多聚甲醛混合悬液滴在石蜡封口膜上，将200目镍网支持膜面反扣、覆盖在液滴上，覆盖好置于干燥环境中20min，使膜充分吸附。(3)取100µLPBS液滴在石蜡封口膜上，用干净的眼科镊将镍网依次在各个PBS液滴间转移，每次清洗3min，共清洗3次。注意：保持膜吸附面的镍网湿润，反面干燥。(4)镍网膜吸附面朝下，依次覆盖于100µLPBS/50mM甘氨酸中液滴表面，每次清洗3min，共清洗4次。(5)镍网膜吸附面朝下，覆盖在100µL10%山羊血清-5%BSA-PBS封闭液液滴上，室温封闭10min。(6)用抗体稀释液(1%BSA-PBS)稀释一抗(NDOG1,1:10)，眼科镊将镍载网转移、覆盖至20µL含一抗的稀释液滴表面，4℃孵育60min。(7)镍网膜吸附面朝下，依次覆盖在100µL洗涤液(0.1%BSA-PBS)液滴表面，每次清洗3min，共6次。(8)镍网依次覆盖于100µL0.5%BSA-PBS封闭液滴表面，每次3min，共6次。(9)用抗体稀释液(1%BSA-PBS)1:100稀释山羊抗小鼠胶体金二抗，镍网转移、覆盖到20µL含二抗的稀释液表面，4℃孵育30min，避免37℃孵育。对照组镍网膜面向下，覆盖在1%BSA-PBS抗体稀释液表面，4℃孵育30min。(10)镍网依次覆盖在100µLPBS液滴表面，每次清洗2min，共8次。(11)镍网于50µL2.5%戊二醛中固定5min，利用稳定抗原反应。(12)镍网依次覆盖在100µL超纯水液滴表面，每次清洗2min，共8次。(13)镍网覆盖在Silverenhancesolution(1:1)工作液滴表面，室温孵育3min。(14)镍网依次覆盖在100µL超纯水液滴表面，每次清洗1min，共8次。(15)镍网于50µL饱和醋酸铀溶液中染色10min。(16)待镍网干燥，膜面朝上放置，用透射电镜观察(参数：80KV，大于65000倍)。2.1.2.6STB-EVs的蛋白提取及Westernblotting检测21 第三军医大学博士学位论文(1)取STB-EVs悬液100µL，加入100µL含1mMPMSF的RIPA裂解液中，混匀后冰上裂解30min。(2)将上述混合液置于低温离心机内，以12000g离心15min，吸取上清按100µL/管分装，-20℃冰箱中保存备用。同时留取10µL上清液用于蛋白定量。(3)BCA法蛋白浓度测定(按试剂盒操作说明进行)。(4)蛋白变性：取蛋白上清液100µL，等体积加入SDS上样缓冲液(2×)，于100℃煮沸5min，使蛋白充分变性，置于-20℃冰箱中保存备用。(5)配制10%分离胶：超纯水清洗玻璃板后晾干，固定、安装好制胶玻板。取一个干净的25ml烧杯，按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明配制10%分离胶10ml，混匀后沿玻璃板一侧缘缓慢加入4ml，避免产生气泡，再沿一侧缘缓慢加入无水乙醇压平胶面，室温下静置30min，使分离胶充分凝固。(6)配制5%积层胶：倒去分离胶面残留的无水乙醇，滤纸吸干。另取一个干净的25ml烧杯，按照说明书配制4ml浓度为5%的积层胶，小心加至凝固的分离胶上面，与制胶槽顶平行，小心放置塑料加样梳，避免产生气泡，室温下等待胶体充分凝固。若次日再电泳可用保鲜膜包裹玻璃凝胶板数层，置于4℃冰箱过夜。(7)电泳：蛋白样品热变性后迅速插入冰中冷却，或从-20℃冰箱中取出待其充分融化，瞬时离心。超纯水冲洗胶面，沿水平方向拔出梳子，将凝胶板固定在电泳槽内，加入新鲜配制的1×电泳缓冲液超过内槽平面，用25µL微量进样器加入蛋白预染marker和变性后的蛋白溶液，单个加样孔加入蛋白预染marker5µL，蛋白上样量为40ug。外槽内也加入适量的电泳液。注意在加样不同的样品之前，用超纯水充分清洗微量进样器并排净气泡。选择“恒压”电泳，先将电压设定为70V，电泳约20min，待各泳道成一条直线后调至125V，约60min，溴酚蓝指示剂距凝胶最下缘1cm处，停止电泳。(8)电转：电泳结束前30min开始准备，根据蛋白预染marker及目的条带位置裁剪PVDF膜，取少量甲醇激活PVDF膜约1min，放至超纯水中于摇床上洗脱2min，连同4张滤纸一起浸泡在新鲜配制的电转液中约25min。电泳结束后，小心撬开玻璃制胶板，将PVDF膜覆盖在相应位置，切掉多余的凝胶，并切角标记。取出凝胶，按海绵垫-两层滤纸-凝胶-PVDF膜-两层滤纸-海绵垫自下而上的顺序逐层重叠放好，用玻璃棒排净凝胶、膜及滤纸之间的气泡，固定好并按照“黑胶白膜”的顺序放置到电转移槽内，即PVDF膜位于正极侧，凝胶于负极侧，选择“恒流”电转，300mA，电转90min。22 第三军医大学博士学位论文(9)封闭：电转结束，取出PVDF膜，注意膜的蛋白面朝上，室温下凉干后置于无水乙醇中数秒，待膜成透明状立即捞起，凉至半干后放入TBST中清洗片刻，最后放至新鲜配制的含5%脱脂奶粉的TBST液中，37℃恒温振摇封闭2h。封闭和杂交都在6格抗体孵育盒中进行，每格中加入封闭液5-8ml，注意PVDF膜蛋白面朝上。(10)一抗杂交：弃掉封闭液，TBST清洗一遍，吸净孵育盒内残留的TBST液体，分别沿孵育格边缘缓慢加入含一抗的稀释液5ml，4℃摇床过夜。一抗稀释浓度：Hsp70及Tsg101为1:500；Flotillin-1为1:1000；内参β-actin为1:2000。(11)洗膜：吸出含一抗的稀释液后，用TBST漂洗3次，每次10min。(12)二抗杂交：吸净TBST液体，相应地加入含山羊抗小鼠或山羊抗兔的二抗稀释液，稀释比例均为1:2000。放入37℃水浴箱内轻摇孵育2h。(13)洗膜：吸出含二抗的稀释液，用TBST漂洗3次，每次10min。(14)化学发光检测：使用增强型化学发光试剂盒。按照说明书，取等体积的A液与B液，充分混匀，进入暗室后再滴于PVDF膜上，反应1min，将X光片对正目的条带，压平，盖紧压片盒，分别曝光30s、60s、90s及2min不等，然后放入显影液中1min-5min显影，再放至定影中约30min，清水冲洗自然晾干。(15)结果处理：放射自显影得到的X光片经Microtek4600扫描仪进行图像数字化处理，然后采用Labwork4.6图像分析软件测定各条带的积分光密度值(IOD)，以相应内参的积分光密度值为标准，测定各目的条带的相对积分光密度值(RIOD)，将3次结果的平均值作为蛋白表达的相对数值进行统计学分析。2.1.2.7统计学处理。所有数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS18.0统计学软件进行t检验。P<0.05表示差异显著。2.2实验结果2.2.1研究对象基本情况本研究选取了早发型重度子痫前期患者24例，正常妊娠妊娠妇女12例，两组妊娠持续的时间即孕龄无明显差异，孕妇的产次和年龄无明显差异。早发型重度子痫前期组孕妇的体重指数、最大收缩压及最大舒张压均显著高于正常妊娠，而婴儿出生体重和胎盘重量则显著低于正常妊娠。对于24例早发型重度子痫前期患者，选择最早获23 第三军医大学博士学位论文取的3例胎盘STB-EVs用做下一步的iTRAQ定量蛋白质组分析，后续获取的21例胎盘STB-EVs用做差异表达蛋白的验证。对于正常妊娠组而言，同样选择最早获取的3例胎盘STB-EVs用做下一步的iTRAQ定量蛋白质组分析，后续获取的9例胎盘STB-EVs用做差异表达蛋白的验证。2.2.2STB-EVs蛋白定量严格按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行实验操作，测得体外制备的胎盘STB-EVs总蛋白含量波动在1.29mg/ml至6.4mg/ml之间，平均值为3.58±1.52mg/ml(见图2-1)。图2-1STB-EVs悬液蛋白浓度2.2.3STB-EVs的扫描电镜检查结果扫描电镜下见STB-EVs呈圆形、球形、狭长型甚至不规则形，大小各异，多个囊泡聚集成团，Image-ProPlus6.0软件测得STB-EVs囊泡的直径在30nm-1700nm之间(见图2-2中A和B)。24 第三军医大学博士学位论文图2-2STB-EVs电镜检查及膜表面标志物验证2.2.4STB-EVs的免疫电镜检查结果为明确囊泡的滋养细胞来源属性，我们采用抗合体滋养细胞蛋白NDOG1作为检测指标。透射电镜下见NDOG1-胶体金颗粒结合至合体滋养细胞外囊泡上，而对照组无明显结合反应(见图2-2中C、D和E)。同时也可见囊泡呈杯状。2.2.5细胞外囊泡蛋白标志物的Westernblotting检测Westernblotting检测结果如图2-2F所示，本实验体外制备的合体滋养细胞外囊泡均有Hsp70、Tsg101及Flotillin-1蛋白的表达。25 第三军医大学博士学位论文2.3讨论关于EVs的分类、提取和检测方法缺乏绝对共识，许多实验室都有各自较为成熟[30][31]的标准和流程，归纳目前常用的EVs分离与提取方法有：(1)差速/超速离心法；(2)密度梯度分离法；(3)免疫亲和法/磁珠法；(4)商业化的外泌体提取试剂盒。差速/超速离心法最为传统与经典，也是所有制备方法的基础，可以分离得到所有类型的细胞外囊泡，经济实惠，缺点就是费时费力。密度梯度分离法操作繁琐，需特别谨慎仔细。免疫亲合法及商业化试剂盒的优势在于快速，但是只能分离某一类型的囊泡。就实用性和普及性而言，差速/超速离心法仍是当前研究采用的主流方法。STB-EVs主要有三种来源方式：血浆、胎盘和滋养细胞系培养液。外周血是获取STB-EVs最理想且最有前景的方式，然而，由于STB-EVs在外周血所占比例低、大多与内皮细胞及单核细胞等结合，难以纯化出游离的STB-EVs用于实验研究，必须经体外制备。由牛津大学Redman教授和Sargent教授带领的团队于二十世纪九十年代初就开启了STB-EVs领域的研究，早期的研究中多采用机械制备的方法分离得到胎盘[29]STB-EVs，2005年瑞士巴塞尔团队的Gupta等比较了机械法、胎盘绒毛小叶灌注法及胎盘绒毛组织块培养法三种方式制备而来的胎盘STB-EVs，提出绒毛小叶灌注法和绒毛组织块培养法是最接近于生理状态囊泡脱落的方法，牛津团队在后续的研究中[24]也证实了这一观点。故本实验用于制备胎盘合体滋养细胞外囊泡的方法可靠。不论机械法、灌注法还是培养法，后续均串联了差速/超速离心法来纯化制备STB-EVs。我们采用的四步差速/超速离心法是在前期三步离心法基础上做的修改，二者的区别在于我们最后一步使用大量PBS(约33ml/离心管)清洗、去除了蛋白质及[32]蛋白质聚集小体，进一步纯化了STB-EVs。[33,34]EVs常用的检测方法包括：流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)、阻抗式流式细胞仪(Impedance-basedflowcytometry)、原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy,AFM)、电子显微镜(ElectronMicroscopy,EM)、动态光散射技术(DynamicLightScattering,DLS)、纳米颗粒追踪技术(NanoparticleTrackingAnalysis,NTA)、生物免疫学方法(ELISA、Westernblotting等)。这些分析方法都有各自的优缺点。比如AFM和EM可以检测到非常小的颗粒，灵敏度最高，但是过程繁琐、操作难度大、需要专业人员操作，不适合高通量检测。DLS和NTA均为反射光的方法，可以检测到较小的颗粒，但是特异性较差，很难区分目标囊泡、细胞碎片或污染物，往往高估目标颗粒26 第三军医大学博士学位论文的数量，而且对于复杂样本如血液、腹水等(大小不均一)计数误差较大。ELISA等免疫性方法操作简单，适合高通量检测，但灵敏度较差，无法知道颗粒的大小、数量等信息。Westernblotting检测到囊泡表面公认的标志物也可以反应囊泡的存在。流式细胞仪操作简便、速度快，不仅可以准确计数，还能结合特异性抗体明确颗粒的来源，较适合囊泡的高通量、多参数检测(通过散射光研究囊泡大小、通过荧光检测囊泡的表面标记物)。但是流式细胞仪多用于细胞方面的检测，检测极限在300nm-500nm，用于检测直径更小的细胞外囊泡就存在一个技术上的瓶颈，无法区分小于300nm囊泡信号与背景噪音，即无法检测到直径小于300nm的细胞外囊泡，比如外泌体。近期报道英国Apogee公司的A50-Micro流式细胞仪具有高灵敏度(100nm)、高分辨率(10nm)的特点，可能更适用于细胞外囊泡研究领域，但目前已知国内仅中科院微生物所和中国计量科学院各拥有一台。本实验选择扫描电镜、免疫电镜和Westernblotting从形态学及囊泡的表面标记物等方面来验证体外制备的STB-EVs，结果表明本实验获得的STB-EVs大小在30nm-1700nm之间，呈圆形、球形、狭长型、杯形甚至不规[9]则形，大小各异，多个囊泡聚集成团，符合文献报道的STB-EVs形态学特征。Westernblotting验证了STB-EVs中Hsp70、Tsg101及Flotillin-1蛋白的表达，这些蛋白是公认的囊泡表面标志性蛋白，检测到这些囊泡相关蛋白能够正确反应囊泡的存在。免疫电镜进一步验证了STB-EVs的滋养细胞来源特性。2.4小结综上所述，我们通过胎盘绒毛组织块培养法结合四步差速/超速离心法成功分离得到合体滋养细胞外囊泡。扫描电镜和免疫电镜显示STB-EVs呈圆形、球形、狭长型、杯形甚至不规则形，大小各异，多个囊泡聚集成团，囊泡大小在30nm-1700nm之间，与文献报道相吻合。免疫电镜证实了STB-EVs的滋养细胞来源特性。Westernblotting检测表明STB-EVs中存在Hsp70、Tsg101及Flotillin-1等囊泡标志蛋白。本部分实验表明我们采用胎盘绒毛组织块培养法结合四步差速/超速离心法从胎盘中分离STB-EVs的技术可行，为下一步进行STB-EVs的蛋白组学研究提供了重要保障。27 第三军医大学博士学位论文第三章早发型重度子痫前期STB-EVs的差异蛋白组研究1994年澳大利亚科学家Wilkins和Williams首次提出蛋白质组(protemoe)的概念，指基因组表达的所有蛋白质，且蛋白质的种类和数量随时间、地点和环境条件而变化，故蛋白质组是一个动态的概念。蛋白质组学主要的研究方向包括表达蛋白质组学、比较蛋白质组学、蛋白质互作组学及蛋白质翻译后修饰，差异蛋白质组学是比较蛋白质组学的一个分支。定量蛋白质组学是蛋白质研究的前沿学科，目的是将某个基因组表达的全部蛋白质或某个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。本研究运用8标iTRAQ串联质谱技术分析早发型重度子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘合体滋养细胞外囊泡的差异蛋白表达情况，对鉴定到的差异蛋白进行GO功能注释、KEGG通路注释、进一步GO功能富集、KEGG通路富集以及蛋白质间相互作用分析，为了检验选取到差异表达蛋白质和特征差异表达蛋白质的合理性和准确性，利用筛选出的蛋白表达量，对各组样本进行层次聚类。为验证iTRAQ定量分析的结果，采用Westernblotting的方法对选取的差异表达蛋白进行分析。3.1材料与方法3.1.1实验材料本章iTRAQ定量部分实验材料来源于第二章部分最初获得的3例早发型重度子痫前期以及3例正常妊娠组妇女胎盘合体滋养细胞外囊泡，共6例临床样本。iTRAQ结果验证部分，在前期6例临床样本的基础上再纳入了30例，共36例，分别为24例早发型重度子痫前期以及12例正常妊娠组胎盘合体滋养细胞外囊泡。3.1.1.1实验主要仪器(1)Q-Exactive质谱仪：美国ThermoFinnigan公司(2)AKTAPurifier100纯化仪：美国GEHealthcare公司(3)低温高速离心机：德国Eppendorf公司(4)可见紫外分光光度计：中国上海尤尼柯仪器有限公司(5)真空离心浓缩仪：德国Eppendorf公司(6)600V电泳仪：美国GEHealthcare公司(7)EasynLC色谱系统：美国ThermoScientific公司28 第三军医大学博士学位论文(8)MultiskcanFC酶标仪：美国ThermoScientific公司(9)MPFastprep-24匀浆仪：美国MPBiomedicals公司(10)超声破碎仪：中国宁波新芝生物公司(11)Votex振荡器：中国上海琪特分析仪器公司(12)精密电子天平：瑞士MettlerToledo公司(13)超净工作台：中国苏州安泰空气技术有限公司(14)电泳槽及电泳仪：美国Bio-Rad公司(15)PVDF膜：美国Millipore公司3.1.1.2实验主要试剂(1)甘油：中国上海生工生物公司(2)溴酚蓝：中国上海生工生物公司(3)SDS：美国Bio-Rad公司(4)尿素：美国Bio-Rad公司(5)Trisbase：美国Bio-Rad公司(6)二硫苏糖醇(DTT)：美国Bio-Rad公司(7)碘乙酰胺(IAA)：美国Bio-Rad公司(8)KH2PO4：中国上海国药公司(9)KCl：中国上海国药公司(10)HCl：中国上海国药公司(11)NH4HCO3：美国Sigma公司(12)iTRAQReagent-8plexMultiplexKit：美国ABSCIEX公司(13)乙腈(ACN)：德国Merck公司(14)10kd超滤离心管：德国Sartorius(15)C18Cartridge：美国Sigma公司(16)溶解液：美国ABSCIEX公司(17)BCA定量试剂盒：中国上海碧云天生物技术公司(18)SDS-PAGE凝胶配制盒：中国上海碧云天生物技术公司(19)牛血清白蛋白：美国Sigma公司(20)胰酶(Trypsin)：美国Sigma公司(21)甲酸(FA)：美国SigmaFluka公司(22)三氟乙酸(TFA)：美国Sigma公司29 第三军医大学博士学位论文(23)MultipleAffinityRemovalLCColumn：美国Agilent公司(24)SCX色谱柱：Polysulfoethyl4.6×100mmcolumn(5μm，200Å)，美国PolyLC公司(25)C18上样柱：AcclaimPepMap100,100μm*2cm,nanoViperC18,3μm,100Å，美国ThermoScientific公司(26)C18分析柱：EASYcolumn,10cm,ID75μm,3μm,C18-A2，美国Thermoscientific公司(27)兔抗人S100-A8单克隆抗体：美国Abcam公司(28)兔抗人Siglec-6多克隆抗体：美国Abcam公司(29)兔抗人CD63多克隆抗体：美国Abcam公司(30)兔抗人Calnexin单克隆抗体：美国CellSignaling公司(31)ECL化学发光底物试剂盒：美国Pierce公司(32)山羊抗兔IgG：美国Pierce公司(33)RIPA裂解液：中国上海碧云天生物技术公司(34)蛋白预染Marker：美国Pierce公司(35)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2×)：中国上海碧云天生物技术公司3.1.1.3主要溶液配制(1)UA缓冲液：150mMTris-HCl，8M尿素，pH8.0(2)SDT裂解液：100mMTris-HCl，4%SDS，1mMDTT，pH7.6(3)SCX缓冲液A：10mMKH2PO4pH3.0，25%ACN(4)SCX缓冲液B：10mMKH2PO4pH3.0，500mMKCl，25%CAN(5)HPLC流动相A：0.1%FA(6)HPLC流动相B：0.1%FA,84%ACN3.1.1.4主要分析软件(1)ProteomeDiscoverer1.4：美国ThermoScientific公司(2)MASCOT2.2：英国MatrixScience公司(3)Labwork4.6：美国UVP公司(4)GraphPadPrism5.0：美国GraphPad公司3.1.2实验方法3.1.2.1样品分组(1)正常妊娠组(A组)：三例正常妊娠妇女胎盘STB-EVs，分别编号为A1，A2，30 第三军医大学博士学位论文A3，A4，其中，A2和A4来自于同一个研究对象。(2)早发型重度子痫前期组(B组)：三例早发型重度子痫前期患者胎盘STB-EVs，分别编号为B1，B2，B3，B4，其中B1和B3来自同一个研究对象。注：上述分组针对iTRAQ定量分析研究，而Westernblotting部分的实验分组参照表2-1下半部分，即早发型重度子痫前期组纳入24例，正常妊娠组纳入12例临床样本。3.1.2.2蛋白提取：(1)取STB-EVs悬液，加入等体积SDT裂解液，超声(80W，工作10s)，沸水煮15min。(2)将上述混合液置于低温离心机内，以14000g离心45min，吸取上清，分装后于-80℃保存。每一个样品留取10µL用于总蛋白定量。注：以上步骤提取的蛋白用于iTRAQ定量分析部分的实验研究，而用于Westernblotting的蛋白提取方法参照2.1.2.6的步骤(1)及(2)。3.1.2.3蛋白定量BCA法蛋白浓度测定(按试剂盒操作说明进行)。3.1.2.4SDS-PAGE电泳(1)蛋白变性：各样品取蛋白质20µg，加入等体积蛋白上样缓冲液(2×)，混匀，100℃煮沸5min，14000g离心10min，取上清备用。(2)配制12.5%分离胶：超纯水清洗玻璃板后晾干，固定、安装好制胶玻板。取一个干净的25ml烧杯，按照表3-1的方法配制12.5%分离胶，混匀后沿玻璃板一侧缘缓慢加入4ml，避免产生气泡，再沿一侧缘缓慢加入无水乙醇压平胶面，室温下静置30min，使分离胶充分凝固。表3-112.5%分离胶配制试剂体积超纯水3.34ml1MTris，pH8.82.5ml30%Acr-Bis(29:1)4.16ml10%SDS0.1ml10%AP0.1mlTEMED0.12ml31 第三军医大学博士学位论文(3)配制5%积层胶：倒去分离胶面残留的无水乙醇，超纯水冲洗胶面2次，滤纸吸干。另取一个干净的25ml烧杯，按照说明书配制4ml浓度为5%的积层胶，小心加至凝固的分离胶上面，与制胶槽顶平行，小心放置塑料加样梳，避免产生气泡，室温下等待胶体充分凝固。(4)电泳：超纯水冲洗胶面，沿水平方向拔出梳子，将凝胶板固定在电泳槽内，加入新鲜配制的1×电泳缓冲液超过内槽平面，用25µL微量进样器加入蛋白预染marker和变性后的蛋白溶液，单个加样孔加入蛋白marker5µL，将步骤(1)中各样品蛋白进行上样，注意标记上样顺序。外槽内也加入适量的电泳液。注意在加样不同的样品之前，用超纯水充分清洗微量进样器并排净气泡。选择“恒流”电泳，14mA，电泳约90min，溴酚蓝指示剂距凝胶最下缘1cm处，停止电泳。(5)染色：取出凝胶，用考马斯亮蓝R-250染色。注：上述步骤是iTRAQ定量分析实验中，蛋白酶解前的质控实验。后期的Westernblotting验证的实验方法参考2.1.2.6，略有不同的步骤如下：(1)配制10%分离胶(Calnexin,Siglec-6)或15%分离胶(S100-A8,CD63)。(2)一抗杂交稀释的比例：Siglec-6(1:800)，Calnexin(1:1000)，CD63(1:800)，S100-A8(1:2000)。(3)二抗杂交均为山羊抗兔。3.1.2.5蛋白质酶解和iTRAQ标记(1)酶解：本实验共8个样品，每个样品各取300μg，分别加入DTT至终浓度为100mM，100℃煮沸5min，冷却至室温。加入200μLUA缓冲液混匀后再转到10kd超滤离心管，将超滤管放入离心机内固定好，以14000g离心15min。取出离心管，加入200μlUA缓冲液后再放到离心机中，再次以14000g离心15min，充分吸弃滤液。加入100μLIAA(50mMIAA溶于UA溶液)，以600rpm的速度振荡1min，室温条件下避光孵育30min，14000g离心10min。加入100µLUA缓冲液，14000g离心10min，该操作重复2次。加入100μL溶解液，14000g离心10min，该操作重复2次。加入40μl胰酶缓冲液(5μg胰酶溶于40μL溶解液中)，以600rpm的速度振荡1min，37℃孵育16-18h。更换新的收集管，14000g离心10min，取滤液，OD280肽段定量。(2)肽段标记：每份样品分别取约50μg,按照美国AB公司8标iTRAQ试剂盒说明书进行标记。具体标记方法见表3-2。A组为正常妊娠组，A1、A2、A3为三个不同研究对象的胎盘经体外制备而产生的STB-EVs，A4和A2来自同一个研究对象。B组为早发型重度子痫前期组，B1、B2、B4为三个早发型重度子痫前期患者的胎盘经体32 第三军医大学博士学位论文外制备产生的STB-EVs，B3和B1为同一个研究对象。表3-2样品标记样本编号A1A2A3A4B1B2B3B41131141151161171181191213.1.2.6强阳离子柱(SCX)分离将每组标记后的肽段混合，采用Polysulfoethyl4.6×100mmcolumn(5μm，200Å)SCX色谱柱，用AKTAPurifier100按表3-3进行SCX分级。缓冲液A液为10mMKH2PO4,25%ACN,pH3.0，B液为10mMKH2PO4,500mMKCl,25%ACN,pH3.0。色谱柱以A液平衡，样品由进样器上样到色谱柱进行分离，流速均为1000µL/min。液相梯度如下：0min-32min，B液线性梯度从0%-10%；32min-47min，B液线性梯度从10%-45%；47min-52min，B液线性梯度从45%-100%；52min-60min，B液维持在100%；60min以后，B液重置为0%。表3-3SCX分级%A%B0.00100025.00100025.01100032.00901032.01901042.00802042.01802047.00554547.01554552.00010060.00010060.01100075.00100033 第三军医大学博士学位论文洗脱过程中监测214nm的吸光度值，每隔1min收集洗脱组分，总共收集30份。根据SCX色谱图将每组样品合并为8份，分别冻干后采用C18Cartridge脱盐，具体步骤如下：(1)取酶切后样品，用0.1%TFA水溶液调节pH≤3，总体积≤3mL，肽段总量≤100μg。(2)活化：在C18Cartridge柱中加入1mL甲醇，真空低压下通过。(3)老化：在C18Cartridge柱中加入1mL70%ACN0.1%TFA水溶液，真空低压下通过。(4)平衡：在C18Cartridge柱中加入1mL0.1%TFA水溶液，真空低压下通过。此步骤重复3次。(5)上样：将上述稀释后样品加入至C18Cartridge柱中，真空低压缓慢通过，收集穿流液。(6)脱盐：在C18Cartridge柱中加入0.5mL0.1%TFA水溶液，真空低压下通过。此步骤重复2次。(7)洗脱：在C18Cartridge柱中加入0.5ml70%ACN0.1%TFA水溶液，真空低压下缓慢通过，收集洗脱液。此步骤重复2次。洗脱液放入真空离心浓缩仪中进行离心干燥。3.1.2.7毛细管高效液相色谱分离配制缓冲液体系：0.1%甲酸水溶液(A液)；0.1%甲酸乙腈水溶液(B液，其中乙腈为84%)。取3.1.2.6得到的8分样品，每一份均采用纳升流速HPLC液相系统EasynLC进行分离。色谱柱以95%的缓冲液A液平衡。首先，通过自动进样器将样品注射到上样柱(ThermoScientificAcclaimPepMap100,100μm×2cm,nanoViperC18)，然后再经过分析柱(ThermoscientificEASYcolumn,10cm,ID75μm,3μm,C18-A2)分离，流速为250nL/min。采用2小时液相洗脱：0min-100min，B液线性梯度从0%到35%；100min-108min，B液线性梯度从35%到100%；108min-120min，B液维持在100%。见表3-4。表3-4液相洗脱梯度时间(min)B%流速(nL/min)0.000250100.0035250108.00100250120.0010025034 第三军医大学博士学位论文3.1.2.8质谱鉴定经毛细管高效液相色谱分离后得到的每一份样品再进行质谱分析(Q-Exactive质谱仪，ThermoFinnigan)。相关参数如下：(1)检测方式：正离子；(2)分析时间：120min；(3)母离子扫描范围：300-1800m/z；(4)一级质谱分辨率：70000at200m/z；(5)一级MaximumIT：10ms；(6)AGCtarget：3e6；(7)动态排出：40.0s；(8)Numberofscanranges：1。按照下列方法采集多肽及其碎片的质荷比：每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS2scan)，MS2ActivationType为HCD，相关参数设置为：(1)二级质谱分辨率：17500at200m/z；(2)Isolationwindow：2m/z；(3)Microscans：1；(4)二级MaximumIT：60ms；(5)NormalizedCollisionEnergy：30eV；(6)Underfill：0.1%。3.1.2.9数据分析上述实验过程得到的质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Mascot2.2和ProteomeDiscoverer1.4进行查库鉴定及定量分析。相关参数见表3-5。表3-5数据搜库及定量分析参数ItemValueEnzymeTrypsinMaxMissedCleavages2FixedmodificationsCarbamidomethyl(C),iTRAQ8plex(N-term),iTRAQ8plex(K)VariablemodificationsOxidation(M),iTRAQ8plex(Y)PeptideMassTolerance±20ppmFragmentMassTolerance0.1DaDatabaseuniprot_human_134919_20140120.fastaDatabasepatternDecoyPeptideFDR≤0.01ProteinQuantificationusethemedianofonlyuniquepeptidesExperimentalBiasNormalizeOnProteinMedian3.1.2.10生物信息学分析将原始数据中质谱定量到的蛋白质以Ratio>1.2且Pvalue<0.05为标准筛选出差异表达蛋白质，利用GeneOntology数据库(http://geneontology.org/)对这些差异表达蛋白35 第三军医大学博士学位论文进行GO功能注释；利用KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)对差异蛋白进行通路分析。进一步以质谱定量的全蛋白为背景，通过Fisher精确检验找出差异蛋白质显著富集的GO功能条目或KEGG通路。通过查询STRING数据库(http://string.embl.de/)，确定差异表达蛋白之间的相互作用和与之直接作用的其他蛋白质，并利用CytoScape5软件生成相互作用网络。利用WEKA软件包中的informationgainattributeevaluator和correlation-basedfeatureselection(CFS)算法，结合蛋白质的表达倍数差异比(Ratio>1.2)，进行特征差异表达蛋白质选取(FeatureSelection)。利用Cluster3.0软件分析所选取的差异蛋白或经FeatureSelection筛选的特征差异蛋白的合理性和准确性。3.1.2.11统计学处理。用均数±标准差(x±s)的方式来表示实验数据，采用SPSS18.0统计学软件进行t检验分析。P<0.05表示差异显著。iTRAQ实验部分，差异蛋白质筛选的标准为：Ratio>1.2且Pvalue<0.05。3.2实验结果3.2.1蛋白质浓度的测定拟行iTRAQ定量分析的8个样品经SDT裂解后，BCA法测定的蛋白浓度见表3-6。Westernblotting验证部分的蛋白定量见2.2.2。表3-6样品的总蛋白定量样本编号A1A2A3A4B1B2B3B4浓度(mg/ml)56.15.75.94.26.45.34.93.2.2iTRAQ定量实验部分SDS-PAGE电泳结果拟行iTRAQ定量分析的8个样品经SDS-PAGE电泳分离，从考马斯亮蓝染色结果可以知道，各样品条带分离清晰，样品之间平行性较好。见图3-1。36 第三军医大学博士学位论文图3-1样品的SDS-PAGE电泳图3.2.3强阳离子柱分离结果iTRAQ标记后混合肽段经强阳离子柱分离，图3-2为相关的色谱图。图3-2SCX色谱图37 第三军医大学博士学位论文3.2.4蛋白质鉴定及定量结果SCX分级并脱盐后的8个fraction经质谱分析及Mascot查库。结果合并后以PeptideFDR≤0.01筛选过滤。本实验部分共鉴定出18533个唯一肽段和3317个蛋白质，8个通道均有定量信息的蛋白有3292个，iTRAQ标记率为99.25%。3.2.5显著性差异蛋白质的鉴定结果本实验中差异蛋白的选取标准同时满足：(1)肽段≥1；(2)FDR≤1%；(3)比值≥1.2或≤0.833。结果表明，与正常妊娠组胎盘合体滋养细胞外囊泡相比，早发型重度子痫前期组共鉴定194个差异表达的蛋白，其中122个表达上调，72个表达下调，唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素6(sialicacid-bindingIg-likelectin6，Siglec-6)上调最为显著(见表3-7)。表3-7早发型重度子痫前期组与正常妊娠组比较上调≥1.2或下调≤0.833的差异蛋白AccessionProteinnameFoldchange上调O43699Sialicacid-bindingIg-likelectin64.091B2R4V4cDNA,FLJ92232,highlysimilartoHomosapiensbarriertoautointegration1.752factor1P80723Brainacidsolubleprotein11.724D3DP46Signalpeptidasecomplexsubunit3homolog(S.cerevisiae),isoformCRA_a1.701M0R1G9Pregnancy-specificbeta-1-glycoprotein51.693C9J5Z8Signalrecognitionparticlereceptorsubunitbeta(Fragment)1.689Q96NY8Poliovirusreceptor-relatedprotein41.681E1NZ88UbiquitouslytranscribedtetratricopeptiderepeatproteinY-linkedtranscript1.641variant5B3KUB6cDNAFLJ39529fis,clonePUAEN2004067,highlysimilartoBand4.1-like1.639protein1Q99856AT-richinteractivedomain-containingprotein3A1.618P27824Calnexin1.615Q5T9B9Endoglin1.61538 第三军医大学博士学位论文Q99735MicrosomalglutathioneS-transferase21.587Q14213Interleukin-27subunitbeta1.584Q9BXP8Pappalysin-21.582D3DVF0F11receptor,isoformCRA_a1.551Q5T8U5Surfeit41.551A2RRB5IRX5protein1.548B4DX70cDNAFLJ58334,highlysimilartoZincfingerMYNDdomain-containing1.548protein12E9PS11ProteinYIF1A1.539Q9NZ01Very-long-chainenoyl-CoAreductase1.531B7Z653cDNAFLJ61657,highlysimilartoBand4.1-likeprotein11.526S4R3N9Sideroflexin-31.525P05108Cholesterolside-chaincleavageenzyme,mitochondrial1.520P46977Dolichyl-diphosphooligosaccharide-proteinglycosyltransferasesubunit1.520STT3AH0YNX5SignalpeptidasecomplexcatalyticsubunitSEC11A(Fragment)1.517B7ZKY6Membranemetallo-endopeptidase1.512Q96A33Coiled-coildomain-containingprotein471.493P12236ADP/ATPtranslocase31.472P10109Adrenodoxin,mitochondrial1.468P39656Dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferase48kDa1.468subunitP50570Dynamin-21.456Q6ZUJ8Phosphoinositide3-kinaseadapterprotein11.436Q15404Rassuppressorprotein11.435O43295SLIT-ROBORhoGTPase-activatingprotein31.430P04843Dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferasesubunit11.429P05109ProteinS100-A81.426P05141ADP/ATPtranslocase21.424H0YMU3Isocitratedehydrogenase[NAD]subunitalpha,mitochondrial(Fragment)1.42139 第三军医大学博士学位论文P20645Cation-dependentmannose-6-phosphatereceptor1.417B3KMK8cDNAFLJ11293fis,clonePLACE1009670,highlysimilartoGenethonin-11.410P37235Hippocalcin-likeprotein11.4096H9E7B8Cytochromecoxidasesubunit2(Fragment)1.403H0Y8X1Succinatedehydrogenase[ubiquinone]flavoproteinsubunit,mitochondrial1.393(Fragment)B3KNL8cDNAFLJ14908fis,clonePLACE1005953,highlysimilarto1.392Alpha-1,3-mannosyltransferaseALG2Q0QEN7ATPsynthasesubunitbeta(Fragment)1.377B3KW38cDNAFLJ42082fis,cloneTCERX2000171,highlysimilartoCLAUDIN-41.369Q59EU6EFhanddomainfamily,memberD1variant(Fragment)1.368F8W8J4Myoferlin1.364P50479PDZandLIMdomainprotein41.362P21397Amineoxidase[flavin-containing]A1.358Q13011Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoyl-CoAisomerase,mitochondrial1.357P140603beta-hydroxysteroiddehydrogenase/Delta5-->4-isomerasetype11.354Q8TCT9MinorhistocompatibilityantigenH131.351H3BUR9CDP-diacylglycerol--inositol3-phosphatidyltransferase1.351Q8TCJ2Dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferasesubunit1.343STT3BP13674Prolyl4-hydroxylasesubunitalpha-11.340Q997143-hydroxyacyl-CoAdehydrogenasetype-21.336F5GXX5Dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferasesubunit1.333DAD1F5GXS0C4b-B1.328Q92896Golgiapparatusprotein11.328E9PN17ATPsynthasesubunitg,mitochondrial1.323B2RE46cDNA,FLJ96923,highlysimilartoHomosapiensribophorinII(RPN2),1.319mRNAB4E1K7Stomatin-likeprotein21.31640 第三军医大学博士学位论文Q13641Trophoblastglycoprotein1.315E9PH29Thioredoxin-dependentperoxidereductase,mitochondrial1.315Q86YN1Dolichyldiphosphatase11.314B0QZ43ERlipidraftassociated1(Fragment)1.296P30049ATPsynthasesubunitdelta,mitochondrial1.294H7C1G6Autophagy-relatedprotein9A(Fragment)1.292F5H608ATPsynthasesubunitd,mitochondrial1.287Q07065Cytoskeleton-associatedprotein41.285O43818U3smallnucleolarRNA-interactingprotein21.283K7ENU5ProteinHookhomolog2(Fragment)1.282Q1WWL2PTGFRNprotein(Fragment)1.280Q9UHQ9NADH-cytochromeb5reductase11.280P25705ATPsynthasesubunitalpha,mitochondrial1.276O00264Membrane-associatedprogesteronereceptorcomponent11.272P36957Dihydrolipoyllysine-residuesuccinyltransferasecomponentof1.2662-oxoglutaratedehydrogenasecomplex,mitochondrialF5H1S8Malectin(Fragment)1.266C9J3L8Translocon-associatedproteinsubunitalpha1.266H7C0X4Dol-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-Dolalpha-1,3-mannosyltransferase1.265(Fragment)P54709Sodium/potassium-transportingATPasesubunitbeta-31.259O00139Kinesin-likeproteinKIF2A1.259B4DWS6cDNAFLJ61181,highlysimilartoHomosapienshydroxysteroid(17-beta)1.259dehydrogenase12(HSD17B12),mRNAP16435NADPH--cytochromeP450reductase1.2589P51571Translocon-associatedproteinsubunitdelta]1.2579K7ELD9Synaptogyrin-21.256P45880Voltage-dependentanion-selectivechannelprotein21.250P319373-hydroxyisobutyratedehydrogenase,mitochondrial1.250P56385ATPsynthasesubunite,mitochondrial1.24941 第三军医大学博士学位论文Q8NFV4Alpha/betahydrolasedomain-containingprotein111.245L0R6Q1AlternativeproteinSLC35A41.241B4DUL5cDNAFLJ51625,highlysimilartoUbiquinol-cytochrome-creductase1.240complexcoreproteinI,mitochondrial(EC1.10.2.2)Q9BSV4SFPQprotein(Fragment)1.240F5H0J3NADHdehydrogenase[ubiquinone]1alphasubcomplexsubunit9,1.238mitochondrialB4DLQ2cDNAFLJ57320,highlysimilartoDihydrolipoyllysine-residue1.237acetyltransferasecomponentofpyruvatedehydrogenasecomplex,mitochondrial(EC2.3.1.12)Q96SW8cDNAFLJ14589fis,cloneNT2RM4001876,weaklysimilartoRAS1.236SUPPRESSORPROTEIN1O15173Membrane-associatedprogesteronereceptorcomponent21.233P48047ATPsynthasesubunitO,mitochondrial1.232P83105SerineproteaseHTRA41.232Q9NUV7Serinepalmitoyltransferase31.231F5H8012-oxoglutaratedehydrogenase,mitochondrial1.230P50453SerpinB91.224P55735ProteinSEC13homolog1.224B4DFE6cDNAFLJ59861,highlysimilartoATPsynthasegammachain,1.220mitochondrial(EC3.6.3.14)B7Z6C9cDNAFLJ61658,highlysimilartoTransmembrane9superfamilyprotein1.220member1B3KN05cDNAFLJ13129fis,cloneNT2RP3002969,highlysimilarto1.219Long-chain-fatty-acid--CoAligase3(EC6.2.1.3)B4DZ53cDNAFLJ59643,highlysimilartoNeutralalpha-glucosidaseAB1.219B7Z361cDNAFLJ50772,highlysimilartoReticulon-31.219E5RHW4Erlin-2(Fragment)1.213C9J0K6Sorcin1.212Q9UF24PutativeuncharacterizedproteinDKFZp586K0821(Fragment)1.21242 第三军医大学博士学位论文F8VNT9CD63antigen(Fragment)1.211M0QXI2Zincfingerprotein43(Fragment)1.209Q09666Neuroblastdifferentiation-associatedproteinAHNAK1.209Q5TF55Aldehydedehydrogenase4family,memberA1(Fragment)1.208B4DWJ7cDNAFLJ549681.207F8W9W8Solutecarrierorganicaniontransporterfamilymember2A11.205A8K6G4cDNAFLJ775641.202B4DJ89Polymerase(RNA)II(DNAdirected)polypeptideE,25kDa,isoformCRA_c1.200Q86U42Polyadenylate-bindingprotein21.200下调B4DWN0cDNAFLJ51351,highlysimilartoGTPase,IMAPfamilymember40.831F5H3Q6Epidermalgrowthfactorreceptorkinasesubstrate8(Fragment)0.826B3KNN3cDNAFLJ30033fis,clone3NB692001433,highlysimilartoHEAT0.825repeat-containingprotein2B2R5M8Isocitratedehydrogenase[NADP]0.825E7EMW7E3ubiquitin-proteinligaseUBR50.823E9PLW6L-aminoadipate-semialdehydedehydrogenase-phosphopantetheinyl0.820transferase(Fragment)Q9P0N4HSPC2450.8182H0YCP8Poly(U)-binding-splicingfactorPUF60(Fragment)0.818Q96PY5Formin-likeprotein20.817F5H1R9Alpha-parvin0.817Q9NZN3EHdomain-containingprotein30.815G3V288Prostaglandinreductase2(Fragment)0.814B7Z821DNAmismatchrepairproteinMlh10.812P18085ADP-ribosylationfactor40.811H0YB56ProteinLYRIC(Fragment)0.810P01243Chorionicsomatomammotropinhormone0.808I7GPQ7cDNAFLJ757930.807Q96RF0Sortingnexin-180.804F8WES2S-methyl-5'-thioadenosinephosphorylase0.80243 第三军医大学博士学位论文I6L9B1EPB41L2protein0.802B3KY04cDNAFLJ46506fis,cloneTHYMU3030752,highlysimilartoBTB/POZ0.800domain-containingproteinKCTD12D3DP16Fibrinogengammachain,isoformCRA_a0.798Q5JR08Rashomologgenefamily,memberC(Fragment)0.799P42574Caspase-30.799P01834IgkappachainCregion0.798E7ES35Tetratricopeptiderepeatprotein380.797F5H4U8COP9signalosomecomplexsubunit7a(Fragment)0.796P01860Iggamma-3chainCregion0.796B2R602cDNA,FLJ92709,highlysimilartoHomosapiensLanClantibiotic0.787synthetasecomponentC-like1(bacterial)(LANCL1),mRNAP26038Moesin0.785Q0ZCH9Immunglobulinheavychainvariableregion(Fragment)0.784Q6PCE3Glucose1,6-bisphosphatesynthase0.783A8K6K9cDNAFLJ76306,highlysimilartoHomosapienshepatocytegrowthfactor0.776(hepapoietinA;scatterfactor)(HGF),mRNAQ9HAV0Guaninenucleotide-bindingproteinsubunitbeta-40.772P11047Lamininsubunitgamma-10.771P28838Cytosolaminopeptidase0.768B4DLR4Heatshock70kDaprotein12B0.765Q16186ProteasomalubiquitinreceptorADRM10.764B4E2D2cDNAFLJ58874,highlysimilartoCaspase-4(EC3.4.22.-)0.763Q59EI4CopineIvariant(Fragment)0.763P01857Iggamma-1chainCregion0.750S6BAN6IgGLchain0.749P05543Thyroxine-bindingglobulin0.745H3BRY5Sulfotransferase1A1(Fragment)0.730Q6NXR6Histone-lysineN-methyltransferasesetd30.729B4DPQ4cDNAFLJ60769,highlysimilartoInter-alpha-trypsininhibitorheavychain0.726H3Q9ULE6Paladin0.72344 第三军医大学博士学位论文P31146Coronin-1A0.722F8WAS2Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH10.721B3KVG9cDNAFLJ16538fis,cloneOCBBF2033295,highlysimilartoProtein0.720neurobeachinF6M9T7Indolamine2,3dioxygenase0.698P51884Lumican0.690A8K2T4cDNAFLJ78207,highlysimilartoHumancomplementproteincomponent0.681C7mRNAP02794Ferritinheavychain0.673F5H163Mevalonatekinase0.661Q9C0G0Zincfingerprotein4070.653P01859Iggamma-2chainCregion0.618H3BQT6Tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype9(Fragment)0.613H0Y2Q8Doublecortindomain-containingprotein5(Fragment)0.609O95714E3ubiquitin-proteinligaseHERC20.604B4DVN4cDNAFLJ61425,highlysimilartoFYVE,RhoGEFandPH0.573domain-containingprotein2P02768Serumalbumin0.572Q05CF5CFHR5protein(Fragment)0.530Q494V2Coiled-coildomain-containingprotein370.526B4DUP1cDNAFLJ57602,highlysimilartoCreatinekinaseM-type(EC2.7.3.2)0.525P02792Ferritinlightchain0.509P02765Alpha-2-HS-glycoprotein0.498Q96BJ8Engulfmentandcellmotilityprotein30.482M0R009Alpha-1B-glycoprotein(Fragment)0.444A5PKX9INADLprotein0.433Q8N5N6ARSJprotein0.386Q49AK0LTA4Hprotein0.32645 第三军医大学博士学位论文3.2.6生物信息学分析结果对于差异表达的194个蛋白进行GO分析，共189个蛋白获得1624条GO功能条目注释，分别参与了17种生物过程、涉及11种分子功能类型和10种细胞组成。如图3-3A所示，这些差异表达蛋白的参与的细胞组成主要为细胞、细胞器、细胞膜、大分子复合物、膜性细胞腔和细胞外区等，大部分的差异蛋白是分泌型蛋白。图3-3B显示这些差异表达蛋白参与的生物过程类型，主要包括细胞过程、单有机体过程、代谢过程、生物调控和刺激应答反应等。差异表达蛋白涉及的分子功能类型主要包括绑定、催化活性、转运蛋白活性和酶调节活性(图3-3C)。进一步的GO功能富集显示线粒体、跨膜转运和跨膜转运蛋白活性分别是细胞组成、生物过程和分子功能中富集最多的类型(图3-3D)。此外，在早发型重度子痫前期组差异表达上调的蛋白中，至少有2个蛋白参与炎症过程(S100-A8,C4b-B)，1个蛋白(CD63)与凝血相关，3个蛋白参与血管发生/血管生成(ATPsynthasesubunitbeta,cDNAFLJ14908fis和endoglin)，11个蛋白参与免疫调节(interleukin-27subunitbeta,F11receptor,isoformCRA_a,dynamin-2,proteinSEC13homolog,S100-A8,C4b-B,calnexin,serpinB9,stomatin-likeprotein2,phosphoinositide3-kinaseadapterprotein1和dolichyl-diphosphooligosaccharide-proteinglycosyltransferase48kDasubunit)。46 第三军医大学博士学位论文图3-3差异表达蛋白的GO分析KEGG通路分析表明，共获取101个差异蛋白参与的151条KEGG信号/代谢通路。进一步的KEGG通路富集分析显示25条通路被富集，主要涉及糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、脂肪酸延伸、类固醇激素生物合成以及氧化磷酸化等(图3-4)。值得注意的是，还有一些差异表达蛋白参与的通路与神经退变性疾病密切相关，比如阿尔茨海默病、帕金森病及亨廷顿病。47 第三军医大学博士学位论文图3-4差异表达蛋白的KEGG通路富集分析48 第三军医大学博士学位论文STRING数据库分析表明，差异表达蛋白之间存在着直接或间接的作用，并形成相互作用网络(图3-5)。特征选取是指利用统计学模型从所有鉴定到的蛋白质中选取可区分生物学样本的5蛋白质集合的过程。利用WEKA软件包分析结合蛋白质的表达倍数差异比(Ratio>1.2)，共筛选到的169个特征差异表达蛋白质。为了检验选取到差异表达蛋白质和特征差异表达蛋白质的合理性和准确性，利用筛选出的蛋白表达量，对各组样本进行层次聚类。聚类分析结果表明，差异表达蛋白被分成了两个主要的簇，每一组又分别分成上调表达蛋白和下调表达蛋白，热图(图3-6)同时还表明聚类分析的样品来自于不同的组别。图3-5差异表达蛋白相互作用网络49 第三军医大学博士学位论文图3-6差异表达蛋白的聚类分析(红色：表达上调；绿色：表达下调）50 第三军医大学博士学位论文3.2.7差异表达蛋白的Westernblotting验证本实验选择了4个差异表达的蛋白进行iTRAQ定量分析结果的验证，分别是CD63、S100-A8，Siglec-6以及Calnexin，从图3-7可以得知，4个蛋白在早发型重度子痫前期组(1)的表达水平明显高于正常妊娠组(2)，这与iTRAQ定量分析的结果一致。图3-7差异表达蛋白的Westernblotting验证3.3讨论定量蛋白质组学研究技术主要分为两类：一类是基于凝胶电泳和质谱检测的技术；另一类是基于同位素标记和色谱串联质谱检测技术。传统的凝胶电泳技术通过切断凝胶条带，再用质谱方法检测条带中的蛋白质，故该方法的应用范围受限于其较低的敏感度与精确性，不能用于检测低丰度蛋白、膜蛋白、分子量过大或过小以及极端等电点的蛋白质等。iTRAQ技术作为一种新的蛋白质组学定量研究方法，结合高度敏感性和精确性的液相色谱串联质谱技术，已广泛运用于肿瘤、心血管疾病、炎症等多个学科领域。iTRAQ技术利用4种或8种同位素试剂标记多肽末端氨基或赖氨酸侧链氨基51 第三军医大学博士学位论文基团，再经液相色谱串联质谱仪进行分析，可同时比较多达8种样品中蛋白质的相对或绝对表达量。本实验采用的是8种同位素标记的iTRAQ方法，试剂由报告基团、质量平衡基团和肽反应标记试剂基团三部分组成。其中每一种报告基团及其对应的平衡基团的总分子质量均为305Da，报告基团的相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121，故其相对应的质量平衡基团的相对分子质量分别为192、191、190、189、188、187、186和184。一个完整的iTRAQ定量研究包括预实验和正式实验两部分，预实验用于判断样品的质量、相似性以及初步确定蛋白质鉴定的数量，该流程中的SDS-PAGE电泳是一个重要的质量监控点。正式实验部分的基本流程大致分[35]为六步：(1)蛋白提取；(2)酶解：蛋白质经过酶解形成肽段；(3)iTRAQ标记：肽段末端氨基或赖氨酸侧链氨基基团与iTRAQ试剂中的肽反应标记基团相连接从而被标记；(4)混合：标记后的肽段等量混合；(5)SCX预分离：混合后的肽段经SCX预分离；(6)液相色谱串联质谱分析。一级质谱分析时，平衡基团使任何一种报告离子标记的肽段都表现为相同的质荷比值。二级质谱时，由于报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，平衡基团丢失，报告离子以不同质荷比(113~121)的峰呈现，根据其丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。鉴于其强大的技术优势，iTRAQ定量蛋白质组学方法在妊娠相关领域也逐渐得到应用。目前报道的有将iTRAQ技术用妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepaticcholestasisof[36]pregnancy,ICP)患者胎盘组织的差异表达蛋白质研究、辅助生殖技术中卵泡液的蛋[37]白质研究等。此外，iTRAQ定量蛋白质组学也运用于子痫前期的相关研究中。2012[38]年Kolla等利用iTRAQ技术分析了子痫前期患者在妊娠早期血浆样本的蛋白质表达情况，鉴定出10个蛋白在病例组表达上调：FibrinogenFragmentD,Clusterinisoform2,ApolipoproteinA-I,Fibronectin,Angiotensinogen,Galectin3binding,Plasminogen,[39]Transferrin,C4betabinding和Hemopexin。陈等比较分析了子痫前期患者、妊娠期高血压患者和正常妊娠妇女尿液中的蛋白质，共鉴定出362个非冗余蛋白，与正常对照组相比，PE组有113个差异表达的蛋白，生物信息学分析表明这些差异表达蛋白参与凝血、细胞粘附和分化、免疫反应和细胞骨架的发育等。且尿液血管紧张素原水平降低有利于鉴别PE。血浆和尿液取样方便，在疾病的早期诊断、病程的监控方面有着[40]光明的发展前景。2013年Shi等运用iTRAQ技术比较研究了子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘线粒体的蛋白质表达情况，PE组发现了4个表达上调以及22个表达下调的蛋白，进一步的生物信息分析表明这些差异表达的蛋白涉及子痫前期的重要病理过程，如凋亡、脂肪酸氧化、活性氧生成、三羧酸循环以及氧化应激反应等。2015年52 第三军医大学博士学位论文[41]Pan等采用该技术对子痫前期患者脐动脉进行了差异蛋白质组学研究，共鉴定出1521个蛋白，其中有1496个蛋白获得定量信息，进一步的分析鉴定出53个差异表达蛋白，其中子痫前期患者脐动脉组织中有22个蛋白表达上调，31个表达下调。通路分析显示这些差异表达蛋白在血管生成、血管发生以及心血管系统的发育中发挥重要作用。“三阶段”病因学假说明确了胎盘源性不良因子的释放是PE发病的关键病理生理环节，合体滋养细胞外囊泡是一类重要的胎盘释放因子，明确参与子痫前期的发病。迄今为止，文献报道有关合体滋养细胞外囊泡的蛋白质组学研究较少，已知的是2012[33]年牛津大学Redman等在一篇综述中进行了简单描述，灌注法体外制备得到pSTBM，采用多维蛋白质鉴定技术(multidimensionalproteinidentificationtechnology,MudPIT)鉴定出538个蛋白仅在PE-pSTBM组中表达，604个蛋白仅在正常pSTBM组中表达，有1421个蛋白为两组共有。筛选出两组共有的蛋白分子包括：HSP70,galectin3，外泌体蛋白(CD63,CD9,CD81)，免疫调节因子(CD26,CD200,CD47,galectin1)，补体及补体调节分子(C1q,C3,CD55,CD59,vitronectin)，氨基酸转运子CD98，抗血管[42]生成因子endoglin。2014年，新加坡Baig等采用1DGel-LC-MS/MS技术研究了子痫前期胎盘eSTBM的差异蛋白表达情况，共鉴定出400余个蛋白质，与正常妊娠组相比，子痫前期组胎盘STBM中的蛋白差异蛋白有25个，包括整合素类、膜联蛋白类及组蛋白类。比较本实验与前两个团队研究的不同之处在于：(1)研究对象定位不同：本实验聚集于早发型重度子痫前期，牛津团队的研究对象具体定位不清楚，新加坡团队定位于晚发型子痫前期。目前普遍认为早发型与晚发型子痫前期的病因及发病机制不同，合体滋养细胞外囊泡的脱落水平也不同。(2)STB-EVs体外制备方法不同：牛津团队采用绒毛小叶灌注法，新加坡团队及本实验研究均采用培养法制备，前期研究表明两种方法都可行。同样是培养法，本实验与新加坡团队也有区别，我们采用二氧化碳培养箱，氧浓度约21%，Baig等采用低氧(8%)条件进行培养。另外，我们采用的四步差速/超速离心法，最后一步超速离心用于去除混杂的蛋白质及蛋白质聚集小体，得到更纯的STB-EVs，而Baig等仅采用了传统的三步差速离心方法。(3)采用的蛋白质组学方法不同：牛津团队采用MudPIT鉴定出来的蛋白约2000个。新加波团队采用1DGel-LC-MS/MS技术，由于凝胶分离技术本身的不足，鉴定到的蛋白数仅400余个。本实验采用的iTRAQ定量蛋白质组学具有明显的技术优势，鉴定出的蛋白数量最多(3317个)，与正常妊娠组，早发型重度子痫前期组胎盘合体滋养细胞外囊泡中个共鉴定194个差异表达的蛋白，其中122个表达上调，72个表达下调，选取差异表达蛋白53 第三军医大学博士学位论文CD63,S100-A8,Siglec-6以及Calnexin进行Westernblotting分析，验证了其与iTRAQ定量分析的结果一致，即均在早发型重度子痫前期组表达上调。值得注意的是，本研究发现唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素6(sialicacid-bindingIg-likelectin6,Siglec-6)是早发型重度子痫前期胎盘合体滋养细胞外囊泡上调最显著的差异表达蛋白，比值为4.091，文献检索显示该蛋白仅在人类的胎盘组织中表达，[43]在小鼠、大鼠甚至其他灵长类如猿猴、狒狒等的胎盘中都无表达，而子痫前期又是人类妊娠特有的疾病，提示Siglec-6可能与子痫前期的发病密切相关。3.4小结本研究运用iTRAQ定量蛋白质组学相关技术对早发型重度子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘STB-EVs进行差异蛋白质分析，共鉴定出194个差异表达的蛋白，其中122个差异蛋白在病例组表达上调，72个表达下调。进一步的生物信息学分析表明这些差异表达蛋白参与细胞组成、生物过程和分子功能分别富集于线粒体、跨膜转运和跨膜转运蛋白活性方面。差异表达蛋白参与的主要代谢及信号通路为糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、脂肪酸延伸、类固醇激素生物合成以及氧化磷酸化。122个差异蛋白在早发型重度子痫前期组表达上调，涉及炎症反应、凝血过程、抗血管生成、免疫调节等子痫前期发病的主要病理生理过程，候选蛋白包括S100-A8,C4b-B,CD63,ATPsynthasesubunitbeta,cDNAFLJ14908fis,endoglin,interleukin-27subunitbeta,F11receptor,isoformCRA_a,dynamin-2,proteinSEC13homolog,calnexin,serpinB9,stomatin-likeprotein2,phosphoinositide3-kinaseadapterprotein1和dolichyl-diphosphooligosaccharide-proteinglycosyltransferase48kDasubunit。Siglec-6是早发型重度子痫前期胎盘STB-EVs中上调最为显著的蛋白。通过Westernblotting验证了iTRAQ定量分析结果的可靠性。该研究为下一步探索STB-EVs在子痫前期中的相关作用机制提供了实验依据。54 第三军医大学博士学位论文第四章Siglec-6致血管内皮功能障碍的作用研究血管内皮功能障碍是子痫前期的基本病理变化，既往的研究也证实了胎盘合体滋养细胞外囊泡导致血管内皮损伤，诱发母体过度的系统性炎性反应，进而引发子痫前期与子痫的一系列临床症状和体征。然而，胎盘合体滋养细胞外囊泡致血管内皮损伤的具体作用机制研究甚少。本研究第三章通过iTRAQ定量蛋白质组学从早发型重度子痫前期胎盘合体滋养细胞外囊泡中鉴定出来的差异表达最明显的Siglec-6蛋白，可能与子痫前期发病相关，研究其在血管内皮损伤中的作用有利于进一步阐明合体滋养细胞外囊泡致血管内皮损伤的作用机理。本部分实验首先通过ELISA和Westernblotting方法检测早发型重度子痫前期患者血浆中Siglec-6的表达情况；以人脐静脉内皮细胞HUVEC为靶细胞，探讨Siglec-6对其增殖、凋亡、迁移及炎性相关因子分泌的影响，并初步证明Siglec-6可能通过PI3K-AKT信号通路引起血管内皮功能障碍。4.1材料与方法4.1.1实验材料4.1.1.1实验样本(1)临床血浆本部分实验研究通过了大坪医院伦理委员会的审核。所有研究对象均已签署知情同意书。健康未孕组血浆样本来自于2014年4月在第三军医大学大坪医体检中心进行健康体检的未孕女性24例；晚孕对照组及早发型重度子痫前期组血浆来自于2013年7月～2014年4月在第三军医大学大坪医院和西南医院妇产科住院并经剖宫产分娩的产妇，其中早发型重度子痫前期患者24例，正常妊娠组孕妇24例，均于入院时(未进行药物治疗之前)和分娩24h内采集血液。妊娠组所有研究对象均为单胎妊娠。早发型重度子痫前期和正常妊娠组的入选和排除标准见2.1.1.1。(2)细胞株HUVEC细胞株购自美国ATCC库4.1.1.2实验主要仪器及耗材(1)低温高速离心机：美国Beckman公司(2)超净台：中国苏州安泰空气技术有限公司(3)精密电子天平：瑞士MettlerToledo公司55 第三军医大学博士学位论文(4)0.22um一次性针头滤器：美国Millipore公司(5)超纯水处理系统：美国Millipore公司(6)细胞培养孔板(各种规格)：美国Coring公司(7)二氧化碳培养箱：美国SHELLAB公司(8)倒置显微镜：日本Olympus公司(9)全自动酶标仪：美国Thermo公司(10)真空静脉血采集管(EDTAK2抗凝)：美国BD公司(11)超低温冰箱：美国Thermo公司(12)电泳槽及电泳仪：美国Bio-Rad公司(13)PVDF膜：美国Millipore公司(14)核酸蛋白测定仪：美国BioTek公司(15)15ml离心管：美国Coring公司4.1.1.3实验主要试剂(1)DMEM高糖培养基：美国Gibico公司(2)胎牛血清：美国Gibico公司(3)胰酶：美国Gibico公司(4)BCA蛋白定量试剂盒：中国上海碧云天生物技术公司(5)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2×)：中国上海碧云天生物技术公司(6)ECL化学发光底物试剂盒：美国Pierce公司(7)结晶紫染液：中国上海碧云天生物技术公司(8)CCK-8检测试剂盒：日本同仁化学研究所(9)柱式血清白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒：中国上海生工生物公司(10)Transwell小室(聚碳酯膜微孔直径为8μm)：美国Coring公司(11)兔抗人Siglec-6多克隆抗体：美国Abcam公司(12)山羊抗兔IgG：美国Pierce公司(13)人唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素6(Siglec-6)ELISA试剂盒：中国武汉优尔生公司(14)蔗糖：中国成都科龙化工试剂厂(15)丽春红染色液：中国上海碧云天生物技术公司(16)兔抗人PI3K单克隆抗体：美国CellSignaling公司(17)兔抗人AKT单克隆抗体：美国CellSignaling公司56 第三军医大学博士学位论文(18)兔抗人P-AKT单克隆抗体：美国CellSignaling公司(19)人IL-6的ELISA试剂盒：美国Abcam公司(20)人TNF-α的ELISA试剂盒：美国Abcam公司(21)人VEGF的ELISA试剂盒：美国Abcam公司(22)DMSO：美国Sigma公司(23)TUNEL细胞凋亡检测试剂盒：美国Roche公司(24)重组人Siglec6蛋白：中国北京义翘神州生物技术有限公司4.1.2实验方法4.1.2.1临床血浆样本制备采用19-G针头采集血液，用含EDTAK2的抗凝真空静脉血采集管收集2ml血液样本，反复颠倒混匀5-8次，15min内置于低温离心机中以1000g离心20min，小心吸取上层淡黄色血浆，按100µL/管分装，-80℃保存备用。4.1.2.2主要溶液的配制(1)0.25%胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶0.25g，完全溶解于100ml的PBS液中，再经0.22µm的滤膜过滤后分装，-20℃保存备用。(2)HUVEC细胞培养基：在超净台中取DMEM高糖培养基500ml，按90ml/瓶进行分装，共5瓶，每一瓶中分别加入10ml胎牛血清，拧紧瓶盖后用封口膜封口，标记分装日期和培养基种类，于4℃保存备用。(3)取重组人Sigle-6蛋白1支(100µg)，用400µL无菌PBS稀释，20µL/管分装，5管保存于-20℃备用，其余15管放入-80℃超低温冰箱中保存。4.1.2.3ELISA法检测血浆中Siglec-6的表达严格按照人唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素6(Siglec-6)ELISA试剂盒说明书进行操作。4.1.2.4Westernblotting检测血浆中Siglec-6的表达(1)去除血浆中白蛋白和免疫球蛋白：严格按照柱式血清白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒说明书进行。(2)蛋白变性：取步骤(1)中得到的血浆样本各20µL，用PBS按1:1体积比稀释后，再加入等体积的蛋白上样缓冲液(2×)，充分混匀后，于100℃煮沸5min，立即插入冰上。(3)配制9%分离胶：超纯水清洗玻璃板后晾干，固定、安装好制胶玻板。取一个57 第三军医大学博士学位论文干净的25ml烧杯，按照表4-1配制9%分离胶，混匀后沿玻璃板一侧缘缓慢加入4ml，避免产生气泡，再沿一侧缘缓慢加入无水乙醇压平胶面，室温下静置30min，使分离胶充分凝固。表4-1试剂体积超纯水1.8ml1MTris，pH8.82.5ml30%Acr-Bis(29:1)3ml10%SDS0.6ml10%AP0.1ml50%蔗糖1.6mlTEMED0.17ml(4)配制5%积层胶：倒去分离胶面残留的无水乙醇，滤纸吸干。另取一个干净的25ml烧杯，配制浓度为5%的积层胶，迅速灌入到分离胶面上，灌满，插入1.5mm加样梳，避免产生气泡，室温下等待胶体充分凝固。(5)电泳：沿水平方向拔出梳子，将凝胶板固定在电泳槽内，加入新鲜配制的1×电泳缓冲液超过内槽平面，用25µL微量进样器加入蛋白预染marker和变性后的蛋白溶液，单个加样孔加入蛋白预染marker5µL，选择2.1.2.6中早发型重度子痫前期患者胎盘STB-EVs作为本实验的对照组，血浆蛋白上样量为20µL。控制电压为125V，约90min，溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时，停止电泳。(6)电转：PVDF激活方法同2.1.2.6中步骤(8)，电压选择20V，电转45min。(7)丽春红染色：电转结束，取出PVDF膜，蛋白面朝上浸没在丽春红染色液中，缓慢摇动2min，直至出现粉红色清晰的条带。用超纯水漂洗PVDF膜5次，每次3min，直到粉红色条带消失。(8)封闭：取出PVDF膜，注意膜的蛋白面朝上，室温下凉干后置于无水乙醇中数秒，待膜成透明状立即捞起，凉至半干后放入TBST中清洗片刻，最后放至新鲜配制的含5%脱脂奶粉的TBST液中，37℃恒温振摇封闭2h。封闭和杂交都在6格抗体孵育盒中进行，每格中加入封闭液5-8ml，注意始终保持PVDF膜蛋白面朝上。(9)一抗杂交：弃掉封闭液，TBST清洗一遍，吸净孵育盒内残留的TBST液体，58 第三军医大学博士学位论文分别沿孵育格边缘缓慢加入含一抗的稀释液5ml，4℃摇床过夜。Siglec-6一抗稀释浓度为1：800。(10)洗膜：吸出含一抗的稀释液后，用TBST漂洗3次，每次10min。(11)二抗杂交：吸净TBST液体，加入含山羊抗兔的二抗稀释液，稀释比例均为1：2000。放入37℃水浴箱内轻摇孵育2h。(12)洗膜：吸出含二抗的稀释液，用TBST漂洗3次，每次10min。(13化学发光检测：同2.1.2.6步骤(14)。(14)结果处理：同2.1.2.6步骤(15)。4.1.2.4人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞株的复苏、培养和冻存方法(1)HUVEC细胞的复苏1)超净工作台预先经紫外灯照射30min消毒。取出含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，放入37℃恒温水浴箱中预热，约需20min；2)迅速自液氮中取出装有HUVEC细胞的冻存管，放入37℃恒温水浴箱内震荡使其快速融化；3)取15ml无菌离心管，先吸取5ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基加入离心管中，再将融化的细胞悬液迅速加入其中，以800rpm离心5min；4)先用无菌吸管小心地吸出上层的培养基，再更换无菌吸管重新吸取5ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，加入离心管内，轻轻吹散沉于管底的细胞，使其呈细胞悬液；5)更换无菌吸管，将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，摇匀，于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中进行培养。(2)HUVEC细胞的传代培养1)先在倒置显微镜下观察HUVEC细胞的生长状态以及贴壁的情况，若需更换培养基：A．打开超净工作台的紫外灯，照射30min，同时将灭菌处理后的PBS缓冲液及HUVEC细胞培养基放入37℃恒温水浴箱中，预热20min；B．操作时点燃酒精灯，距酒精灯火焰20cm以内进行所有操作，先用无菌吸管小心地吸弃细胞培养瓶中的培养基；C．更换无菌吸管沿培养瓶侧壁缓慢加入3ml灭菌的PBS缓冲液，轻微地来回颠晃漂洗细胞以去除未贴壁的细胞和杂质，吸弃PBS缓冲液；D．更换无菌吸管重新吸取3ml灭菌的PBS缓冲液，相同的方法漂洗细胞2次，59 第三军医大学博士学位论文吸弃PBS缓冲液；E．再更换无菌吸管吸取新的HUVEC细胞培养基5ml，加入细胞培养瓶中，放入培养箱内继续培养。2)若在倒置显微镜下观察到HUVEC细胞生长密度达80%，可进行细胞传代：A．超净工作台经紫外灯照射至少30min，将0.25%胰蛋白酶溶液、灭菌PBS缓冲液和HUVEC细胞培养基置于37℃恒温水浴箱中，预热20min；B．超净工作台中点燃酒精灯，所有操作在距酒精灯火焰20cm以内进行，先用无菌吸管吸弃培养瓶中原有的培养基；C．更换无菌吸管缓慢加入3ml灭菌PBS缓冲液漂洗细胞2次，吸除PBS缓冲液；更换吸管吸取1ml的0.25%胰蛋白酶溶液加入到培养瓶中消化细胞；D．细胞消化约2min，肉眼见胰酶消化液略变浑，立即置于倒置显微镜下观察，当细胞间隙变大、皱缩变圆并分离成单个细胞时，更换无菌吸管向培养瓶中加入2ml的HUVEC细胞培养基终止胰酶的消化作用；E．轻轻吹散贴在培养瓶底部的细胞，混匀后转移到15ml无菌离心管中，以800rpm离心5min，吸弃上层液体；F．更换无菌吸管吸取适量新的培养基加入到离心管内，轻轻吹散混匀，计算细胞密度，根据实验的需要，不同规格的孔板中接种适量的细胞悬液。(3)HUVEC细胞的冷冻保存1)倒置显微镜下观察到HUVEC细胞的生长状态良好，当生长密度达80%-90%时，可将细胞进行冷冻保存；2)打开超净工作台，紫外灯照射消毒30min，点燃酒精灯，配制细胞冻存液：取15ml无菌离心管，先加入9ml胎牛血清，再加入1ml的DMSO冻存液，充分混匀；3)吸弃培养瓶中原有的培养基，按前面的方法用PBS缓冲液洗涤细胞2次，吸弃PBS缓冲液；4)更换无菌吸管，加入1ml的0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，倒置显微镜下观察到细胞分离、皱缩变圆后，加入适量新的细胞培养基终止消化；5)取15ml无菌离心管，将上述胰蛋白酶-细胞培养基混合液转移到离心管内，以800rpm离心5min，吸弃上层液体；6)更换无菌吸管，吸取2ml步骤2)中配制的无菌细胞冻存液加入到离心管内，轻轻吹散重悬细胞，以1ml/冻存管分装细胞冻存悬液；7)用封口胶将冻存管封口，标记清楚冻存的细胞类别及时间，按以下顺序进行冷冻：60 第三军医大学博士学位论文4℃冰箱中放置1h→-20℃冰箱中放置2h→-80℃超低温冰箱中放置过夜→长期保存于液氮罐中。4.1.2.5HUVEC细胞增殖检测(1)Siglec-6作用于HUVEC细胞1)倒置显微镜下观察到HUVEC细胞的生长状态良好，当细胞生长密度达80%-90%时用于实验；2)按照前面的方法用0.25%胰蛋白酶消化细胞，获取HUVEC细胞悬液，传代到96孔板中，每个孔板的细胞密度约为2000个/100µL，摇匀细胞悬液确保接种的密度均匀，置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中进行培养过夜；3)镜下观察到HUVEC细胞的生长密度达50%-60%时，更换无血清的DMEM高糖培养基饥饿2小时，确保各孔板细胞的生长周期一致；4)实验分组：空白对照组、STB-EVs阳性对照组、0.5ng/ml组、1.0ng/ml组、2.0ng/ml组、5.0ng/ml组，每组七个复孔，分别以PBS缓冲液、STB-EVs悬液、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml的Siglec-6刺激HUVEC细胞；各组分别置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养24h、48h、72h，进行细胞增殖检测。(2)CCK-8细胞增殖检测吸弃培养皿中原来的培养基，加入新的培养基，分别向各孔加入10µl的CCK-8溶液，再将96孔板放入5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养2h，取出后在全自动酶标仪上检测波长为450nm时各孔的吸光度值，进行统计学分析。4.1.2.5HUVEC细胞迁移能力检测(1)检测HUVEC细胞的水平迁移能力1)镜下观察HUVEC细胞生长密度达60%时，准备实验；2)将装有6孔板的外包装盒、标记笔、直尺、酒精灯、打火机等实验所需物品一并放入超净工作台内，开启紫外灯照射消毒30min；3)点燃酒精灯，取出6孔板，双手握紧盖子及孔板，倒置在超净工作台上，按照直尺标记的刻度在孔板底部均匀的划出横线，线条之间的间隔距离为0.5cm，每个孔有5条横线，助于观察和记录细胞的状态；4)细胞铺板：取出细胞生长密度达60%的培养皿，按照前面的方法制备HUVEC5单个细胞悬液，根据细胞计数情况调整其密度，约5×10/ml，向6孔板每个孔中加入2ml细胞悬液，放入37℃培养箱(5%CO2)中培养24h；5)细胞划痕：将装有200µl枪头的盒子、直尺、酒精灯、打火机等实验物品置于61 第三军医大学博士学位论文超净台内，打开紫外灯照射30min，灭菌直尺放置于孔板上，方向与贯穿孔板底部的横线垂直，取1支无菌的200µl枪头，比着直尺，垂直于孔板背后的横线划痕，枪头要垂直。划痕后用PBS缓冲液洗涤细胞3次，PBS溶液贴孔板壁缓慢加入去除划掉的细胞，注意不要冲散单层贴壁细胞；6)实验分组：本实验设置空白对照组、STB-EVs阳性对照组、2.0ng/ml组、5.0ng/ml组，共4个组；然后分别以PBS缓冲液、STB-EVs悬液、2.0ng/ml、5.0ng/ml的Siglec-6刺激HUVEC细胞；每孔先加入2ml无血清的DMEM高糖培养基饥饿2h，再加入各处理因子，立即照相，然后各组分别置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养48h后拍照。(2)检测HUVEC细胞的固有迁移能力1)倒置显微镜下观察HUVEC细胞生长状态，当细胞融合达50%-60%时，准备实验；2)将装有Transwell小室的外包装盒、24培养孔板、酒精灯等实验所用物品放入超净工作台中，紫外灯照射消毒30min，同时将细胞培养基、无菌PBS缓冲液及0.25%胰蛋白酶溶液置于37℃恒温水浴箱中复温；3)按照细胞铺板的方法进行操作，用无血清培养基制备HUVEC单细胞悬液，用5细胞计数板进行计数，调整细胞密度约5×10/ml，混匀后备用。4)取出Transwell小室，分别置于新的24孔板中，形成上层的Transwell小室(上室)和下层的孔板(下室)，分别往上室中加入上述制备的HUVEC单细胞悬液200μl，向下室中加入HUVEC细胞培养基600µL；5)实验分组：分为4个组，即空白对照组、STB-EVs阳性对照组、2.0ng/ml组和5.0ng/ml组；分别向下室中加入PBS缓冲液、STB-EVs悬液、2.0ng/ml及5.0ng/ml的Siglec-6。避免下层培养液和上层小室间产生气泡，一旦出现，将上室提起，去除气泡后再将上室放进培养板。各组分别置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养24h；6)洗涤：培养结束后，取出上层的Transwell小室，轻轻地吸弃上室内的液体，用无菌棉签小心拭去上室内残留的细胞，然后用PBS缓冲液洗涤上室，每次5min，共洗3次；7)细胞固定与染色：先将上层小室浸入4%多聚甲醛液中，室温下固定30min；再将小室翻转晾干后置入结晶紫染液中20min；8)观察：染色完毕，取出小室，先经自来水轻轻冲洗去除未结合的染色剂，再将小室浸入超纯水中洗涤，每次10min，共洗2次；将小室置于倒置显微镜40×倍下观62 第三军医大学博士学位论文察染色剂洗涤效果，见单个细胞形态清楚；转换至高倍镜(200×)视野，每一个小室随机选取左、右、上、中及下5个视野进行细胞计数，每个视野重复计数3次，取平均值。4.1.2.5HUVEC细胞凋亡检测(1)倒置显微镜下观察HUVEC细胞生长融合达50%-60%时，准备实验；(2)超净工作台及实验所需物品的准备同前，吸弃培养孔板中原来的培养基，按前面的方法，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并制备单个细胞悬液，细胞计数，调整细胞密4度每张片约10铺种于12孔板的圆形载玻片上，置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养过夜；(3)以PBS缓冲液洗涤两次，吸弃，加入无血清的DMEM高糖细胞培养基，于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养2h；(4)实验分组：本实验设置空白对照组、STB-EVs对照组、2.0ng/ml组；分别加入PBS缓冲液、STB-EVs悬液、2.0ng/ml的Siglec-6处理，于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养48h；(5)吸弃培养基，用PBS缓冲液轻柔漂洗细胞爬片，每次5min，共洗涤2次；(6)4%多聚甲醛固定30min；(7)固定后，用PBS缓冲液洗涤细胞爬片2次，每次5min；(8)加入ProteinaseK工作溶液，于37℃孵育30min；(9)用PBS缓冲液洗涤载玻片2次，每次5min；(10)于冰盒上现用现制备TUNEL混合反应液，空白对照组仅加50µL荧光素标记的dUTP液，Siglec-6(2.0ng/ml)组和STB-EVs组用50µLTdT+450µL荧光素标记的dUTP液混匀；(11)待细胞爬片干后，加50µL的TUNEL反应混合液(空白对照组仅加50µL荧光素标记的dUTP液)于爬片上，加盖玻片后置于暗湿盒中，于37℃放置1h；(12)细胞爬片经PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；(13)加入DAPI细胞核染料染色5min；(14)细胞爬片经PBS缓冲液洗涤5次，每次5min；(15)在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm)。4.1.2.6ELISA法检测HUVEC细胞IL-6、TNF-α及VEGF的表达(1)超净工作台及实验所需物品准备同前。取细胞生长密度约50%-60%时，按前面63 第三军医大学博士学位论文的方法以胰酶消化制备单个细胞悬液，传代至96孔板；(2)实验分组：设置空白对照组、STB-EVs阳性对照组、2.0ng/ml组、5.0ng/ml组，共4个组；分别以PBS缓冲液、STB-EVs悬液、2.0ng/ml、5.0ng/ml的Siglec-6刺激HUVEC细胞，每孔加入100µL无血清的DMEM高糖培养基。各组分别置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养24h、48h及72h。(3)分别于培养24h、48h及72h取出，吸出培养液到无菌离心管中，以2000rpm离心20min，小心吸出上清液；(4)严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，分别检测24h、48h及72h时间节点，空白对照组、STB-EVs阳性对照组、2.0ng/ml组、5.0ng/ml组上清液中IL-6、TNF-α及VEGF的表达情况。4.1.2.7Westernblotting检测Siglec-6对HUVEC细胞PIK3-AKT信号通路的影响(1)细胞处理与分组：将HUVEC细胞传代至6孔板中，用无血清的DMEM高糖培养基，饥饿2h；实验分组：空白对照组(control)、STB-EVs组、Siglec-6(2.0ng/ml)组，分别加入PBS缓冲液、STB-EVs悬液和2.0ng/ml的Siglec-6刺激HUVEC细胞，置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养15min，收集细胞用于检测AKT及AKT磷酸化水平，继续培养48h后终止，收集细胞用于检测PI3K的表达。(2)细胞总蛋白的提取1)充分吸净各培养孔板中的培养液，沿孔板壁缓慢加入无菌冰PBS缓冲液，轻轻颠倒洗涤，去除坏死及贴壁不良的细胞，共洗涤3次；2)吸净无菌冰PBS缓冲液后，将培养皿置于冰上，每孔加入200µL含1mMPMSF的RIPA裂解液，混匀后冰上裂解30min；3)用干净的细胞刮将细胞刮至孔板一侧，将细胞碎片和裂解液吸至1.5ml的EP管内，插入冰盒中，选择20kHz的超声波破碎3秒；4)将EP管置于低温离心机内，以12000g离心30min，吸取上清，分装，-20℃冰箱中保存备用。同时留取10µL上清液用于蛋白定量。(3)蛋白含量的测定BCA法蛋白浓度测定(按试剂盒操作说明进行)(4)细胞蛋白的SDS-PAGE电泳操作方法同2.1.2.6中步骤(4)至步骤(15)4.1.2.8软件及统计学分析实验图片使用Image-Proplus6.0、Labwork4.6以及GraphPadPrism5.0软件进行64 第三军医大学博士学位论文分析，SPSS18.0统计学软件进行数据的统计学处理和分析，数据结果以均数±标准差(x±s)的形式表示，两组间的比较采用t检验，两组以上的组间数据比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，P<0.05表示数据的差异具有统计学意义。4.2实验结果4.2.1Westernblotting检测血浆中Siglec-6的表达早发型重度子痫前期患者及正常妊娠组孕妇在入院时、未进行药物治疗前抽取静脉血，EDTAK2的抗凝后低温离心获得血浆样本，再经柱式血清白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒处理，去除高丰度蛋白质，以2.1.2.6中制备的早发型重度子痫前期患者胎盘STB-EVs作为阳性对照组，进行Westernblotting检测。结果表明，正常妊娠组孕妇和早发型重度子痫前期患者血浆中均有Siglec-6的表达，且在早发型重度子痫前期患者血浆中的表达水平更高，二者具有统计学差异(P<0.05)。图4-1为代表性的条带。ABCSiglec649KD3020#*Siglec6/ul10*0ABC图4-1血浆中Siglec-6蛋白的表达情况(A：STB-EVs组；B：正常妊娠组；C：早发型重度子痫前期组；*：与A组相比较p<0.05；#：与B组相比较p<0.05)4.2.2ELISA法检测血浆中Siglec-6的表达情况选取健康未孕女性、早发型重度子痫前期患者及正常妊娠组孕妇在入院时和分娩24h以内的血浆样本，共分5个组，ELISA测定血浆中Siglec-6的表达情况。结果表65 第三军医大学博士学位论文明健康未孕女性外周血中几乎无Siglec-6的表达(0.08±0.0007ng/ml)，正常妊娠组孕妇外周血中Siglec-6水平升高，为0.21±0.04ng/ml，早发型重度子痫前期患者分娩前的Siglec-6表达水平最高，为0.80±0.23ng/ml，二者相比具有显著性差异(P<0.05)；且正常妊娠组及早发型重度子痫前期组Siglec-6的表达水平均在分娩后迅速降低，分别为0.09±0.01ng/ml及0.09±0.007ng/ml，接近未孕水平(见图4-2)。1.5#*1.00.5siglec6(ng/ml)*##$0.0ABCDE图4-2血浆中Siglec-6的浓度(A：健康未孕组，B：正常妊娠未产组，C：正常妊娠已产组，D：早发型重度子痫前期未产组，E：早发型重度子痫前期已产组；*：与A组相比P<0.05；#：与B组相比P<0.05；Δ：与C组相比P<0.05；$：与D组相比P<0.05)4.2.3Siglec-6对HUVEC细胞增殖能力的影响既往研究表明STB-EVs具有抑制内皮细胞增殖的作用，我们第三章的研究表明了Siglec-6是早发型重度子痫前期患者STB-EVs上差异表达最显著的蛋白，为了明确Siglec-6对内皮细胞增殖的影响，本实验首先以PBS缓冲液处理为空白对照，STB-EVs为阳性对照组，处理48h，采用CCK-8检测不同浓度Siglec-6对HUVEC细胞增殖的影响，实验重复5次。结果显示：Siglec-6浓度为0.5ng/ml时的相对OD值为1.23±0.30，空白对照组的相对相对OD值为1.53±0.23，二者相比无统计学差异(P>0.05)；随着Siglec-6处理浓度的升高，相对OD值降低：Siglec-6为1.0ng/ml的相对OD值为0.86±0.14，处理浓度为2.0ng/ml的相对OD值为0.68±0.14，处理浓度为5.0ng/ml的相对OD值为0.67±0.10，与PBS缓冲液处理的空白对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，且Siglec-6浓度为2.0ng/ml、5.0ng/ml以及STB-EVs(相对OD值为0.64±0.15)与0.5ng/ml组相比较，差异显著(P<0.05)，处理浓度为2.0ng/ml与5.0ng/ml相比，66 第三军医大学博士学位论文无明显差异(P>0.05)。综合上述结果，表明Siglec-6具有抑制HUVEC细胞增殖的作用，且Siglec-6浓度为2.0ng/ml对细胞增殖的抑制作用最强(图4-3A)。2.01.51.0*#**##*0.5CCK8(OD=450nm)0.0control0.51.025STB-EVsSiglec6(ng/ml)图4-3ASiglec-6不同浓度对HUVEC细胞增殖的影响(control：PBS缓冲液；*：与control组相比较P<0.05；#：与0.5ng/mlSiglec6组相比较P<0.05)继续以PBS缓冲液作为空白对照组，采用CCK-8检测法比较2.0ng/ml的Siglec-6处理后，不同时间节点(24h、48h及72h)HUVEC细胞增殖能力的差异，实验重复5次。检测结果显示：以2.0ng/ml的Siglec-6处理HUVEC细胞24h，相对OD值为0.81±0.11，与PBS缓冲液处理的对照组相对OD值0.87±0.12相比，无显著差异(P>0.05)；以2.0ng/ml的Siglec-6处理HUVEC细胞48h，相对OD值为0.62±0.13，低于PBS缓冲液处理的对照组(相对OD值1.11±0.17)，也低于处理24h组，差异具有显著性(P<0.05)；以2.0ng/ml的Siglec-6处理HUVEC细胞72h，相对OD值为0.63±0.13，低于PBS缓冲液处理的对照组(相对OD值1.32±0.21)，也低于处理24h组，差异具有显著性(P<0.05)，但与处理48h组相比，差异无显著性(P>0.05)。综合上述检测结果，表明以2.0ng/ml的Siglec-6处理48h，对HUVEC细胞增殖的抑制作用最强(图4-3B)。67 第三军医大学博士学位论文2.0controlsiglec6(2ng/ml)1.51.0##**0.5CCK8(OD=450nm)0.024hours48hours72hours图4-3BSiglec-6(2.0ng/ml)在不同时间上对HUVEC细胞增殖的影响(control：PBS缓冲液；*：与control组相比较P<0.05；#：与24h组相比P<0.05)进一步采用CCK-8检测法比较空白对照组(PBS缓冲液)、STB-EVs悬液组及2.0ng/ml的Siglec-6处理48h，HUVEC细胞增殖能力的差异，实验重复5次。检测结果显示：以PBS缓冲液处理的对照组相对OD值为0.96±0.08，高于2.0ng/ml的Siglec-6处理组相对OD值0.55±0.08及STB-EVs处理组相对OD值0.53±0.07，差异具有显著性(P<0.05)，而Siglec-6处理组与STB-EVs处理组相比，无明显差异(P>0.05)。上述结果表明，Siglec-6(2.0ng/ml)和STB-EVs作用于HUVEC细胞48h，均可抑制HUVEC细胞增殖，且二者的抑制作用相当(图4-3C)。1.51.0**0.5CCK8(OD=450nm)0.0controlsiglec6STB-EVs图4-3BSiglec-6(2.0ng/ml)对HUVEC细胞增殖的影响(control：PBS缓冲液；*：与control组相比较P<0.05，n=5)68 第三军医大学博士学位论文4.2.4Siglec-6对HUVEC细胞迁移能力的影响运用划痕实验方法对2.0ng/ml及5.0ng/ml浓度Siglec-6处理HUVEC细胞后，细胞在水平方向上迁移能力进行检测，结果显示：在培养48h以后，各组细胞均由原划痕部位(0h)向中间位置进行水平方向的迁移(见图4-4A)，其中，STB-EVs组、Siglec-6浓度为2.0ng/ml及5.0ng/ml组对HUVEC细胞的水平迁移距离分别为：0.49±0.08、0.48±0.16、0.55±0.10，均高于PBS缓冲液对照组0.23±0.04，差异具有统计学意义(P<0.05)，而STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组之间相比较无明显差异(P>0.05)(见图4-4B)。该实验结果表明：STB-EVs和Siglec-6(2.0ng/ml和5.0ng/ml)均可抑制HUVEC细胞在水平方向的迁移能力，且2.0ng/ml的Siglec-6对HUVEC细胞在水平方向迁移能力的抑制作用与5.0ng/ml相当。controlSTB-EVsSiglec6(2ng/ml)Siglec6(5ng/ml)0hour48hours图4-4ASiglec-6对HUVEC细胞水平迁移能力的影响(划痕实验：相差显微镜40×)69 第三军医大学博士学位论文0.8**0.6*0.4migrationindex0.20.0ControlSTB-EVs2ng/ml5ng/mlSiglec6图4-4BSiglec-6对HUVEC细胞水平迁移能力的影响(control：PBS缓冲液；*：与control组相比较P<0.05)此外，本实验还采用Transwell小室实验方法检测Siglec-6不同处理浓度对HUVEC细胞固有迁移能力影响。Transwell实验结果显示：4个组均可导致HUVEC细胞从上室(Transwell小室)迁移至下室(培养孔板)(见图4-4C)，其中STB-EVs组细胞迁移数量为111.2±15.04，2.0ng/ml的Siglec-6组细胞迁移数量为139±19.76，5.0ng/ml的Siglec-6组细胞迁移数量为111.4±12.99，均低于PBS缓冲液对照(control)组223.2±20.07，差异具有统计学意义(P<0.05)。而STB-EVs组和5.0ng/ml组均高于2.0ng/ml组，差异具有显著性(见图4-4D)。该实验结果表明：STB-EVs和Siglec-6(2.0ng/ml和5.0ng/ml)均可抑制HUVEC细胞的固有迁移能力，且5.0ng/ml的Siglec-6对HUVEC细胞固有迁移能力的抑制作用强于2.0ng/ml组。70 第三军医大学博士学位论文图4-4CSiglec-6对HUVEC细胞固有迁移能力的影响(transwell实验：相差显微镜40×)300200**##*100migrationcellnumber0ControlSTB-EVs2ng/ml5ng/mlSiglec6图4-4DSiglec-6对HUVEC细胞固有迁移能力的影响(control：PBS缓冲液；*：与control组相比较P<0.05；#：与Siglec6(2.0ng/ml)组相比较P<0.05)4.2.5Siglec-6对HUVEC细胞凋亡的影响运用TUNEL法检测Siglec-6处理对HUVEC细胞凋亡的影响。结果显示：与对照组相比，Siglec-6(2.0ng/ml)及STB-EVs均可诱导HUVEC细胞的凋亡(见图4-5A)，两组致71 第三军医大学博士学位论文细胞凋亡比率分别为15.15±2.47和17.10±1.25，与对照组的0.61±0.29相比，差异显著(P<0.05)(见图4-5B)。Siglec-6(2.0ng/ml)与STB-EVs诱导HUVEC细胞凋亡的能力相当。TUNELDAPIMergeABC图4-5ASiglec6对HUVEC细胞凋亡的影响(TUNEL染色：荧光显微镜20×)20**1510Tunelpositive%50ABC图4-5BSiglec6对HUVEC细胞凋亡的影响(A：PBS缓冲液对照组，B：STB-EVs组，C：Siglec-6(2.0ng/ml)组；*：与A组相比较p<0.05)72 第三军医大学博士学位论文4.2.6Siglec-6对HUVEC细胞分泌IL-6、TNF-α及VEGF的影响本实验采用ELISA法检测不同浓度Siglec-6刺激HUVEC细胞，在不同时间节点对炎性细胞因子IL-6、TNF-α以及血管内皮生长因子VEGF分泌的差异。实验结果显示：干预24h时，与对照组(control，PBS缓冲液)相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组均促进HUVEC细胞分泌IL-6，差异具有统计学差异(P<0.05)，且后面三组促进细胞分泌IL-6的水平相当；干预48h，与对照组相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组均进一步促进HUVEC细胞分泌IL-6，差异有显著性(P<0.05)，且各组分泌的IL-6均高于各自24h的水平，有显著性差异(P<0.05)，同时STB-EVs组和5.0ng/ml的Siglec-6组分泌IL-6的水平高于2.0ng/ml的Siglec-6组，具有显著性差异(P<0.05)；干预72h，与对照组相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组均进一步促进HUVEC细胞分泌IL-6，差异有显著性(P<0.05)，三组分泌IL-6的水平均高于各自对应的24h组时，具有显著性差异(P<0.05)，其中两种浓度的Siglec-6组刺激HUVEC细胞分泌IL-6的水平均高于各自浓度组48h的水平，差异有统计学意义(P<0.05)，同时5.0ng/ml的Siglec-6组刺激细胞分泌IL-6的水平高于2.0ng/ml组(见表4-2)。本实验表明Siglec-6促进HUVEC细胞分泌IL-6，且IL-6水平的增加具有浓度和时间依赖性，与之成正比。表4-2Siglec6干预HUVEC细胞对IL-6分泌的影响controlSTB-EVsSiglec6(2.0ng/ml)Siglec6(5.0ng/ml)***24h5.17±1.3928.37±3.2420.56±2.2828.39±1.97*#Δ*δ*#Φ48h3.95±1.8643.88±3.2133.49±10.2244.96±9.53*Δ*δα*#Φβ72h2.99±0.4652.55±4.4645.17±3.4357.99±6.29注：*：与control组相比较P<0.05；#：与Siglec6(2.0ng/ml)比较P<0.05；Δ：与24hoursSTB-EVs相比较P<0.05；δ：与24hoursSiglec6(2.0ng/ml)相比较P<0.05；α：与48hoursSiglec6(2.0ng/ml)相比较P<0.05；Φ：与24hoursSiglec6(5.0ng/ml)相比较P<0.05；β：与48hoursSiglec6(5.0ng/ml)相比较P<0.05。干预24h，与对照组相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组HUVEC细胞分泌VEGF均降低，差异具有统计学差异(P<0.05)，后三组之间比较，HUVEC细胞分泌的VEGF无明显差异；干预48h，与对照组相比，后面三73 第三军医大学博士学位论文组细胞分泌VEGF均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，2.0ng/ml与5.0ng/ml的Siglec-6组之间相比无明显差异，且与各自组干预24h相比，差异仍不显著；干预72h，与对照组相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组HUVEC细胞分泌VEG仍均降低，差异具有统计学差异(P<0.05)，但不同浓度之间无明显差异，且不同浓度组与各自组内干预的24h、48h相比，差异仍无统计学意义(P>0.05)(见表4-3)。本实验表明不同浓度的Siglec-6均可抑制HUVEC细胞分泌VEGF，且这种抑制作用不受Siglec-6的浓度和作用时间的影响。表4-3Siglec6干预HUVEC细胞对VEGF分泌的影响controlSTB-EVsSiglec6(2.0ng/ml)Siglec6(5.0ng/ml)***24h195.62±23.9258.36±8.2977.85±11.2757.41±10.53***48h183.42±9.7952.95±10.5865.22±6.8348.86±7.32***72h221.63±25.6458.13±9.3778.11±10.9364.93±6.57注：*：与control组相比较P<0.05干预24h时，与对照组相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组均促进HUVEC细胞分泌TNF-α，差异具有统计学差异(P<0.05)，且STB-EVs组和5.0ng/ml的Siglec-6组细胞分泌TNF-α的水平高于2.0ng/ml的Siglec-6组，有显著性差异(P<0.05)；干预48h，与对照组相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组均进一步促进HUVEC细胞分泌TNF-α，差异有显著性(P<0.05)，其中STB-EVs组和2.0ng/ml的Siglec-6组分泌的TNF-α均高于各自组内24h的水平，有显著性差异(P<0.05)，而5.0ng/ml的Siglec-6组分泌TNF-α的水平与该浓度干预24h分泌的水平相当，无统计学差异；干预72h，与对照组相比，STB-EVs组、2.0ng/ml的Siglec-6组及5.0ng/ml的Siglec-6组均进一步促进HUVEC细胞分泌TNF-α，差异有显著性(P<0.05)，后三组分泌TNF-α的水平均高于各自组内相应的24h分泌水平，具有显著性差异(P<0.05)，其中两种浓度的Siglec-6组刺激HUVEC细胞分泌TNF-α的水平均高于各自浓度组48h的水平，差异有统计学意义(P<0.05)，同时5.0ng/ml的Siglec-6组刺激细胞分泌TNF-α的水平高于2.0ng/ml组(见表4-4)。本实验表明Siglec-6促进HUVEC细胞分泌TNF-α，且TNF-α水平的增加具有浓度和时间依赖性，与之成正比。74 第三军医大学博士学位论文表4-4Siglec6干预HUVEC细胞对TNF-α分泌的影响controlSTB-EVsSiglec6(2.0ng/ml)Siglec6(5.0ng/ml)*#**#24h5.46±2.9820.97±2.5912.15±1.9521.57±2.3*#Δ*δ*#48h3.81±1.5429.34±2.420.86±1.9525.69±2.25*#Δ*δα*#Φβ72h4.24±1.9439.11±3.9130.04±1.3636.05±2.64注：*：与control组相比较P<0.05；#：与Siglec6(2.0ng/ml)比较P<0.05；Δ：与24hSTB-EVs相比较P<0.05；δ：与24hSiglec6(2.0ng/ml)相比较P<0.05；α：与48hSiglec6(2.0ng/ml)相比较P<0.05；Φ：与24hSiglec6(5.0ng/ml)相比较P<0.05；β：与48hSiglec6(5.0ng/ml)相比较P<0.05。4.2.7Siglec-6可能下调PI3K-AKT通路抑制HUVEC细胞增殖、促进细胞凋亡前期实验结果表明Siglec-6浓度为2.0ng/ml对细胞增殖的抑制作用最强，本实验以PBS缓冲液处理为对照(control)组，STB-EVs和Siglec-6(2.0ng/ml)处理HUVEC细胞后，采用Westernblotting方法检测PI3K的表达以及AKT磷酸化的变化情况，初步探索Siglec-6参与PI3K-AKT信号通路以及在HUVEC细胞增殖及凋亡中的作用。结果表明：与对照组相比，STB-EVs组和Siglec-6组(2.0ng/ml)刺激HUVEC细胞后，PI3K的表达降低，差异有显著性(P<0.05)(见图4-6A)，且两组刺激后细胞AKT磷酸化的表达也降低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(见图4-6B)。我们推测STB-EVs和Siglec-6可通过抑制PI3K-AKT信号通路，从而抑制HUVEC细胞的增殖，促进其凋亡。ABCPI3K85KDGAPDH37KD2.01.5**1.0PI3K/GAPDH0.50.0ABC图4-6ASiglec-6干预HUVEC细胞对PI3K的影响(A：PBS缓冲液对照组，B：STB-EVs组，C：Siglec-6(2.0ng/ml)组；*：与A组相比较p<0.05)75 第三军医大学博士学位论文ABCp‐Akt60KDAkt60KD2.01.5**1.0p-Akt/Akt0.50.0ABC图4-6BSiglec-6干预HUVEC细胞对Akt磷酸化的影响(A：PBS缓冲液对照组，B：STB-EVs组，C：Siglec-6(2.0ng/ml)组；*：与A组相比较p<0.05)4.3讨论唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素家族(sialicacidbindingimmunoglobulinlikelectins，Siglecs)是免疫球蛋白超家族的经典成员之一，按序列的相似性和进化的保守性分为两类：一类在所有哺乳动物都明确有直系同源物(约25-30%的序列相同)，包括唾液酸粘附素(又名Siglec-1或CD169)、CD22(又名Siglec-2)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG，又名Siglec-4)和Siglec-15；另一类是CD33相关的Siglecs，目前人类有9个CD33相关的Siglecs以及一个Siglec样蛋白，包括：CD33(又名Siglec-3)、CD170(又名Siglec-5)、CD327(又名Siglec-6)、CD328(又名Siglec-7)、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11和Siglec-14；小鼠有5个CD33相关的Siglec，包括：CD33(又名Siglec-3)、Siglec-E、Siglec-F、Siglec-G和Siglec-H。除Siglec-4和Siglec-6以外，Siglec主要表达于造血系统和免疫系统，可介导细胞间的信号传导、参与免疫调节以及在炎症反应中发挥重要[44-46]的作用。Siglec-6可表达于所有灵长类动物的B细胞表面，但却只在人类的胎盘[43][47]上有表达，且在子痫前期胎盘的基板和绒毛膜绒毛上的表达明显增加，提示Siglec-6可能与子痫前期的病理过程相关。血管内皮损伤是PE发病的终末通路和中心[8,48]环节，前期大量研究明确了胎盘合体滋养细胞外囊泡可引起血管内皮功能障碍。76 第三军医大学博士学位论文本研究前期对于早发型重度子痫前期患者胎盘合体滋养细胞外囊泡进行差异蛋白组学分析，发现Siglec-6是差异最显著的蛋白，在早发型重度子痫前期患者胎盘合体滋养细胞外囊泡中表达明显增加，可随STB-EVs一起脱落至母体外周循环，导致血管内皮损伤，目前缺乏Siglec-6与血管内皮损伤的相关研究。我们首先验证早发型重度子痫前期和正常妊娠妇女外周血中的Siglec-6的表达情况，血浆Westernblotting结果表明，正常妊娠组孕妇和早发型重度子痫前期患者血浆中均有Siglec-6的表达，且在早发型重度子痫前期患者血浆中的表达水平更高，二者具有统计学差异。ELISA测得早发型重度子痫前期患者分娩前外周血中Siglec-6含量为0.80±0.23ng/ml，显著高于正常妊娠妇女组0.21±0.04ng/ml，分娩后两组体内[47]Siglec-6的表达迅速降低，接近未孕水平。然而，Rumer等用Westernblotting方法未检测出正常妊娠妇女和PE患者血浆中有可溶性Siglec-6的表达，也未从BeWO和HTR-8/SVneo滋养细胞培养上清液中检测到Siglec-6的表达。分析可能有两个原因导致结果的不一致：一是选择的Siglec-6抗体不同，不同的抗体可能识别的蛋白亚型不一样；二是可能受血浆高丰度蛋白的影响，我们在进行Westernblotting实验之前，对血浆样本进行了去白蛋白/免疫球蛋白处理，所有样本均一化处理成20µL，全部上样进行Westernblotting检测。进一步以人脐静脉内皮细胞HUVEC为靶细胞，探讨Siglec-6对其增殖、凋亡、迁移及炎性相关因子分泌的影响，结果表明Siglec-6抑制了HUVEC细胞的增殖与迁移，促进了HUVEC细胞凋亡和炎性因子IL-6、TNF-α的分泌，抑制了HUVEC细胞VEGF的分泌，从而损伤HUVEC细胞。作为细胞内重要的促增殖和抗凋亡通路，PI3K-AKT信号传导通路可能参与Siglec-6致血管内皮损伤过程，初步的研究表明，Siglec-6可以抑制PI3K的表达，继而降低了AKT磷酸化水平，进一步影响了下游效应分子如细胞周期调节蛋白、凋亡相关蛋白等的活性，从而发挥了抑制血管内皮细胞增殖、促进其凋亡的作用，详细的作用机理有待进一步研究。77 第三军医大学博士学位论文4.4小结本研究中我们发现了早发型重度子痫前期患者血浆中Siglec-6蛋白的水平显著高于正常妊娠妇女。Siglec-6在健康未孕女性外周血中几乎无表达(0.08±0.0007ng/ml)，在未分娩的早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女血浆中的含量分别为0.80±0.23ng/ml和0.21±0.04ng/ml，且分娩后Siglec-6的表达迅速降低，分别为0.09±0.007ng/ml及0.09±0.01ng/ml，接近未孕水平。临床终止妊娠是早发型重度子痫前期唯一有效的治疗手段，血浆中Siglec-6水平的改变为此提供了实验佐证。进一步从细胞增殖、迁移、凋亡及炎性因子的分泌等方面验证了Siglec-6具有损伤血管内皮细胞的作用，初步推测Siglec-6可能通过下调PI3K-AKT信号传导通路，抑制血管内皮细胞的增殖，促进其凋亡等。78 第三军医大学博士学位论文全文总结1、胎盘绒毛组织块培养结合四步差速/超速离心法从胎盘中成功分离出合体滋养细胞外囊泡。2、早发型重度子痫前期与正常妊娠妇女胎盘STB-EVs的蛋白质表达谱存在差异。运用iTRAQ定量蛋白质组学方法共鉴定出194个差异表达的蛋白，其中122个在早发型重度子痫前期组表达上调，72个表达下调，进一步的生物信息学分析表明这些差异表达蛋白参与细胞组成、生物过程和分子功能分别富集于线粒体、跨膜转运和跨膜转运蛋白活性方面。差异表达蛋白参与的主要代谢及信号通路为糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、脂肪酸延伸、类固醇激素生物合成以及氧化磷酸化。16个表达上调的候选蛋白涉及炎症反应、凝血过程、抗血管生成、免疫调节等子痫前期发病的主要病理生理过程。筛选发现Siglec-6是早发型重度子痫前期STB-EVs中上调最显著的差异表达蛋白。3、Siglec-6在早发型重度子痫前期患者外周血中的表达水平显著高于正常妊娠组，其含量约为正常妊娠妇女的4倍，且分娩后体内表达迅速降低，接近未孕水平。血浆中Siglec-6的水平变化为临床终止妊娠是早发型重度子痫前期唯一有效的治疗手段提供了实验佐证。4、Siglec-6可能通过调控PI3K-AKT信号通路，抑制血管内皮细胞的增殖和迁移、促进血管内皮细胞的凋亡及炎性因子IL-6及TNF-α的分泌、抑制VEGF的分泌，导致血管内皮损伤。Siglec-6可能是诱发早发型重度子痫前期发病的关键蛋白之一。79 第三军医大学博士学位论文参考文献[1]曹泽毅,沈铿,马彦彦,高雨农,陈春玲.中华妇产科学(临床版)[M].北京：人民卫生出版社,2010:154.[2]RedmanCW,SargentIL.Latestadvancesinunderstandingpreeclampsia[J].Science,2005,308(5728):1592-1594.[3]RedmanCW,SargentIL.Immunologyofpre-eclampsia[J].AmJReprodImmunol,2010,63(6):534-543.[4]ChaiworapongsaT,ChaemsaithongP,YeoL,RomeroR.Pre-eclampsiapart1:currentunderstandingofitspathophysiology[J].NaturereviewsNephrology,2014,10(8):466-480.[5]LokCA,VanDerPostJA,SargentIL,HauCM,SturkA,BoerK,NieuwlandR.Changesinmicroparticlenumbersandcellularoriginduringpregnancyandpreeclampsia[J].Hypertensioninpregnancy:officialjournaloftheInternationalSocietyfortheStudyofHypertensioninPregnancy,2008,27(4):344-360.[6]LeeSM,RomeroR,LeeYJ,ParkIS,ParkCW,YoonBH.Systemicinflammatorystimulationbymicroparticlesderivedfromhypoxictrophoblastasamodelforinflammatoryresponseinpreeclampsia[J].Americanjournalofobstetricsandgynecology,2012,207(4):337e331-338.[7]GardinerC,TannettaDS,SimmsCA,HarrisonP,RedmanCW,SargentIL.Syncytiotrophoblastmicrovesiclesreleasedfrompre-eclampsiaplacentaeexhibitincreasedtissuefactoractivity[J].PloSone,2011,6(10):e26313.[8]LokCA,SnijderKS,NieuwlandR,VanDerPostJA,deVosP,FaasMM.Microparticlesofpregnantwomenandpreeclampticpatientsactivateendothelialcellsinthepresenceofmonocytes[J].AmJReprodImmunol,2012,67(3):206-215.[9]Mincheva-NilssonL,BaranovV.Placenta-DerivedExosomesandSyncytiotrophoblastMicroparticlesandtheirRoleinHumanReproduction:ImmuneModulationforPregnancySuccess[J].AmJReprodImmunol,2014,72(5):440-457.[10]RedmanCW,SargentIL.Circulatingmicroparticlesinnormalpregnancyandpre-eclampsia[J].Placenta,2008,29SupplA:S73-77.[11]CunninghamFGLK,BloomSL,SpongCY,DasheJS,HoffmanBL,CaseyBM,80 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第三军医大学博士学位论文文献综述滋养细胞碎片在子痫前期中的研究进展摘要：正常妊娠时胎盘持续脱落各种大小不等的滋养细胞碎片到母体血循环中，子痫前期时滋养细胞碎片的脱落明显增加，可能参与子痫前期的病理生理过程。滋养细胞碎片主要包括合胞体节、合体滋养细胞微粒和滋养细胞外泌体，本文就滋养细胞碎片在子痫前期中的相关研究作一综述。关键词：合胞体节，合体滋养细胞微粒，合体滋养细微泡，外泌体，子痫前期子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种多系统功能紊乱的重要产科并发症，几乎仅在人类妊娠过程中发生，严重影响母婴近期和远期的健康，是孕产妇和围产儿发病及死亡的主要原因之一。我国内陆每年约700万孕妇发病，全球每年约7万孕妇死于PE。[1][2]迄今为止，PE的发病机制仍不清楚，由于葡萄胎、宫外孕也可发生PE，因此胎儿不是引起PE发病的必要因素，而胎盘娩出后PE相关的一系列临床症状迅速消退，表明胎盘是PE发生发展的充分和必要条件。学术界广泛接纳的PE发病两阶段学说明确了胎盘源性不良因子的释放是PE发病的关键病理生理过程。滋养细胞碎片是一类重要的胎盘源性因子。人类胎盘与母体血液直接接触的部分完全被合体滋养细胞所覆盖，滋养细胞碎片从胎盘脱落到母体血液中的行为贯穿于整个孕期，碎片大小范围从多核[3,4]的合胞体节到纳米级别的滋养细胞外泌体。1893年，德国病理学家Schmorl首次在死亡的子痫妇女肺内发现了滋养细胞碎片。20世纪60年代初期，Attwood和Park[5]进一步证实了发生PE或子痫妇女胎盘脱落滋养细胞碎片的数量明显多于正常妊娠。推测滋养细胞碎片与子痫前期的发病密切相关。滋养细胞碎片按照大小主要分为合胞体节、合体滋养细胞微粒和滋养细胞外泌体，本文就这三类滋养细胞碎片在子痫前期中的相关研究综述如下。1.合胞体节与子痫前期[6]合胞体节，又称合胞体芽、合胞体簇以及合胞体碎片等，目前被认为是胎盘脱落的最大的滋养细胞碎片，合胞体节的大小与核内容物各不相同，长度波动在23-366un，直径波动在16-171um，合胞体节通常包含20-50个细胞核，多达数百个，[5,7]少至2-3个细胞核。早孕期胎盘体外培养产生的大部分滋养细胞以凋亡样死亡的方85 第三军医大学博士学位论文式脱落形成，小部分表现为坏死样。合胞体节从胎盘脱落是滋养细胞生命周期的最末阶段，正常妊娠时合胞体的脱落是合体滋养细胞凋亡样细胞程序性死亡的过程。一旦从胎盘表明脱落下来，合胞体节随着子宫静脉运输到下腔静脉，通过心脏进入肺动脉。由于合胞体的体积较大，容易阻塞于较小的肺血管里。早在妊娠第6周就可从母体外[5][8]周血中获得合胞体节。Johansson等检测了同一个妇女的子宫静脉与外周血中的滋养细胞碎片，结果显示子宫静脉中合胞体节以及其他的滋养细胞碎片的数量明显高于外周血，明确了大部分的合胞体节阻塞在肺血管内。目前不清楚到底有多少合胞体节从胎盘脱落，引证较多的数据显示正常妊娠时，每天大约有10万-15万个合胞体节自[5][7]胎盘脱落。Abumaree等推测妊娠12周的胎盘每天可以脱落10万个单核的滋养细胞和4.7万个合胞体节，孕9月的胎盘平均每天脱落180万个单核的滋养细胞和85万个合胞体节。研究表明每毫升子痫患者的子宫静脉血中平均有1-3个合胞体节，最多[9][5]不超过13个。也有人推测足月胎盘每天脱落的滋养层物质多达3.1g。PE患者子[9]宫静脉血中的合胞体的数量增加了近20倍。正常妊娠中合胞体持续脱落，PE患者体内的脱落明显增加，提示合胞体节在PE发病中可能发挥重要作用。由于大部分的合胞体节阻塞于母体肺小血管中，很难从体[7]内获取合胞体用于科学研究。2006年，Abumaree等发明了一种体外制备合胞体节的模型：将早孕的胎盘绒毛外置块放在Netwell嵌套培养皿中，加入DMEM/F12、胎牛血清，表皮生长因子、胰岛素和hCG等，于37℃，5%CO2培养72小时。每一个Netwell嵌套底部有一个400µm的筛孔，允许培养物中的滋养细胞碎片脱落后自由通过筛孔进入下一层小室中，每24小时轻轻摇晃一下培养皿，并将培养物转移到新的Netwell嵌套培养皿后，收集原来的含滋养细胞碎片的下层培养液，480g离心8分钟，得到的沉[8]淀用210µLPBS重悬。通过这模型制备的合胞体节，形态学上与之前报道的相似。脱落的合胞体节的性质类型(凋亡或坏死)取决于胎盘合体滋养细胞的死亡方式。正常妊娠时，合胞体节主要以程序性、凋亡样细胞死亡的方式脱落，而病理状态如PE[10,11]时，细胞死亡方式发生改变，导致坏死型合胞体节脱落增加。妊娠早期胎盘绒毛[7,体外培养研究表明，大部分滋养细胞的死亡方式为凋亡，仅约5%滋养细胞发生坏死12]。目前认为在正常妊娠时，脱落至母体血循环中滋养细胞的性质(凋亡或坏死)处于一种平衡状态，但不清楚发生PE时凋亡和坏死滋养细胞碎片所占的具体比例，一般认[13]为氧浓度可影响二者之间的平衡。Huppertz等选取早孕末期和晚孕(孕38-40周)的胎盘绒毛，分别在2%，6%，18%氧浓度条件下进行体外培养，通过免疫定位增殖标记物Mib-1、凋亡抑制剂Bcl-2、促凋亡因子caspase3、cytokeratin18抗体结合位点，以及86 第三军医大学博士学位论文TUNEL检测等方法，评估滋养细胞凋亡和坏死的状况，结果表明低氧(2%氧浓度)阻碍了合胞体的融合，从而阻断了合体滋养细胞的凋亡进程，滋养细胞更新的方式从凋亡转向了坏死，故脱落到母体血循环中的合胞体碎片以坏性型为主。PE的病理基础是胎[14]盘缺氧，推测PE是以坏死型滋养细胞碎片脱落为主。然而，Chen等的研究得出不同的结论，对孕早期的胎盘在1%、6-8%或20%氧浓度下进行体外培养，并没有发培养基中脱落合胞体节的数量与性质有明显变化，两种氧浓度培养时，9种促炎性因子和炎症抑制因子的分泌无明显差异，包括IL-1β,IL-4,L-6,IL-8,IL-10,IL-17A,IFNγ,TGFβ1和[15]TNFα。Pilalis等研究也表明妊娠早期胎盘的氧环境本身不是导致PE发病的必要条件。而将IL-6、TNFα、TGFβ1或抗磷脂抗体与早孕胎盘绒毛外置块共培养，坏死型滋[16,17]养细胞碎片的脱落明显增。进一步的研究表明合体滋养细胞通过抗原依赖方式吞入抗磷脂抗体，后者调节线粒体死亡，导致坏死型滋养细胞碎片脱落增加，活化母体[18]内皮细胞参与PE的发病过程。Attwood和Park在产后3天死亡者的产妇肺内可见到大量的滋养细胞肺，而产后15天死亡的患者肺内并没有发现滋养细胞，认为脱落滋养细胞在母体肺内的寿命约为3天，不超过2周。同时，孕妇外周血循环中的滋养细胞碎片明显少于子宫静脉中，推测机体存在着一个快速清除脱落滋养细胞碎片的机制，即合胞体节被某种特殊的溶解剂[19]清除，然而缺乏体内证据来证实该溶解剂的存在。脱落的滋养细胞可能经过吞噬作用而被清除。合体滋养细胞微粒和外泌体由于体积较小可以通过肺小血管到达母体外[20]周血中，与吞噬细胞接触被迅速清除。滋养细胞及合胞体节由于体积较大阻塞于肺内，可能被肺内的吞噬细胞如巨噬细胞清除。然而，大部分的肺巨噬细胞出现在肺泡[19]中而非肺血管中。因此，肺毛细血管中有非专职的吞噬细胞参与了这个过程，体外实验表明内皮细胞具有吞噬滋养细胞和合胞体节的能力，并且吞噬了凋亡的滋养细胞后内皮细胞不受影响，而吞噬了坏死的滋养细胞可上调细胞间粘附分子ICAM-1的表达[21]和促炎性因子IL-6和TGFβ1的释放，进而导致内皮细胞活化。体内的合胞体节是由凋亡型与坏死型合胞体组成的混合物，内皮细胞吞噬了坏死的合胞体节会被活化，进一步的研究表明，内皮细胞吞噬了凋亡的合胞体节后会抑制坏死型合胞体节对内皮细[22]胞的活化作用，这可能解释了在正常妊娠时，即便体内含有少量的坏死滋养细胞碎片，母体内皮细胞仍不会被激活，对于正常妊娠母体血管的适应性方面有重要意义。[5]此外，坏死型合胞体节还可抑制内皮细胞增殖。PE的发病与坏死型合胞体脱落增加有关，然而这些合胞体节由于体积较大几乎阻塞在肺毛细血管内，其引起PE广泛性血[23]管内皮损伤的机制有待研究。Chen等吞噬了坏死合胞体节的内皮细胞培养基处理新87 第三军医大学博士学位论文鲜的内皮细胞，测定后者的细胞增殖及死亡情况等，结果显示处理后新鲜血管内皮细胞的增殖明显被抑制，但不会引起内皮细胞死亡，同时内皮细胞表面的内皮因子表达下降。推测内皮细胞吞噬了坏死滋养细胞碎片后，分泌可溶性的细胞因子从而导致全[24]身性内皮功能障碍。最近，Shen等体外研究显示来源于PE患者的胎盘滋养细胞碎片[25]和血清均可导致血管内皮活化。2013年，Lau等体内实验支持坏死性滋养细胞碎片促发PE临床症状的理论：冻融法制备坏死型Jeg-3滋养细胞碎片，于孕6天开始每天经静脉导管注射Wistar大鼠直至分娩，结果表明坏死型Jeg-3滋养细胞碎片可使大鼠孕晚期血压升高。2.合体滋养细胞微粒与子痫前期合体滋养细胞微粒(syncytiotrophoblastmicroparticles,STBM)是妊娠过程中，由胎盘合体滋养细胞凋亡或被激活后释放到母体血液循环中的一类带膜囊泡状亚细胞结[26]构，大小各异(直径30-1000nm)，占血浆总微粒的1.5%-3%。最早由牛津大学团队开启STBM领域的研究，近年来不断有来自世界各国的团队致力于STBM相关研究，文献报道STBM的命名也不尽相同，常见的有合体滋养细胞微粒(syncytiotrophoblastmicroparticles,STBM)、合体滋养细胞微绒毛膜(syncytiotrophoblastmicrovillous[27][28]membrane,STBM)、合体滋养细胞微泡(syncytiotrophoblastmicrovesicles,STBM)[29]和合体滋养细胞外囊泡(syncytiotrophoblastextracellularvesicles,STBM)。正常妊娠过程中，胎盘释放STBM的行为是一种生理现象，可引发母体适度的炎[28]性反应和生理性高凝状态等，利于正常妊娠的维持，但PE患者血循环中的STBM水平显著高于正常孕妇，其增高程度与病情轻重呈正相关，在早发型PE中上调更明[30-32]显，PE患者体内超量出现的STBM可导致母体过度的炎性反应和血管内皮损伤，从而导致PE的一系列临床表现。然而，PE患者STBM脱落上调的机制及其确切的致[27]病机理尚不清楚，杨等以细胞内信号通路为切入点，发现sPE胎盘组织RhoB及其下游分子ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表达上调与STBM脱落上调呈正相关，推测RhoB/ROCK信号通路可能在sPE合体滋养细胞微丝骨架断裂及重组过程起关键作用，参与调控STBM的脱落。目前主要从血浆/血清和胎盘来源的STBM展开STBM在PE中的功能研究，但由于STBM在外周血循环中占的比例低、大多与内皮细胞或单核细胞等结合，限于当前的技术方法，难以分离出游离的STBM用于实验研究，已报道的血清/血浆来源的微粒是循环中的总微粒，不能完全代表STBM的功能特性。因此，从胎盘尤其是PE患者的胎盘组织中体外制备出的STBM用于其功能研究更为恰当，归纳已报道的四种STBM体外制备方法：88 第三军医大学博士学位论文(1)机械法(mechanicaldissection,mSTBM)：该方法是Smith等在1974年发表于NATURE的经典方法，采用机械剪碎结合差速离心方法从胎盘绒毛组织中分离制备STBM。1993年牛津大学Smarason等在此基础上加以改进并在其后期研究中广泛运用[33][34]，2005年瑞士Gupta等对前面两者的方法稍加改进，即：绒毛组织经PBS(含100mMCaCl2)清洗3遍后剪碎，加入含1%双抗的0.15MNaCl溶液100ml，4℃搅拌过夜后采用三步离心法收集上清液：第一步将绒毛组织和NaCl混合溶液转移到离心管中，以1000g转速离心10分钟；第二步吸取上清液，弃离心管底沉淀物，上清液再以10000g转速离心10分钟；第三步再吸取上清液，弃管底沉淀物，以70000g转速离心90分钟，最后弃上清，离心管底的乳白色沉淀即为合体滋养细胞微粒，PBS洗[35]涤后重悬于1ml含5%蔗糖的无菌PBS液中。国内上海交通大学刘艳慧等2011年建立的体外制备方法与之相比至少有三处不同：未添加双抗；离心方法略有不同(最后一步超速离心采用100000g离心60min)；STBM保存方法不同(重悬于不含蔗糖的无菌PBS液中)。本课题组研究团队还运用该方法成功制备出了高水平的小鼠STBM，为后[36][28]续研究奠定实验基础。典型的mSTBM制备方法可产生25-100mg微粒。(2)胎盘绒毛小叶灌注法(placentalperfusion,pSTBM)：采用了双重胎盘灌注系统，分别对绒毛小叶的胎儿面和母体面采用不同的灌注液不同的流速进行灌注，收集母体面灌注液离心得到pSTBM。英国牛津大学团队、瑞士巴塞尔大学团队以及耶鲁大学医学院团队分别运用了该方法进行研究，三者所使用的灌注液组成、液体流速及离心速[28,34,37-40]度等方面略有差别。典型的pSTBM制备方法可产生25-50mg微粒。(3)胎盘绒毛组织块培养法(explantculture,eSTBM)：包括对早孕和晚孕末期胎盘[13,28,34]绒毛组织块的培养，有常氧也有低氧培养模式，多采用DMEM/F12混合培养液，不同团队培养液的构成稍有区别，比如牛津大学团队在DMEM/F12的基础上添加了10%胎牛血清、1%双抗及L-谷氨酰胺等，而巴塞尔大学团队则添加的是10%小牛[41,42]血清、1%双抗、25IU/ml肝素及50U/ml抑肽酶等。典型的eSTBM制备方法可产生0.2-0.4mg微粒。(4)滋养细胞系来源：目前报道的用于体外制备STBM的滋养细胞系有人早期妊娠绒毛细胞滋养细胞系HPT-8，以及美国模式菌种收集中心(ATCC)编号CRL-1584的滋[43,44]养细胞系，均收集细胞培养上清液，采用三步离心法制备STBM。mSTBM方法最简单，早期研究多采用该方法。2005年Gupta对mSTBM、pSTBM和eSTBM三种方法进行了比较，认为三种制备方法均可得到形态学相似的STBM且都表达合体滋养细胞特异性蛋白-胎盘碱性磷酸酶，然而不同制备方法得到的STBM功89 第三军医大学博士学位论文能各异，比如mSTBM对内皮细胞增殖的抑制程度最强，可能引起坏死微粒的释放，更接近于PE病理状态下胎盘释放的坏死微粒；而eSTBM和pSTBM可能更接近于正常生理状态下胎盘更新所释放的凋亡微粒，更能代表体内过程，故部分研究者后期多[13,34,35]采用这两种制备方法。利用滋养细胞系制备的STBM，其表型与胎盘及人体外周血中的STBM相比，可能已发生了改变，该方法能否反应生理及疾病状态下的相关过程，还有待进一步证实。此外，对于体外制备的STBM形态学及免疫来源的检测和鉴定也是一个重要的研究领域，目前常用的研究方法包括：(1)电子显微镜：STBM的大小是其最重要形态学特征，电镜是测量微粒直径的“金标准”，常用的有透射电镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)和扫描电子显微镜[45](scanningelectronmicroscope,SEM)，且免疫金抗体标记后还能明确其来源，但是该方法耗力、昂贵，且不能定量。(2)流式细胞技术：该方法利用荧光结合的抗体与细胞表面抗原发生反应，或者利用annexinV标记表面化的磷脂酰丝氨酸，不仅可以明确微粒的来源，同时还能快速地对不同来源的微粒进行定量分析，是目前微粒计数的“金标准”。比如用胎盘碱性磷酸酶单克隆抗体(NDOG2)标记微粒，可从孕妇血液中检测出STBM的存在，只是检测到的量极低(90%以上是血小板源性微粒，少量的红细胞、白细胞及内皮细胞微粒)。流式细胞技术也存在缺陷，最主要的问题在于不能辨别直径小于300nm的微粒，因此用[45]该方法检测会丢失相当数量的较小的微粒。Apogee公司生产的A50-Micro流式细胞仪可突破传统流式细仪的检测极限，灵敏度可达80-100nm，分辨率达10nm，是目前微粒研究较理想的一种方法。另外，尽管利用细胞表面标记物的抗体可检测出细胞的来源，但与抗体结合的微粒中含有典型细胞表面抗原的量非常少，可能会限制抗体[46]的结合随之呈现弱荧光而无法检测出来。(3)酶联免疫测定(ELISA)：该方法利用annexinV或细胞表面抗原的抗体(捕获抗体)来捕获微粒，接着用表面抗原的一个特殊的抗体(检测抗体)进行检测。早在1998[31]年，Knight等首次运用一种称之为“inhouseELISA”的方法来检测母体血浆中游离STBM的水平。ELISA法的优势在于没有微粒大小的限制，可半定量检测生物样本中的微粒水平。局限性在于一次只能对一种抗原进行定量分析，最重要的是不能给出所捕获微粒的大小信息。另外，还可用Westernblotting检测微粒膜表面特异性表达蛋白来验证微粒的存在。(4)纳米颗粒追踪技术(nanoparticletrackinganalysis,NTA)：该方法的基本原理是激光束穿透样本和颗粒后经光的散射在光学显微镜下显像，通过连接的视频图像和NTA90 第三军医大学博士学位论文软件追踪每一个颗粒的布朗运动，利用颗粒的扩散系数计算其大小和总的浓度。NTA[46]可直接、实时的显影并分析同一液体中大小在25-1500nm的颗粒，能克服上述几种检测方法的一些不足之处。传统的NTA方法能准确的测量颗粒的大小及浓度，但是不能检测其表型和细胞来源，且在微粒的绝对定量、检测方法的可靠性与重复性等方面尚不明确。因此，研究者在NTA的基础上添加了荧光性能，可通过量子点标记的特异性抗体或荧光细胞追踪肽来检测胎盘组织或血浆中不同细胞来源的小囊泡，称之为荧光纳米颗粒追踪技术(FluorescenceNTA,F-NTA)，是高速检测囊泡大小、浓度、生物[47][48]化学组成及来源较为合适的方法。Dragovic等将F-NTA用于检测胎盘体外制备的大小不同的微泡。然而，由于荧光强度显著高于光散射的强度，F-NTA对胞外体大小范围小囊泡的检测更加灵敏，且该项技术复杂，检测过程中样本稀释会明显减少较大囊泡(直径大于500nm)的数量，若仅着眼于凋亡小体等较大的囊泡的相关研究，流[45]式细胞技术可能优于NTA。研究表明不同体外制备方法得到的STBM功能特性不尽相同。目前对于STBM在PE中的功能研究主要从探讨STBM对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、中性粒细胞和外[13,31,46,47,周血单个核细胞(PBMC，包括单核细胞和淋巴细胞)等靶细胞的作用效应展开49-51]，归纳STBM致PE发病的可能机制包括：(1)血管内皮损伤：体外实验表明，由胎盘脱落释放进入母体血液循环的STBM可作用于外周血管，直接或间接损伤血管内皮，且不同制备方法得到的STBM对血管内皮的作用也有差别。来自正常妊娠和PE患者胎盘的mSTBM均可抑制HUVEC增殖并破坏其单层结构，且两种来源的mSTBM对内皮细胞增殖的抑制程度相当。正常胎盘的mSTBM还可干扰皮下小动脉的舒张功能、诱导HUVEC凋亡，但不改变HUVEC基因的表达，该mSTBM与HUVEC共培养后，还可活化外周血淋巴细胞及粒细胞，[33,52-55]使其产生ROS增加，mSTBM与中性粒细胞长时间共培养(超过24小时)所产生[56]的大量脂质过氧化物，可造成母体内皮细胞的损伤。然而用甲基β环糊精处理mSTBM使其脂质水平降低后，mSTBM对HUVEC增殖的抑制程度降低，同时诱导HUVEC凋亡的作用受抑，表明mSTBM中的脂质成分可能参与血管内皮损伤，eSTBM[57]和pSTBM没有这种作用。但eSTBM可以激活中性粒细胞形成胞外菌网(NETs)，导[58]致血管内皮细胞损害。将PE患者血浆微粒同离体的健康孕妇子宫肌层动脉过夜孵[59]育，消除了缓激肽介导的血管扩张反应从而引起内皮功能障碍。在单核细胞与HUVEC共培养体系中加入PE患者的血浆微粒，内皮活化标记物ICAM-1的表达显著增加，究竟所有的血浆微粒亦或仅仅是某一特殊亚型微粒(比如STBM)引起的这一效91 第三军医大学博士学位论文[60][61]应，还有待进一步研究证实。Rajakumar等也证实，晚孕期母体血浆中的sFlt1至少有25%是与STBM相结合的，可参与损害母体脉管系统导致PE的发生。(2)促炎症反应：与未孕状态相比，正常妊娠呈现轻度的全身性炎症反应，而PE则以过度的炎症反应为特征，STBM参与母体的这一炎性反应过程，且不同制备方法得到STBM的促炎性反应效能不同。正常胎盘来源的pSTBM与健康未孕妇女PBMC[62]共培养，可刺激后者产生大量的促炎症因子，如TNF-α、IL-12p70和IL-18。Lee等分别将低氧(鱼藤酮诱导，模拟PE缺氧状态)和常氧(正常妊娠)条件下滋养细胞系源性的STBM与健康未孕妇女PBMC共培养，48小时后，与常氧STBM共培养的PBMC较单独培养的PBMC释放更高浓度的炎症因子IL-6，而与低氧STBM共培养的PBMC在培养后24小时、48小时所释放IL-6和TNF-α均明显高于常氧STBM组，提示STBM[43]直接参与母体炎性反应，且发生PE时STBM可介导产生更强烈更快速的炎症反应。[41]同时，瑞士巴塞尔大学的Messerli等体外研究STBM对于健康男性外周血单核细胞的炎症反应特性，运用了四种制备方式得到的微粒：mSTBM、pSTBM、eSTBM(分为20%O2条件的eS20和3%O2低氧条件的eS3)，结果表明mSTBM和eS3的STBM仅仅影响单核细胞的表型而不能诱导其促炎性反应，相反，pSTBM和eS20的STBM可促进细胞粘附分子CD54表达上调，同时还可诱导产生IL-8、IL-6和IL-1β，且细胞因子的产生呈时间和剂量依赖性，故认为在正常妊娠和PE时，STBM可激活单核细胞，且STBM在PE患者血循环中数量更多，可引起母体过度的炎症反应。(3)免疫作用：母胎界面的免疫耐受失衡很可能是PE的病因和发病机制中的重要环节，其中Th1/Th2型细胞因子在妊娠免疫耐受中的作用研究较为广泛和深入。早期研究显示mSTBM可调节外周血白细胞的活性，其中对粒细胞和单核细胞的活化是由于增加了细胞内钙离子浓度，同时降低了pH值及ROS的释放，而对淋巴细胞的活化[55]作用仅仅是通过增加ROS的释放。而pSTBM方法得到的不含STBM的上清液(VE-CM)可降低外周血T淋巴细胞的活化效应，减少T淋巴细胞增殖和细胞因子IL-2[63]及INF-γ的产生，但不会导致T淋巴细胞的凋亡。Gupta等进一步比较了mSTBM、pSTBM以及eSTBM对外周血T淋巴细胞的作用，发现三者引起T淋巴细胞不同的功能效应：mSTBM和eSTBM可显著抑制T淋巴细胞的活化、增殖以及细胞因子IL-2和INFγ的释放，而pSTBM显著诱导T细胞的增殖同时轻度增加细胞因子INFγ的释[64]放；三种制备方法得到的STBM都不会导致T细胞的凋亡，这与前期Gercel-Taylor的结论相反，后者研究表明正常中孕期妇女血清来源的STBM可诱发Fas-L介导的[65]JurkatT淋巴细胞凋亡，导致相反观点的原因可能在于：一方面JurkatT淋巴细胞系92 第三军医大学博士学位论文本身对于促凋亡信号高度灵敏，另一方面血清来源的STBM可能混杂有母体源性的微[28]粒，其质量可能不同于胎盘源性STBM。此外，Southcombe等更深入地探讨了mSTBM、pSTBM以及eSTBM对非孕和正常晚孕妇女PBMC的作用，表明pSTBM可结合到单核细胞和B细胞上，引起细胞因子TNFα,MIP-1α,IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8的释放，尤其是TNFα和IL-6释放的量在孕妇中明显增加。eSTBM呈现出与pSTBM相似的效应，但mSTBM没有此反应。同时pSTBM还可抑制Th1型因子IP-10的表达，有利于正常妊娠时的血管发生和Th2型免疫偏移。用低氧条件下制备的STBM模拟PE状态所产生的STBM，也可明显促进PBMC释放Th1细胞因子TNF-α，提示STBM可通过上调PBMC中Th1型细胞因的表达，使Th1/Th2比率平衡倾向于Th1型免疫反应，从而导致PE。既往有研究表明母血中的STBM与可DC相互作用，同时导致DC产生大量TNF-α和IL-12，而IL-18和IFN-γ的生成减少，使DC分化、成熟而发挥免疫效应，提示STBM可能是通过与DC的相互作用引起孕晚期母体的免疫-炎症反应[66]。(4)遗传信息的媒介作用：体外制备的STBM囊泡包含胎儿DNA和RNA，且[67]eSTBM中胎儿DNA表达水平最高，pSTBM中胎儿RNA表达水平最高。2003年[68]Ng等也提出母体血浆中包含来自胎盘表达基因中的mRNA转录子，且由于这些转录子存在于小囊泡中而免遭降解。(5)凝血功能：微粒的促凝功能已十分明确，现有的研究提示STBM可通过影响凝[69]固-纤溶系统参与PE的发病。pSTBM可表达组织因子(TF)，低水平的活性组织因子经STBM脱落至母体循环，这可能显示了正常妊娠时生理性的促凝状态；当STBM脱落增加，其荷载的较高水平的TF可能启动外源性凝血途径，导致PE患者凝血功能障[38]碍，同时由于胎盘绒毛间隙低剪切力，一些荷载了TF的STBM可能聚集在此并启[70][37]动了胎盘局部的凝血作用。与此同时，Gulle等研究也表明pSTBM中纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)1和2的水平较高，且二者在PE的pSTBM中表达水平更高，推测STBM可能通过改变母胎界面的纤溶平衡参与PE的病理生理过程，但其具体的作用机制仍未阐明。本课题组前期通过STBM回输同种C57小鼠，初步构建了子痫前期动物模型，证实了外周循环中超量存在的STBM可作为成为诱发PE的关键独立因素。该模型凝血指标检测发现PT缩短，HE染色发现胎盘纤维蛋白沉积，提示STBM可能导致机体的凝血-纤溶失衡，STBM回输同种小鼠前若用肝素预处理，小鼠则不会发生抽搐(数据待发表)，进一步提示凝血异常在PE的发病中具有重要作用，STBM可能作为一种促凝因子启动机体外源及内源性凝血途径，从而诱发PE。93 第三军医大学博士学位论文3.滋养细胞外泌体与子痫前期滋养细胞外泌体(syncytiotrophoblastexosomes,STBE)是脱落至母体血循环中较小的一种滋养细胞碎片，由胞内多囊泡体以逆出芽的方式分泌，直径约30～100nm。文[3,71,72][48][73]献报道滋养细胞外泌体的来源主要孕妇血浆、胎盘和滋养细胞系，均以超速离心法为基础体外制备。以Swan71滋养细胞系外泌体的制备为例，400g离心10min去除完整的细胞，15000g离心20min去除细胞碎片，使用AmiconstirredcellModel8200超滤(分子量截断值500000Da)，100000g离心90min，PBS重悬(经0.22um过滤)。培养基FBS加入DMEM/F12后超速离心100000g离心15小时去除FBS相关的外泌体。电镜形态[74]学检测，大小50-200nm，密度1.134-1.173g/ml。滋养细胞外泌体在细胞间信号中发挥重要作用，可载运滋养细胞来源的miRNA1。滋养细胞外泌体表达非经典的MHC相关分子MICA/B和RAE-T1/ULBP1-5，后者是NK细胞受体NKG2D的配体，滋养细胞外泌体通过下调NK细胞主要的活化受体NKG2D，抑制NK细胞毒性发挥免疫抑制作用[75][3]。此外，滋养细胞外泌体可抑制T细胞信号途径，Taylor等从足月分娩妇女胎盘中分离得到的外泌体与JurkatT细胞孵育，发现增加了T细胞对CD3-ζ和JanusKinase(JAK3)的抑制作用。进一步的研究表明胎盘外泌体抑制T细胞表达CD3-ζ是由于胎盘外[73]泌体上呈现了程序性死亡样分子1(ProgrammedDeathLike-1,PD-L1)和FasL分子。许多研究表明，胎盘来源的外泌体具有抑制剂或免疫抑制的作用，形成一个胎儿[76]逃避母体免疫系统的机制。来源于Swan71滋养细胞的外泌体诱导单核细胞迁移并增加细胞因子的产生，因此影响孕期的细胞因子环境。荧光显微镜证实，与单核细胞共培养中，8-10%的Swan71来源外泌体在20分钟内就被单核细胞吞噬，这种摄取导致单核细胞的迁移和巨噬细胞的分化均以一种剂量依赖式增加，且明显增加了IL-1β,IL-6,纤溶酶原激活物抑制物1,粒细胞集落刺激因子，粒细胞/单核细胞集落刺激因子和TNFα的生成。研究表明滋养细胞来源的外泌体具有募集单核细胞的能力，并以一[73]种非细胞接触的方式“驯化“单核细胞产生促炎性细胞因子/趋化因子。综上，合体滋养细胞外泌体对于维持正常妊娠的母胎免疫耐受有重要的调节作用。PE表现为免疫耐受失衡，合体滋养细胞外泌体可能在PE的发病中发挥一定作用。基于目前的技术方法，经体外制备的合体滋养细胞微粒STBM均包含有滋养细胞外泌体STBE，二者在形态、密度和生物学功能等方面可能都有重叠与交叉，结合目前细胞外囊泡研究的进展，我们倾向于用合体滋养细胞细胞外囊泡(syncytiotrophoblastextracellularvesicles,STB-EVs)来囊括合体滋养细胞微粒和外泌体。94 第三军医大学博士学位论文4.展望体外研究表明合胞体节、合体滋养细胞微粒和外泌体与PE的发病密切相关，但体外制备的这些滋养细胞碎片能否反应真实的体内过程、滋养细胞碎片的成分构成以及在体内致PE发病的关键致病因子及其作用机制尚不清楚。如能解析并获得滋养细胞碎片关键的致病因子，对其加以干预和阻断，将为PE的临床治疗提供新的思路与策略。正常妊娠母体循环中STBM与STBE的数量可能存在一个平衡。STBM的数量一定超过外泌体的数量，符合正常妊娠时的轻度全身炎性状态。然而，目前不清楚生理状态下这个比率的上限，也不清楚高于这一比率限定多少会发生病理变化。明确正常妊娠时STBM与STBE比值的正常范围，将为子痫前期、复发性流产、不孕等疾病的诊断与治疗提供新的策略。然而，由于STBM与STBE在外周血中所占的比率较低、两者在物理特性及生物学功能等方面存在交叉与重叠，且目前缺乏辨别外泌体、微泡/微粒与[77]凋亡小体的特异性囊泡标志物和标准统一的体外制备流程，还不能完全将二者从外周血中分离纯化出来，期望随着生物医学相关技术的发展和特异标志物的不断增加，尽早突破这些难关，为妊娠相关疾病的研究提供保障。此外，目前仍缺乏能复制出子痫前期病理生理过程的理想动物模型，以滋养细胞碎片为基础构建实验动物模型正在摸索中，期待出现一种新的动物模型为进一步阐明PE的病理生理过程、发展新的临床治疗策略提供新的研究方向和直接的实验依据。95 第三军医大学博士学位论文参考文献96 第三军医大学博士学位论文97 第三军医大学博士学位论文98 第三军医大学博士学位论文99 第三军医大学博士学位论文100 第三军医大学博士学位论文101 第三军医大学博士学位论文102 第三军医大学博士学位论文103 第三军医大学博士学位论文攻读博士学位期间的研究成果1.LiH,HanL,YangZ,HuangW,ZhangX,GuY,LiY,LiuX,ZhouL,HuJ,YuM,YangJ,LiY,ZhengY,GuoJ,HanJ,LiL.Differentialproteomicanalysisofsyncytiotrophoblastextracellularvesiclesfromearly-onsetseverepreeclampsia,using8-PlexiTRAQlabelingcoupledwith2DnanoLC-MS/MS[J].Cellularphysiologyandbiochemistry,2015,36:1116-1130.2.HanL,LiuX,LiH,ZouJ,YangZ,HanJ,HuangW,YuL,ZhengY,LiL.Bloodcoagulationparametersandplateletindices:changesinnormalandpreeclampticpregnanciesandpredictivevaluesforpreeclampsia[J].PLoSOne,2014,9(12):e114488.3.HanL,YangZ,LiK,ZouJ,LiH,HanJ,ZhouL,LiuX,ZhangX,ZhengY,YuL,LiL.Antepartumorimmediatepostpartumrenalbiopsiesinpreeclampsia/eclampsiaofpregnancy:newmorphologicandclinicalfindings[J].Internationaljournalofclinicalandexperimentalpathology,2014,7(8):5129-5143.4.张欣,李红梅,李怡琳,周丽娟,李银锋,顾焱,韩健,韩磊,郑英如,郭建新,李力.胎盘合体滋养细胞微粒注射对孕鼠肾功能和病理形态损伤的研究[J].第三军医大学学报,2015,37(20):2043-2046.5.李力,李红梅.子痫前期终止妊娠与转运[J].中华产科急救电子杂志,2013,2(3):178-181.6.周丽娟,韩磊,韩健,李红梅,杨志玲,张欣,顾焱,李银锋,俞丽丽,易萍,郑英如,李力.缺氧对人滋养细胞MAP4蛋白表达及微管结构的影响[J].中华高血压杂志,2015,23(1):20-21.7.刘晓洁,韩磊,韩健,俞丽丽,李红梅,周丽娟,张欣,廖茜,李婵玉,颜耀华,郑英如,易萍,刘宿,李力.子痫前期孕妇凝血功能及血小板变化的研究[J].第三军医大学学报,2014,39(9):962-965.8.李怡琳,韩健,刘晓洁,韩磊,俞丽丽,李红梅,周丽娟,张欣,郑英如,郭建新,李力.小鼠合体滋养细胞微绒毛膜制备方法的研究[J].重庆医学,2013,42(12):1330-1331.104 第三军医大学博士学位论文致谢三年半的博士学习光阴转瞬即逝，回首求知学径心怀感恩，体会家人朋友关心理解倍感亲切！由衷感谢我的博士导师李力教授，博士入学后，导师从基础理论开始，到临床诊治、基金申请、课题研究、实验探索、论文撰写等方方面面均给予了耐心细致的指导。一方面，导师的严苛激励、谆谆教诲、垂范示教时刻指引提醒着我，求知学径难，但求真务实、求知问道的目标要坚定不移，做一名优秀妇产科临床医生的初衷不改，漫漫前路经历淬炼探索终将柳暗花明；另一方面，导师自身对学术学问的孜孜以求、对学科专业发展的敏锐把握、对每项课题实验研究的深入悉心、对每名患者问诊及手术的诚恳耐心、对妇产科知识科普推广的耐心投入，都像一面镜子，成为我行医、问学、立身的标尺及镜鉴，时刻提醒我反身自省、问心初衷，特别是在毕业前夕的炎夏，在我读完导师李力教授荣膺中国妇产科顶级荣誉“妇产科好医师·林巧稚奖”新闻报道后的第二天，我看到的不是在鲜花与掌声中走上领奖台的获奖者，而是那位在门诊和病房里为远道而来的焦急病人无限加号的妇产科医生，是略显斑白的发髻下流淌出的辛勤汗水，是一位在平凡岗位上孜孜以求、年逾花甲的崇高军医。在您的悉心指导和言传身教下，这篇博士论文的成稿只是我博士求学路上一个阶段性的句号，而您这些年来的谆谆教导将指引我在妇产科学求知格物的前路上身体力行。再次由衷感谢您，我的好导师！由衷感谢我的师兄韩健博士和其爱人胡炯宇博士在课题研究攻关、实验方案优选、临床实践积累和论文修正发表等方面给予的悉心指导！由衷感谢妇产科郑英如主任、郭建新副主任、易萍副主任、陈竹钦教授、俞丽丽副教授、郑秀惠副教授、张庆华副教授等在课题研究和临床实践中的悉心教导和耐心帮助！由衷感谢颜耀华博士、刘强博士、王全民副主任医师、高爽主治医师、苏萍医师和刘毅医师在临床实践中给予的指导帮助！由衷感谢同门的杨志玲博士、黄威博士、韩磊博士、张欣硕士、周丽娟硕士、顾焱硕士、李银锋硕士、陈建坤硕士、李怡琳硕士、刘晓洁硕士、李婵玉硕士、廖茜硕士、朱书力硕士在课题研究和论文撰写过程中给予的无私帮助！感谢同科深造的崔竞红硕士、黄团明硕士、王婉硕士等全体研究生在学习期间给予的无私帮助！与你们共同求学、学问切磋的过程使我受益良多！105 第三军医大学博士学位论文由衷感谢野战外科研究所七室周元国主任、许雪清副主任、熊仁平老师、彭艳老师、黄治中老师、杨澜老师等在实验研究、数据分析等工作中给予的支持！衷心感谢野战外科研究所三室段朝霞副教授在实验过程中提供的支持与帮助！特别地，由衷感谢我的丈夫黄伟，从你身上，我看到的是一名履职尽责的军人、是一位充满爱心的父亲、是一位温柔体贴的爱人、是一个感恩孝顺的儿子、是一个待人真诚的朋友，是你的默默付出与担当，为我提供了温暖安静的港湾，是你的关心和鼓励，让我能够再次出发完成这次博士学习的追求。还记得在我实验研究、临床实践与论文撰写出现难题困惑的时候，是你在耐心的交流中提醒我：“知易行难、知行合一难上加难”，坚定了我的信念，求知问行的道路上我将执子之手砥砺前行。感谢我的女儿黄璟奕，你的微笑和欢乐是支持我前进的最大动力！感谢我和爱人的父母，是你们远赴重庆给予我们生活和身心上无微不至地照顾和关爱，为我集中精力求学进步提供了有力的保障，我必将不负你们的期许。最后，由衷地感谢所有支持帮助过我的老师、同学、亲人和朋友！106