外源褪黑素对苹果叶片衰老的调控及相关自噬基因的功能分析

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1、分类号：S661.1学校代码：10712UDC：634研究生学号：2009060098密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文外源褪黑素对苹果叶片衰老的调控及相关自噬基因的功能分析学科专业：果树学研究方向：果树育种与生物技术研究生：王平指导教师：马锋旺教授完成时间：2015年5月中国陕西杨凌Classificationcode:S661.1Universitycode:10712UDC:634Postgraduatenumber:2009060098Confidentialitylevel:OpenDissertationforDoctorDegreeNorthw

2、estA&FUniversityin2015RegulationofleafsenescencebyexogenousmelatoninandfunctionalanalysisofrelatedautophagygenesinMalusMajor:PomologyResearchfield:Fruittreebiotech-breedingNameofPostgraduate:PingWangSupervisor:Prof.FengwangMaDateofsubmitted:May,2015YanglingShaanxiChina外源褪黑素对苹果叶片衰老的调控及相关自噬基因的

3、功能分析摘要苹果是世界主要水果之一，在世界果品生产中占有重要地位。西北黄土高原地区是我国最大的苹果生产基地，但该地区降水量少，土壤贫瘠，是制约苹果生产效益的重要因素。长期的干旱胁迫或者营养匮乏会导致叶片的提前衰老，严重影响苹果树体营养，进而影响果实产量和品质。褪黑素是普遍存在于生物体内古老保守的吲哚类小分子物质，具有广谱高效的清除自由基、提高抗氧化系统的能力，改善生物机体对不良环境的适应性。自噬是参与蛋白质和细胞器降解的重要途径，在叶片衰老、营养饥饿和氧化胁迫中发挥着重要的作用。褪黑素在植物中的生物学功能研究还处于起步阶段，苹果自噬基因的发掘和功能研究也鲜有报道。本论文首先研究

4、了外源褪黑素对不同类型苹果叶片衰老的调控作用，从生理学和蛋白质组学层面分析褪黑素延缓叶片衰老的功能；在发现褪黑素调控衰老过程中自噬基因的表达和氧化胁迫下自噬发生的基础上，利用分子生物学手段系统研究了苹果相关自噬基因MdATG8i和MdATG3s的功能，揭示了自噬在叶片衰老和营养饥饿条件下重要的生物学作用，为提高苹果叶片生物学功能和抗逆改良提供理论依据。主要研究结果如下：1.外源褪黑素延缓了黑暗诱导的苹果离体叶片衰老。在黑暗诱导的‘金冠’（MalusdomesticaBorkh.cv.GoldenDelicious）苹果成熟叶片离体衰老过程中，外源10mM褪黑素处理减缓了叶片光系

5、统Ⅱ最大光化学效率（Fv/Fm）的下降和叶绿素的降解，相对抑制了衰老相关基因SAG12和PAO的表达，减少了H2O2含量的积累，提高了抗氧化系统能力，尤其是抗坏血酸-谷胱甘肽循环（AsA-GSHcycle）再生能力，进而延缓了黑暗条件下离体叶片的衰老。2.外源褪黑素延缓了干旱诱导的苹果叶片衰老。以‘寒富’（MalusdomesticaBorkh.cv.Hanfu）苹果两年生盆栽苗为材料，在长期中度干旱胁迫下，向植株根部定期施用100μM褪黑素溶液。结果表明：外源褪黑素处理显著降低了干旱诱导的叶片黄化、叶绿素降解和衰老相关基因SAG12和PAO的表达，减轻了干旱胁迫对光合作用的抑

6、制，维持了较高的叶片光系统Ⅱ的光化学效率，减少了干旱诱导的H2O2的积累，其原因可能是因为褪黑素提高了抗氧化系统中抗氧化物质的含量和抗氧化酶的活性。3.外源褪黑素通过调控能量代谢和蛋白质降解延缓了苹果叶片自然衰老。以平邑甜茶（MalushupehensisRehd.）两年生盆栽苗为材料，研究了根部定期施用100μM褪黑素对叶片自然衰老中能量代谢和蛋白质降解的调控作用。结果表明：长期外源补充100μM褪黑素相对提高了叶片光合速率、光合色素和光合产物（山梨醇、淀粉和蔗糖）含量；延迟了光合产物的降解，使衰老叶片中葡萄糖和果糖的积累降低，抑制了MdHXK1基因表达，进而弱化了触发衰老的

7、糖信号；维持了较高的叶片全氮、可溶性蛋白和Rubisco蛋白含量，其原因可能是褪黑素抑制了自噬途径大部分自噬基因的表达，延缓了蛋白质的降解。蛋白质组数据分析表明，外源褪黑素处理下调了很多在衰老过程中上调的蛋白质，这些差异蛋白主要参与大分子物质的降解和运输等；褪黑素还上调了少量参与氧化胁迫和光合作用的蛋白，显著下调了一些参与基因调控的蛋白，这些蛋白的信息为后续研究褪黑素潜在的生物学功能奠定了基础。4.外源褪黑素预处理拟南芥提高了氧化胁迫下自噬的诱导积累。以拟南芥（Arabidopsisthal