太平洋鳕发育早期免疫系统相关基因的克隆分析及表达规律的研究

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1、分类号密级UDC编号硕 士 学 位 论 文 太平洋鳕发育早期免疫系统相关基因的克隆分析及表达规律的研究李幸（1212008）指导教师姓名姜志强教授专业名称水生生物学论文答辩日期2015年5月29日学位授予日期2015年7月THSEISFORTHEMASTERDEGREEOFAGRICULTURECloningandExpressionanalysisoftheimmune-relatedgenesintheearlydevelopmentalstageofPacificCod(Gadusmacrocephalus)Supervisor:P

2、rof.ZhiqiangJiangMastercandidate:XingLiMajor:HydrobiologyFisheriesandLifeScienceInstitute,DalianOceanUniversityMay2015摘要摘要太平洋鳕（Gadusmacrocephalus）是我国北方海域重要的经济鱼类。近年来，由于捕捞量剧增，导致其野生资源不断下降。本实验室的太平洋鳕人工繁育技术不断取得突破，但在育苗早期过程中仍会出现仔稚鱼突发性大量死亡现象。为解决这一瓶颈，本实验从太平洋鳕自身免疫系统出发，通过RAG1、IgM和ISG

3、15基因的转录水平来衡量太平洋鳕免疫系统的早期发育特点，以期为人工育苗早期阶段有针对性的做好疾病防疫工作提供理论依据。首先，根据已报道的其它硬骨鱼类的RAG1、IgM和ISG15基因序列的保守区设计兼并引物，以太平洋鳕幼鱼的胸腺和头肾为实验材料，经过基因克隆测序，获得目的基因片段。为研究太平洋鳕发育早期免疫系统形成的机制，本实验建立了绝对荧光定量PCR检测方法，分别对目的基因在太平洋鳕各组织以及发育早期阶段中的表达水平进行了检测。另外，利用WesternBlot技术从蛋白水平对RAG1在组织中的表达差异进行了分析。实验得出结果如下：太平洋

4、鳕RAG1基因cDNA序列长3755bp，包括一个1854bp的ORF，可编码617个氨基酸残基，预测其分子量为69kDa，GenBank序列号为KM408434。太平洋鳕RAG1氨基酸序列与其它鱼类RAG1氨基酸序列比对发现，其同源性高达85%以上。通过荧光定量PCR检测太平洋鳕各组织中RAG1的表达水平结果显示，标准曲线的回归方程以及回归2系数为：y=-3.2662x+33.772，R=0.9961；RAG1只在胸腺和头肾两个器官中有表达，未在肝、脾、鳃、肠以及性腺组织检测到信号，其中在胸腺中的表达水平远高于头肾，而幼鱼胸腺中的表达水

5、平高于成鱼胸腺。WesternBlot结果从蛋白水平验证了RAG1在胸腺中的表达水平远高于头肾。说明太平洋鳕的胸腺是发育早期主要的免疫器官，是RAG1基因表达的主要组织。另外，WesternBlot显示出的蛋白条带分子量为69kDa，从蛋白水平对克隆得到的RAG1序列的准确性加以验证。太平洋鳕IgM重链基因cDNA序列全长1862bp，包括一个1713bp的ORF，可编码570个氨基酸残基，预测分子量为63kDa，Genbank序列号为KM408433。分析氨基酸序列发现，该序列与其它已报道鱼类的序列有高度的同源性。结构上包括一个信号肽（

6、Signalpeptide）、一个可变区（VH）、4个固定区（CH）和一个铰链区（Hinge），其中可变区包括了4个骨架区（FR）和3个互补决定区（CDR）。该IgM属于分泌型免疫球蛋白。荧光定2量PCR标准曲线回归方程和回归系数为：y=-3.249x+32.27，R=0.998；结果显示，IgM在胸腺、头肾、肝、脾、鳃、肠以及性腺中均有表达，其中幼鱼时期的脾脏中表达水平最高，其次是头肾，而成鱼在头肾中的表达水平远高于其它组织。克隆得到太平洋鳕ISG15基因cDNA序列长444bp，可编码85个氨基酸残基。经核酸序列对比发现，该序列只与已

7、报道的3种类型大西洋鳕ISG15序列有同源性，其中最高2同源性达90%。荧光定量PCR标准曲线回归方程及回归系数为：y=-3.158x+33.85，R=I太平洋鳕发育早期免疫系统相关基因的克隆分析及表达规律的研究0.998，其组织差异表达结果显示，ISG15在胸腺、头肾、肝、脾、鳃、肠以及性腺中均有表达，其中幼鱼在脾中表达水平最高，而成鱼的鳃中最高。另外从整体来看，幼鱼体内各组织中ISG15的表达水平要高于成鱼。实验跟踪采集受精卵时期到95dph期间的太平洋鳕仔稚鱼，以分析发育早期阶段鱼体内RAG1、IgM和ISG15的表达规律。结果显示

8、，RAG1和IgM均在61dph时表达水平开始明显升高，到95dph时最高，而IgM的整体表达水平要低于RAG1。ISG15在61dph之前的阶段表达水平较低且很稳定，在95dph时表达水平骤