外周血中血脑屏障损伤新型标志物cbmecs检测方法的建立和临床应用

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1、分类号密级ＵＤＣ编号硕壬学位论文外周血中血脑屏障损伤新型标志物ｃＢＭＥＣｓ检测方法的建立和临床应用Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｄｅｔ；ｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＢＢＢｉｎｕｒｂｉｏｍａｒｋｅｒｊｙｃＢＭＥＣｓｉｎｅｒｉｈｅｒａｌｂｌｏｏｄａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌａｌｉｃａｔｉｏｎｐｐｐｐ李妍导师姓名曹化教授专业名称病原生物学培养类型学术型论文提交日期２０１５年５月南方医科大学２０１２级硕击学位论文外周血

2、中血脑屏障损伤新型标志物ｃＢＭＥＣｓ检测方法的建立和临床应用ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＢＢＢｉｎｕｒｙｊｂｉｏｍａｒｋｅｒｃＢＭＥＣｓｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌａｌｉｃａｔｉｏｎｐｐ课题来源：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．８１１７１６４４）学位申请人李妍导师姑若曹虹教授专业違称病原生物学培养类型学术型培养层次硕去所在学院公共卫生与热带匯学学院答辩委员会主席彭涛教授答辩委员会

3、委员董文其教授巧勇宇教授胡静教授张菊梅研究员２０１５年５月１５日广州硕去学位论文外周血中血脑屏障损伤新型标志物ｃＢＭＥＣｓ检测方法的建立和临床应用硕壬研究生：李妍指导教师：曹虹教授摘要一、研究背景一全球范围内中枢神经系统（ＣＮＳ）疾病的致残率直居高不下，有调查显示全世界有１／３的人将会有ＣＮＳ损伤的可能，而且ＣＮＳ损伤的概率随年龄增加而增加。血脑屏障巧Ｂ巧是大脑中枢的天然保护伞，其形态、功能的微小改变皆能给病原入侵中枢神经系统带来可乘之机，ＢＢＢ相关的疾病所致的住院

4、率和预后时间延长均高于其他疾病。实验研究发现，ＢＢＢ的损伤在中枢神经系统感染的发生过程中有关键作用。中枢神经系统疾病往往伴随ＢＢＢ结构和功能的剧烈变化。因此胳视、检测ＢＢＢ的形态、功能的细微变化可Ｗ预测中枢神经系统感染、损伤，对临床早期诊断治疗有重要意义，也成为诊断、治疗、预防ＣＮＳ损伤相关疾病的重要突破点。ＢＢＢ损伤的定量检测曾经是ＣＮＳ损伤检测的难点所在。成功分离和培养脑微血管内皮细胞（ＢＭＥＣｓ，ＢＢＢ的体外模型）使得ＢＢＢ损伤的致病机制研究（感染及药物所致）成为可能。过去几十年间，学者们采用了许

5、多体内实验方法检（测ＢＢＢ的功能：循环血中的蛋白如白蛋白）渗透进入中枢神经系统、中枢神经系统中的蛋白（如Ｓ１００Ｂ）释放入循环血等都用来检测ＢＢＢ损伤。虽然这些技术都利用了内源性蛋白，但是ＢＢＢ的破坏可能并非仅与某些特异性结果引起的蛋白水平改变相关。近来基于分子成像技术的ＭＲＩ在神经科学领域受到广泛。关注虽然学者们在体外实验中使用了许多合成造影剂，但是很少能在活体动Ｉ摘要物脑部得到稳定结果。神经影像技术的最大难题在于显影剂很少能够成功通过ＢＢＢ。其他的技术包括注射染色，如依文思藍染色，注射进入动

6、物模型来检测ＢＢＢ完整性。这些技术的共同缺憾在于它们都不能被无创地运用于人体。近年来的研究发现，外周血中循环肉皮细胞（ｃＥＣｓ）的多少可反映因也血管损伤和免疫疾病而引起的血管内皮损伤程度，该技术因其新颖性和无创性各ｃＥＣ一受关注。大多ｓ定量程序都包括道富集步骤：通过磁珠偶联抗体进行免疫一磁性分离。在外周血中循环的内皮细胞中，些是终极分化的细胞（ｃＥＣｓ），另一些是前体样细胞外（ＥＰＣｓ），ＥＰＣｓ可能参与诱导引导至祀位点的新血管形成。这些文献更多的讲述ｃＥＣｓ在病理条件下被大量检测到，ｃＥＣｓ可作为血管损

7、伤性疾病或某些免疫相关疾病的标志物一。由此我们得到启发，既然ＢＢＢ主要由种特殊的内皮细胞（ＢＭＥＣｓ）組成，那么ＢＢＢ受损后，脱落至循环中的ＢＭＥＣｓ，即ｃＢＭＥＣｓ，可Ｗ看做是ＢＢＢ损伤的生物标志物。基于ＢＢＢ损伤和ＣＮＳ的长期研究，我们假设ｃＢＭＥＣｓ有成熟的ＢＢＢ细胞型，在ＣＮＳ的病理改变的脑微血管结构中动态脱落。外周血中的ＢＭＥＣｓ可Ｗ用实验手段进行检测，作为提示ＢＢＢ损伤的生物标志物。二、研究方法１、磁珠活化与ＵＥＡＩ相偶联吸附外周血内皮细胞－称取粘附素ＵＥＡＩ溶于０．５ＭｐＨ９．５测酸盐

8、缓冲液中，Ｗ〇．２ｎｉｇ／ｍｌ比例震荡Ｓ。ｘ至充分溶解加入等体积的浓度为４ｌ〇／ｍＬ的免疫磁珠，充分混匀后，置于室温充分地颠倒震荡－，摇动解育２４小时，使免疫磁珠ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ４５０Ｔｏｓｙｌａｃｔ