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＾京诚和皆ｆ戌硕±研究生学位论文北京协和医学院研究生院 学校代码：１００２３学号：Ｓ２０口０１８００５硕±学位论文人群曲清中抗流感病毒中国流行株抗体水平研究ＳｔｕｄｙｏｎａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌａｇａｉｎｓｔＣｈｉｎａｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｓｉｎｏｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍｐｐ所院：医学生物学研究所姓名；郭埼指导教师：廖国阳研究员导师小组：寸怡娜李卫东马磊学科专业；细胞生物学研究方向：病毒疫苗完成日期：２（Ｕ５年５月１８日 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文目录摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ２一第部分人群血清中抗流感病毒中国流行株抗体水平研究４胃４目Ｕ１．实验材料与方法５１．１实验材料５１丄１病毒５１丄２鸡胚６１丄３试剂和耗材６１丄４仪器设备６１丄５血清７１．２实验方法７１．２．１病毒的培养７１．２．２病毒液的初步纯化７１．２．３血清的采集及保存７１．２．４血清的预处理８１．２．５血凝抑制实验８８１．２．６质量控制１．２．７统计学分析９２．实验结果及分析９２９．１研究所采集样本的怠体情况２丄１研究所用样本性别情况分析９２１．２人群血清中抗流感病毒中国流行株抗体的研究结果１２．２．１人群血清中抗ＨＮ流感病毒抗体水平研究结果１１ｉｉ２．２．２人群血清中抗Ｈ３Ｎ２流感病毒抗体水平研究结果１４２．２．３人群血清中抗Ｂｖ流感病毒抗体水平研究结果１８２．２．４人群血清中抗Ｂｙ流感病毒抗体水平研究结果２１３．讨论２４第二部分人群血清中抗流感病毒Ｈ２６ｓＮｉ抗体水平研究前Ｓ２６１．实验材料和方法２６１．１实验材料２６１丄１细胞与病毒２６１丄２试剂和耗材２７１丄３仪器设备２７１．１．４血清２８１．２实验方法２８１．２．１病毒培养２８１．２．２血清的采集及保存２８１．２．３血清的预处理２８Ｉ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文１．２．４血凝抑制实验２８１．２．５质量控制２９１．２．６实验结果处理２９２．结果与分析２９２．１样本情况分析２９２．２人群血清中抗ＨｓＮｉ流感病毒抗体水平研究结果３１３．職３４第Ｈ部分流感病毒中国流行株与ＷＨＯ推荐疫苗株亲缘关系的研究３５前胃３５１．实验材料和方法３５１．１实验材料３５１丄１病毒３５１丄２鸡胚％１丄３菌种３５１丄４试剂和耗材％１．２实验方法３７１．２．１病毒培养３７１．２．２流感病毒基因片段测序分析３７２．实验结果与分析３９２．１病毒基因序列测定３９２丄１病毒基因片段ＰＣＲ扩増结果３９２丄２菌液ＰＣＲ鉴定阳性克隆４０２．２流感病毒中国流行株与ＷＨＯ推荐疫苗株表面抗原基因比较４２３対论４６附录１５０附录ＩＩ基本实验操作５２附录虹主要溶液及培养基的配制６０附录ＩＶ６５ａ谢６６个人简６７ＩＩ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文摘要流感病毒能够在人类和动物中引起严重的呼吸道疾病，甚至造成死亡。目前，流感己经成为世界性公共卫生问题，受到了全球的关注。人血清中抗流感病毒抗体在流感病毒入侵时对人体有一定的保护作用，其存在情况被视为流感病毒感染后是否获得免疫保护的证据。因此，通过研究人群血清抗流感病毒的抗体水平能够了解一人群对流感病毒的群体免疫能力，进步为流感病毒的防控提供理论指导。本研究收集健康体检不同年龄段的血清８００多份，Ｗ当年中国流行株抗原血凝抑制试验检测抗体水平，发现人群血清中抗中国流行株ＨＮ、ＨＮ、Ｂｖ和Ｂ型ｉｉ３２ｙ：５１．１１％、９９．１２％、４．４４％、０％成年组：４６．２７％、９７、抗体阳性率分别为少年组．８５％６、．０１％４．５５％老年组：２４．１５％、９８．５１％、５．０８％、３．３８％。其中抗Ａ型流感病毒的抗体阳性率较抗Ｂ型流感病毒的抗体阳性率高，不同年龄组中青少年和老年人抗流感病毒抗体阳性率均较低，青少年和老年人依旧是流感病毒感染的高危人群，需要进行疫苗免疫。鉴于流感病毒自身变异较快，不同年份不同地区流感病毒的流行情况都会有所不同一。因此，ＷＨＯ每年都会根据对流感病毒变异的监测情况向世界各国推荐下年度流感病毒疫苗生产毒株。为了解ＷＨＯ提供的流感病毒毒株是否能准确地反应中国地区流感病毒抗原变异及流行情况，将流感病毒中国流行株表面抗原ＨＡ、ＮＡ基因片段测序后与ＷＨＯ推荐疫苗株进行比对并绘制进化树流感病毒，发现中国流一定差异一行株表面抗原在进化上与ＷＨＯ推荐流感病毒毒株存在。需要进步采用中和试验评价疫苗免疫血清对中国流行株交叉中和抗体水平的差异，Ｗ决定是否有必要采用中国流行株制备流感疫苗。本研究通过观察人群中抗２０１４年度流感病毒中国流行株免疫力，为Ｗ中国流行株制备对中国人群免疫保护效果更好的流感疫苗奠定基础。此外，本论文还对人群中抗ＨｓＮｉ流感病毒免疫力进行了评价青少年、成人、老人组抗体阳性率分别为３．３３％、７．８６％、６．８０％，抗体ＧＭＴ分别为１：５．９８３、１：１１．０３７、１：８．９１０。：流感病毒关键词；中国流行株；抗体；疫苗株１ 中国医学科学臨北京协和医学院硕±论文Ａｂｓｔｒａｄ：ＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｃａｕｓｅｓｓｅｖｅｒｅＫｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅａｍｏｎｇｈｕｍａｎｓａｎｄａｎｉｍａｌｓ，ｅｖｅｎｌｅａｄｓ化ｄｅａｔｈ．Ｂｙｆａｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｈａｓｂｅｃａｍｅ江ｌｏｂａｌｕｂｌｉｃｈｉｅｎｅｒｏｂｌｅｍｗｈｉｃｈ，ｇｐｙｇｐ＾ｓｅｉｚｅｓｔｈｅｗｏｒｌｄｓａｔｅｎｔｉｏｎＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｈｕｍａｎｓｅｒｕｍｃａｎｒｏｖｉｄｅｃｅｒｔａｉｎｐｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｖａｓｉｏｎｗｈｏｓｅｅｘｉｓｔｅ打ｃｅｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓ江ｒｏｏｆｔｈａｔ，ｐ－ｔｅｃｔｗｅａｔｈｅｒｉｍｍｕｎｅｒｏｉｏｎｗａｓａｃｕｉｒｅｄａｆｔｅｒｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅ抗化ｓｔｕｄｉｎｐｑ，ｙｇ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｏｆｏｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍｃｏｕｌｄｃｏｍｒｅｈｅｎｄｈｅｒｄｉｍｍｕｎｉｔｐｐｐｙａｂｉｌｉｔｙｏｆｏｕｌａｔｉｏｎａａｉｎｓｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｏｆｅｒｆｕｒｔｈｅｒｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｆｏｒｐｐｇ，＾ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ．Ｗｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｍｏｒｅ化ａｎ８００ｓａｍｌｅｓｏｆｈｅａｌｔｈｙｐｈｙｓｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｕｌａｔｉｏｎｐｐｐｓｅｒｕｍｉｎ舶ｓｓｔｕｄｙ，Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ化Ｓｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄ化ｄｅｔｅｃｔａｎｔｉｂｏｄｙｅｅｎｃｕｒｒｅｎｅａｒｎｄｔｌｖｌａｇａｉｎｓｔｄｏｍｅｓｔｉｃｅｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉａｉｔｙｆｏｕｈ泣ｔｒｏｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｐ，ｐａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎＨｉＮｉ，Ｈ３Ｎ２，Ｂｙ，Ｂｖａｒｅｊｕｎｉｏｒｇｒｏｕｐ：５１．ｌｌ％，９９．１２％，４．４４％０％ｓｅｎｉｏｒｒｏｕ；４６２７％９７．８５％６．０１％４．５５％ｓｅｎｉｌｅｒｏｕ：２４Ａ５％，；ｇｐ，，，；ｇｐ，９８．５１％，５．０８％，３．３８％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｏｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓａｎｔｉｂｏｄｗａｓｈｉｈｅｒｔｈａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＢｖｉｒｕｓｐｙｇａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｅｒｏｕｓｔｈｅｒｏｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓａｎｔｉｂｏｄｆｇｇｐ，ｐｙｏｊｕｎｉｏｒｒｏｕａｎｄｓｅｎｉｌｅｒｏｕｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｌｏｗ，ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｏｕｔｈａｎｄｔｈｅａｅｄａｒｅａｔｇｐｇｐｙｙｇｈｉｇｈｒｉｓｋｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙ．Ｄｕｅ化化ｅｈｉｇｈｍｕｔａｔｉｏ。ｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓ化ｅｅｉｄｅｍｉｃｓｔａｔｕｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ，ｐｖａｒｉｅｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｙｅａｒｓｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓ．Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ＷｏｒｌｄｈｅａｔｈｏｒａｎｚａｎＷＨＯｒｅ－ｃｏｅｚａｖｍｖｎｅｘｅａｒｖａｒｉｏｕｓｇｉｔｉｏｍｍ打ｄｓｉｎｆｌｕｅｎｉｓａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｆｏｒｔ化（）ｙｃｏｕｎｔｒｉｅｓｅｖｅｒｙｅａｒａｃｃｏｒｄｉｎｔｏｔｈｅｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｗｅａｔｈｅｒｖｉｒｕｓｙｇｓｔｒａｉｎｐｒｏｖｉｄｅｄｂｙＷＨＯｃｏｕｌｄｉｒｅｆｌｅｃｔｉｎｆｌｕｅｎｚａａｎｔｉｇｅｎｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｃｃｕｒａｔｅｌｙ，ｗｅｈａｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｓｅｇｍｅｎｔＨＡｏｆｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎ，ａｌｉｇｎｅｄｄｏｍｅｓｔｒａ化－ＷＨＯａｎｄｄｒａｗｎｉｃｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉ打ａｎｄＶ注ｃｃｉｏｃｓｔｉｎｃｏｍｍｃｉｉｄｅｄｂｙｃｌａｄｏｇｒａｍｓ，ｆｏｕｎｄｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｉｎＣｈｉｎａｄｉｆｅｒｓｆｒｏｍｖｉｍｓｓｔｒａｉｎｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄｂｙ２ 中圈医学科学院北京协和医学院硕±论文ＷＨＯｅｖｃｌｕｔｉｏｎａｒｉｌ？化ｉｓｖｉｔａｌ１：０ｆｔｉｒｔｈｅｒｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｏｆｃｒｏ巧ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｙ－ｍｉｃｓｔｒａｉｎｓｅｒｕｍｉｎＣｈｉｎａｍｉｎｅｉｆａｎｔｉｂｏｄｙｂｅｔｗｅｅ打ｖａｃｃｉｎａｔｅｄｓｅｒｕｍａｎｄｅｉｄｅ１：０ｄｅｔｅｒｐｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒ化ｒｏｄｕｃｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｂＣｈｉｎｅｓｅｅｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎ．ｙｐｙｐＴｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｓｌａｉ过ｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＣｈｉｎｅｓｅｅｍｍｕｎｅ－ｎｕｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｆｏｒｂｅｔｅｒｉｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｅｓｅｐｏｐｌａｔｉｏｎｂｙｏｂｓｅｒｖｉｎｇ－ｖｉｍｍｕｎｉｔｙｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔ２０１４ｉｎｆｌｕｅｎｚａｉｒｕｓＣｈｉｎｅｓｅｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｈｉｓａｅｒｅｖａｌｕａｔｅｄｉｍｍｕｎｉｔｏｆａｎｔｉｂｏｄａａｉｎｓｔＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ．，ｐｐｙｙｇ〇〇Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｕｎｉｏｒ，ｓｅｎｉｏｒａｎｄｓｅｎｉｌｅｒｏｕ扭ｅ３．３３％７．８６／〇，６．８０／〇ａｎｄａｎｔｉｂｏｄｊｇｐ，ｙＧＭＴｉｓ１：５．９８３，１：１１．０３７，１：８．９１０，ｒ巧ｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓ；ｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｏｆＣｈｉｎａ；ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎ３ 中圍居学科学院北京协和医学境硕±论文第一部分人群血清中抗流感病毒中国流行株抗体水平研究＿■、／＊—＾即目流感病毒（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）属于正黏病毒科（Ｏｗ／ｚｏｗｙｘｃｎ加（妃！６），流行性感冒＇病毒属（／柳ｗｅｎｚａｖｚｒｗ）。它是有包膜的单股负链ＲＮＡ病毒，其基因组可分为八个基因节段。根据核蛋白（ＮＰ）和基质蛋白（Ｍ）的抗原性，流感病毒可分为甲（虹ｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｍｓ）、艺（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢｖｉｍｓ）、丙（虹ｆｌｕｅｎｚａＣｖｉｒｕｓ）Ｈ型。其中甲型流感病毒根据其表面结构蛋白血凝素化ｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）和神经氨酸酶（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，ｇＡ亚型－－亚型ｔＷＮＡ）的不同又可分为１８种Ｈ（ＨＨ）和１１个ＮＡ（ＮＮ）。１１８ｉｉｉ流感病毒能够通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传Ｗ播。，可在马、猪、轉、海豹、禽类等动物和人群中引起严重的呼吸道疾病在大多数健康人群中流感病毒会引起自限型感染，患者症状较捏，并且能够在两周左右ｗｉｔ自愈。但在部分人群如必脏病患者或是哮喘患者等高危人群中，流感病毒能够引发较为严重的细菌性肺炎，支气管炎等并发症，造成动物和人类的死亡，给社会带ｗ’９ｔ３来严重的经济负担。Ｗ流感病毒具有高频变异的特点。人群中存在多种在人身上流行的流感病毒，一这也是造成季节性流行性感冒在人群中传播的主要因素。在特定年份，些流感病一毒可能会灭绝，而另外些流感病毒可能通过与其他流感病毒发生重祀或者自身发一生抗原漂移，定程度的流行，造成。北半球及南半球流感爆发的季节最主要是冬季ｔＷ而赤道附近的国家则会不定时的爆发流行。每年的流感季约有３００万至５００万例ｔＷ重病患者，且造成约２５万至５０万名患者死亡。甲型流感病毒除发生抗原漂移外，还能通过抗原转变大幅度变异，形成新的病毒亚型。此时人群普遍缺乏对新亚型病毒的免疫力，往往造成流感大流行００。在过去的１多年中发生了３次流感大流行（－－１９１８１９１９年西班牙ＨＮ流感大流行，１９５７１Ｗ８年亚洲１１流感大流行，ｌｌ２＾＾２１￣１１－１９６８１９６９年香港＆＾＾２流感大流行）造成了数千万人死亡气每年，全球需要花一ｔｗ费数十亿美元购买流感治疗药物。除价格高昂外，抗病毒药物还存在定的副作ｎｓ］用，且病毒不断产生耐药性，导致药效低。目前认为接种流感疫苗是应对流感流－ｉＷｔＷ行最为经济和有效的方式。接种流感疫化能够降低受种者患流感的几率，减轻患者的临床症状，将流感发生的范围控制到最小同一型别不同亚型的流感病毒可能存在相同的抗原，病毒抗原的血清型特性主一Ｗ要是由病毒抗原中的个或者多个优势抗原决定的。人群多次反复的暴露在不同一抗原性的流感病毒中，机体会产生系列抗病毒免疫反应，体液免疫反应的主要表现是产生病毒特异性抗体其中流感病毒特异性血凝抑制抗体可中和流感病毒ｔＷ。抗ＨＡ的中和抗体可Ｗ抑制病毒与细胞表面受体的结合或者是阻止病毒表面蛋４ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文－１９２１【白变构，通过阻止病毒与细胞膜融合而阻止病毒感染细胞１抗Ｍ２蛋白的抗体能影响心］Ｍ２蛋白在细胞膜上形成离子通道而起抗病毒作用。机体感染流感病毒后１９还能发生抗体类型转换［心］，产生多种类型抗体抵抗病毒入侵，可Ｗ保护人体免于病毒的感染。因此，人血清中的流感病毒抗体的存在情况被视为流感病毒感染后１９是否获得免疫保护的证据￡１。通过对人群有关流感病毒抗体水平的研究，可Ｗ了解对于特定年份特定区域内人群对相应流感病毒的免疫能力一，进步可Ｗ推测该地区流感病毒的流行情况，对该地区该年份的流感流行的预测和流感的预防工作具有指导意义。我国是发展中国家，人口众多，其流动性很大，化会医疗服务和公共卫生基础较为薄弱，与发达国家相比，疾病监测系统尚不完善，疫苗、药品研制生产能力相对落后。在我国境内，东西部经济发展差异较大，与东部发达地区相比，西部地区的医疗卫生系统更加不完善，疾病监测水平也较低。对于流感病毒的监测数据较为缺乏目前，能够反映人群血清抗流感病毒的抗体水平的数据完整度还较低，对地区人群流感病毒的免疫能力了解还较少，如果能够掌握地区人群对流感病毒相应毒株的免疫水平，了解人群对流感病毒的抵抗能力，就能帮助做好流感病毒的防御防范工作，在流感流行前甚至是流感大流行前做好充分准备，才能充分应对突如其经济损失及人群的恐慌ｔＷ来的流感疫情，减少社会。本研究目的在于了解人群血清中抗流感病毒中国流行株的抗体水平１＾＾及抗流感病毒中国流行株的抗体在不同年龄段人群中的分布情况。本研究采集普通健康体检人群血清样本，通过血清学检测手段调查人群抗流感病毒中国流行株抗体的情况。Ｗ期此结果能够在某种程度上对流感病毒中国流行株的防治工作提供一定理论研究基础。１．实验材料与方法１．１实验材稱１丄１病毒Ｂｙ／广东為湾／１１３３／２０１４，国家流感中也提供，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４，国家流感中也提供，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。ＨｉＮｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４，国家流感中也提供，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文Ａｓ／江苏崇川作８３０／２０１４，国家流感中也提供，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。１．１．２鸡胚９－１０日龄ＳＰＦ鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术技术有限公司。１丄３试剂和耗材（１）试剂山羊抗Ｂｙ／广东蒜湾／１１３３／２０１４，Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４，ＨｉＮｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４，Ａｓ／江苏崇川乃８３０／２０１４：由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室制备。二甲基亚枫（ＤＭＳＯ）：购自四川西赃化工股份有限公司；ＮａＣｌ：购自四川西陳化工股份有限公司；ＫＣ１：购自四川西陳化工股份有限公司！ＫＨ２Ｐ０４：购自北京鼎国生物技术有限公司；Ｎａ２ＨＰ０４：购自北京鼎国生物技术有限公司；ＲＤＥ；日本生研株式会社；廉糖；购自北京鼎国生物技术有限公司。（２）耗材：％孔１１底血凝板：贿自美国Ｎｕｎｃ公司；２００ｕｌ移液器吸头：购自Ａｘｙｇｅｎ公司；１．５ｍｌ离也管：购自Ａｘｙｇｅｎ公司；１５ｍｌ、５０ｍｌ离也管：购自美国Ｃｏｍｉｎｇ公司；．５００ｍｌ离必桶：购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司；细胞培养用小方瓶、各种规格的灭菌玻璃吸管；由中国医学科学院医学生物学研究所中也供应科提供。１１４．．仪器设备－－超净工作台：苏州净化设备有限公司ＳＷＣＪ２ＦＤ；倒置光学显微镜：ＬｅｉｃａＩＣＣ５０ＨＤ；巧光显微镜：日本Ｎｉｋｏｎ公司Ｅ６００；透射式电子显微镜－％５０；日本日立髙新技术国际贸易有限公司Ｈ；Ｃ〇２恒温培养箱：ＴｈｅｒｍｏＣ〇２ＩｎｃｕｂａｔｏｒＭｏｄｅｌ：３１１１；ｎｃｕｂａ－低温生化培养箱；ＢｉｎｄｅｒＩｔｏｒＭｏｄ处ＢＦ５；６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文Ｈ－计：ＢｅｃｋｍａｎＰＨＢ１００ｐ；超低温冰箱：ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ９００ｓｅｒｉｅｓ；祸旋震荡仪：德国ＩＫＡＬａｂＤａｎｃｅｒ；微量移液器：Ｇｉｌｓｏｎ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；电子天平：Ｓａｒｔｏｒｉｃｍｓ公司ＢＰ２１１Ｄ；离也机：美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司ＢｅｃｋｍａｎＧ２５；台式高速冷冻离必机：湖南长沙湘仪Ｈ１８５０Ｒ；台式离也机；ＴｈｅｒｍｏＳｏｒａｌｌＬｅｅｎｄＭｉｃｒｏ２１民ｇ；－高压灭菌锅：日本ＴｏｍｙＳＸ５０。１丄５血清经伦理委员会批准并知情的情况下，随机采集云南某Ｈ甲医院健康体检人群血清８６５份。１．２实验方法１．２．１病毒的培养－配制ＰＨ７．２７．４的ＰＢＳ溶液（具体配方见附录阻），高压灭菌后用作病毒稀释液。将实验使用的Ｂｙ／广东蒜湾／１１巧／２０１４，Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４，ＨｉＮｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４，Ａ３／江苏崇川／１８３０／２０１４病毒毒种分别按照１：１０倍比稀释到适合浓度■＂（实验使用１０倍稀释液），经尿囊腔接种（具体操作步骤间附录ＩＩ）１０日龄ＳＰＦ鸡胚，于３４±ｒＣ，６０％湿度解箱中培养７２ｈ，之后收获鸡歴尿囊液。１．２．２病毒液的初步纯化‘将收获的鸡胚尿囊液装入５００ｍｌ离也桶，４Ｃ离也两次，８０００ｎｎ／ｍｉｎ每次ｐ，°ｉｎ－２０ｍ。取上清混匀后分装在１．５ｍｌ无菌离也管中冻存于８０Ｃ冰箱备用。具体操作见附录ＩＩ。１．２．３血清的采集及保存血清由某两三甲医院健康体检中也获得，血清采集时采取随机抽样方式，由医院具有静脉采血经验的医务工作者完成血清采集，同时收集被采集血清者年龄和性别信息。对于被调查者的信息由实验室工作人员经技术培训后录入计算机。获得血７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文一清后－ＴＣ冰，分装成Ｈ份，两份５０山装，另份２００ｕｌ装。冻存于８（箱，直到实验时取出使用。１．２．４血清的预处理（１）血凝抑制试验（扭）需使用的样本血清的处理‘一天将－８０Ｃ保５０山实验前存的血清（／份样）取出，室温融化，每化均按照１：３的体积加入ＲＤＥ，即每份加入１５０山。ＲＤＥ加入后可降低血清中的非特异性抑制因Ｗ°素，同时不影响血凝抑制实验的结果。将ＲＤＥ和血清混合物混匀后３７Ｃ放置反应°１８ｈ，之后％Ｃ水浴灭活３０ｍｉｎ。瞬时离也，待冷却后加入２０％清洗后的浓红细胞（每ｌＯＯｕｌＲＤＥ处理过的血清加入２０山清洗后的浓红细胞）。混匀后室温吸附比，２０００ｉｍｐ离必３ｍｉｎ。（２）对照用羊血清的处理将山羊抗Ｂｙ／广东窺湾／１１巧／２０１４，Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４，ＨＮ／吉林朝阳ｉｉ＾１８７／２０１４，Ａｓ／江苏崇川／１８３０／２０１４，＾７乂１血１１／１／２００５１１５饥抗血清分别按照１：３加（）°入ＲＤＣ放°Ｅ，３７置反应１化，之后５６Ｃ水浴灭活３０阻ｉｎ。１．２．５血凝抑制试验根据血凝试验的结果配制４ＨＡＵ的病毒抗原（Ａｇ）。Ｗ完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除４即为含４ＨＡＵ的抗原的稀释倍数。在微量反应￣入５板的１？Ｌ１１孔加入２５叫ＰＢＳ，第１２孔加〇ｎｌＰＢＳ。吸取２５叫血清加入第１孔内，充分混匀后吸出２５叫于第２化，依次倍比稀释至第１０孔，从第１０孔吸取２５叫弃去。°￣ｎ孔均加入４ＨＡＵ混ＷＬ含匀的病毒抗原液２５叫，室温（约２０Ｃ）静置至少３０ｍ￣混匀ｉｎ６０ｍｉｎ。每孔加入５０山体积分数１％的鸡红细胞悬液，轻捏，静置约３０ｍｉｎ°°（室Ｃ４Ｃ）温约２０，若环境温度太高可置于条件下进行，对照红细胞将呈现纽扣状孔沉于孔底。结果判定当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。１．２．６质量控制（１）设立阳性对照：每次实验必须在％孔板上设立阳性对照和阴性对照，同批次的阳性对照结果滴度应保持２倍内。一（２）实验可根据红细胞对照来判断反应时间，尽可能在每块９６孔板上设计孔红８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文细胞对照（ＰＢＳ＋１％红细胞悬液）。（３）抗原回滴：每次实验前，均须对配置好的含４个血凝单位的抗原进行回滴，回滴合格后方可使用。１２７．．统计学分析Ｐ４２５＞＞［根据文献报道将抗体滴度ｌ：４〇域者抗体滴度１：３２喃判为血清抗体扭检测阳性。使用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ进行数据整理，建立数据库，使用ＳＰＳ拍１．０进行统’计学分析。抗体的阳性率使用Ｐｅｒｓｏｎ和Ｆｅｒｓ精确概率统计法进行分析，ｉｓｈ组间；＾抗体几何平均滴度的差异性使用秩和分析或方差分析，给出检验统计量及其对应的戶值ｒ．，用Ｆｉｓｈｅ精确概率法直接计算出Ｐ值，Ｗ化００５作为差异有统计学意义的标准。２．实验结果及分析２．１研究所采集样本的总体情况２丄１研究所用样本性别情况分析１１表．研究对象性别情况分析表Ｔａｂ．１．１Ｇｅｎｄｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔｕｄｙｏｂｊｅｃｔ年龄女男合计，＾＾Ｘ（ｄｆｌ）戶值组Ｎ％Ｎ％Ｎ％少年３７４１．１５３５８．９９０１００５．６８９０．０１７成年２９９５４．５２５０４５．５５４９１００８．７４７０．００３老年１２０５０．８１１６４９．２Ｕ６１０００．１３６０．７１３合计４５６５２．１４巧４７．９８７５１００３．１２９０．０７７２＝＝义５．７３１，户０．０５７＝统计学显著性水平：０：．０５，各年龄组间的人数构成比较结果少年组与成年组比较Ｐ０．０１９：少户＝＝年组与老年组比较０．１１６，成年组与老年组比较户０．３５２。一本研究共采集健康体检人群血清样本８７５份，其中女性样本４５６份，占比５２．１％，男性样本４１９份，占比４７．９％。男女比例为１：１．０９，男女比例差异经卡方检＝０－验无统计学意义（ｆ．０７７）。根据研究对象的年龄分成Ｈ组、：少年纪（１１６岁）－６０成年组（１７岁）、老年组（６０岁Ｗ上）。少年组中男性较女性人数多，男女比例９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文为１．９６：１，两组间比较差异显著（护０．０１７）１１．１９６；成年组中男女比例为：，两组间＝比较差异显著（Ｐ０．００３）；老年组中男女比例为１：１．０３，两组间比较差异不显著＝（戶０．７１３）。２．１．２研究所用样本年龄情况分析表１．２研究对象年龄情况分析表Ｔａｂ．１．２ａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔｕｄｙｏｂｊｅｃｔ年龄组人数缺失）均数（标准差）中位数最小值最大值（少年９００４．７８（４．５４）３．０００．００（Ｉｄ）１５．００（）成年５４９（０）３９．９２（１１．化）４０．００１７．００６０．００老年２３６０７１．８９（８．２５）７０．００６１．００９７．００（）合计８７５０４４占２（２１．９８）４５．０００．００（Ｉｄ）９７．００（）２＝＝组间比较乂６４０．１７５，？０．０００一注：Ｉ天ｄ表示出生后。统计学分析显著性水平：０．０５，组闻两两比较Ｐ值均为０．０００研究对象按照年龄分为少年、成年、老年三个组。各个组从人数，年龄均值（标准差），。年龄中位数，年龄最大值和最小值方面进行描述（详见表１．２）全部研究对象的年龄均值为４４．９８）．９２（２１岁，年龄中位数为４０．００岁，其中最小年龄者为出生后１天（Ｉｄ），最大年龄者为９７岁。研究包含的对象涵盖的年龄范围较广，研究对象的年龄集中在４０岁，年龄标准差为８．２５。１０ 中凹医学科学院北成协和医学院硕±论文２．２人群血清中抗流感病奉中国流行株抗体的研究结果２．２．１人群血清中抗ＨｉＮ感病毒抗体水平研究结果ｉ流Ｈ表１．３小同性别人群血清中抗Ｎ病寿抗体滴度分布，ｉ流感Ｔａｂ．１．３Ｔｉｔｒｅ出ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨｉＮｉｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｇｅｎｄｅｒｓｏｆｏｐｕｌａｔｉｏｎｐｓｅｒｕｍＮ＝４５６）巧＝４巧）女（（Ｎ合计滴度％Ｓ％数％＾＜１：８１３１２８．８１４１３３．７２７２３１．１１１．．１１．１：６４９０７５１１２２００１４１：３２８９１９．５５７１３．６１４６１６．７１１：６４７３１６．０５３２．６１２６１４．４１１１１１５：２８７０５．４６２４．８１３２．１１：２５６２３５．０３８９．１６１７．０１１２２：５１２１４３．１８．９２．５１１．９１：１０２４７１．５８１５．７１：２０４８００１０．２１０．１合汁４５６１００４＾ｍ８７５１００表１．４不同年龄人群血清中抗ＨｉＮｉ流感病寿抗体牆僅分布Ｔａｂ．１．４Ｔｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ打ｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨｉＮ］ｉｎｆｌｕｅ打ｚａｖｉｍｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔａｇｅｓｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍ＾少年成年老年合计滴鹰数％数％數％数％＜１８３１３２４４７４：８２．１３２．０１１２．２７２３１．１１６．１１．：１８８．９６２１１．３３０１２７１００４１１１：３２８８．９１０１８．４３７５．７１４６１６．７１：６４１４１５．６８８１６．０２４１０．２１２６１４．４１１２．１１：８１２１３３９８７．９２２９．３１３２５．１１：２５６１１１２．２３７８７３．０６４．１７．０１５１２８８．９２２．２２０．８２．５：１２２１：１０２４１１１２２２２０１．１．．８１５．７１２０４：８００１化２０００１０．１．合计９０１００５４９１００２：３６１００８７５１００１１ 中凹医学科学院北点协和医学院硕±论文１的＾女性］＼９０－＼？■？男性＋明．整体：ｉ＼孤－Ｉ１０■ＩＩＩＩＩＩＩＩ甲０１：８１：１６１；巧１：６４１；１２８１：２说１：５１２１：１０２４１２０４８１０９６：：４抗体巧度图１．１不巧性别抗ＨＮ度逆分布图，，抗化涧Ｆ１１Ｔｉｉｇ．．ｉｔｒｅｄｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔ化ｏｄｙａａｉｎｓｔＨＮｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｅｎｄｅｒｓｇｉｉｇ１００、？少年］－９０成年二－：：＾１＾＊°＇＇Ａｌ，１ｌ６１＾１ｌ２８ｉ！：：：￡＾ｆｅ＾：／〇４？１：；０９６抗体宙度１图．２小巧年龄抗Ｈ，Ｎｉ抗化滴度逆分布图Ｆ．１．２ＴＮｉｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔ化ｏｄａａｎｓＨｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｅｇｙｇｉｔｓｉ］ｇ结合表１．２和图１２可Ｗ看出人群抗ＨＮ．３，表１．４和图１．ｉｉ流感中国流行株的抗体滴度分布情况。总体来看多数人的抗体滴度在１：６４Ｗ下，不同性别群体抗体分布基本相近，不同年龄组的群体抗体分布差异较明显。在百分比相同的位置上，老年组的抗体滴度水平较其他组低且低于整体水平。１２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文表１．５不同性别抗体阳性率及抗体１：ＧＭＴＴａｂ．１．５Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｎｄｅｒｓｙｙｇ性别分析人数阳性率％ＧＭＴ（标准差）９５％ＣＩ中位数户值（ＧＭＴ）女４％４１：．．０１２４．３０１５４．８３９２０．５３２８８４３２．００（），０．４７９男４１９４０．．．巧２１．５１１８９．０３１７．７５２５９９３２００（巧，合计８７５４０．抓２２．９３（１７２．０２０）２０．２５，２５．９９３２．００２＝＝义０．０１７，户０．８９６统计学显著性水平：０．０５表１．５湿示的是不同性别抗ＨｉＮｉ流感病毒中国流行株的抗体阳性率及抗体几何平均滴度（ＧＭＴ），女性４５６人中抗体阳性人数为１８７人，抗体阳性率为４１．０１％，男性的阳性率为４０．８０％，女性的抗体阳性率较男性的稍高，但两中性别抗体阳性率＝之间的差异没有统计学意义（ｆ０．８９６）。女性的抗体几何平均滴度１：２４．３０、男性＝抗体几何平均滴度为１；２１．５１，两者之间的差异也无统计学意义（户０．４７９）。两个性别的抗体值均集中在１；３２．００。表１．６各年龄组抗体阳性率及抗体１：ＧＭＴＴａｂ．１．６Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｇｅｇｒｏｕｐｓ年齡分析人数阳性率％ＧＭＴ（标准差）９５％ＣＩ中位数Ｐ值（ＧＭＴ）少年９０５１．１１２５．７９１７８．４１９１６．１１，４１．３６６４．００（）成年５４９４５．２７３０．９３８８．３３２６．７２３６．００３２．０００．０００〇巧，老年２３６２４．１５１０．９２１１３．９１２８．５７１３．８３１６．００（），合计８７５４０．８０２２．９３（１７２．０２０）２０．２５，２５．９９３２．００＝７，扣．８３１户０．０００统计学显著牲水平：０．０５一＝各年齡组间抗体平均水平进：少年组与成年组比较Ｐ０９８８，步两两比较结果．少年狙与老年＝，成年组与老年组比较Ｐ０组比较／Ｍ）．０００．０００。＝＝：少年组与成年组比较户０抗体阳性率两两比较．３９３，少年組与老年组比较户０．０００，成年组与老年组比较？＝０．０００。不同年龄组人的抗体的阳性率不同．１５％。，其中最低是老年组仅为２４少年组的１１１％抗体阳性率在云个年龄组中最高为５．，较成年组的稍高但差异不具有统计学意＝＝义（Ｐ０．９９８）。三个年龄组间抗体阳性率存在显著差异（Ｐ０．０００），差异主要存在于老年组与其他两个组间（Ｐ值均为０．０００）。不同年龄组的抗体几何平均滴度（ＧＭＴ）１３ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文不尽相同，其中老年组最低为１：１０．９２。少年组虽然抗体阳性率较成年组高，但其抗：：。Ｈ体几何平均滴度较成年组的低，为１２５．７９，最高的成年组ＧＭＴ为１３０．９３个组么间的几何平均滴度差异具有统计学意义＝（戶０．０００），经两两比较发现差异主要存在于老年组与其他各年龄组之间（Ｐ值均为化０００）。２．２．２人群血清中抗Ｈ３Ｎ２流感病毒抗体水平研究结果表１．７不同性别人群血清中抗Ｈ３Ｎ２流感病毒抗体滴度分布Ｔａｂ丄７Ｔｉ打ｅｄｉｓ柿ｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨ３Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚ汪ｖｉｒｕｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｇｅｎｄｅｒｓｏｆｏｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍｐｐ＝４＝女（Ｎ５６）男（Ｎ４巧）合计滴度％ｍ％％＾＾备１巧００．０２０．５２０．２１：１６１０．２５１．２６０．７１３２３：０．７２０．５５０．６１：６４６１．３８１．９１４１．６１：１２８８９１９．５８５２０．３１７４１９．９１：２５６１８２３９．９１４９３．６；５３３１３７．８１５１２：１１０１１．４１０２２４．３２１２２４．２１：１０２４５２２４．１４７１１２９９１１３．．１：２０４８５１．１７１．７１２１．４１：４０９６５１．１８１．９１３１．５：８９２３０１１．７４１．０７０．８合计４５６１００４１９１００８７５１００１４ 中凹医学科学隨北庶协和医学院硕±论文表１．８小同年龄人群血淸中抗Ｈ３Ｎ２流感病毒抗体澗度分布Ｔａｂ．１．８Ｔｉ杜ｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ打ｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨ３Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔａｇｅｓｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍ＾少年成年老年合计＇摘度数％％数％数％＾＜１：８００．０２０．４００．０２０．２１：１６００５．１．００９０．４６０．７１：３２００．０３０．５２０．８５０．６１６４１１：１９１６４１４．．１．７１．６１：１２８１３１４．４１２８２３３３３１４０．．１７４１９．９２１２１：２％２７３０．０％．６９２３９．０３３１扣．８１：５１２３５３８．９１１４２０．８６３２６．７２１２２４．２１１１１．５２５１．：０２４１２．２６３１１０６９９１１．３１：２０４８１１１４０７７３．０１２１．４．．＞１１：４０Ｓ６１１．１１．５．１６６２．５１３１：８１９２１１．１３０．５３１．３７０．８＊合计９０１００５４９１００２３６１００８７５１００■１〇〇■女性■■＿，１＇—巧性９０－Ｘ一＼－整体８０－、７０－Ａ朗－？＼说－Ｓ＼立４０－Ｖ３０－＼２０－＼１Ｉ０１：８１：１６１：巧１：６４１：１２８１：２说１：５１２１：１０２４１：２０４８１：４０９６１：８１９２１：１的８４抗体巧度图１．３小巧性别抗Ｈ３Ｎ２抗体滴度逆分布图Ｆ．１．ＴｔｒｅｒｅｖｅｒｓｅｓｒｉｂｕｔｏｎｏｆａｎｔｏｄａａｔＨｉｇ３ｉｄｉｔｉｉｂｙｇｉｎｓ３Ｎ２ｉ打ｄｉｆｅｒｅｎｔｇｅｎｄｅｒｓ１５ 中凹医学科学院北庶协和医学院硕±论文－■■■１００■■少年■］Ｉ二黨：＋整体７０－＾Ｖ０１巧１１６１巧１６４１１２８１：２５６１５１２１２４：：：：：：：：１０１２０４８１：４０９６１：８１９２１１６３８４抗体巧度图１．４小巧年龄抗Ｈ３Ｎ２抗俾澗度逆分布图Ｆｉ１．４Ｔｇ．ｉｔｒｅｒｅｖｅｒｓｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄａｎｓＨｎｅｒｅｎａｙｉｔＮ２ｉｄｉｆｆｔｅｓｇａ３ｇ从＾上４个图表中可＾看出，不同年龄组的抗１１３？＾２流感病毒中国流行株抗体滴度逆分布图没有像不同性别组抗Ｈ３Ｎ２流感病毒中国流行株抗体滴度分布图那样基一一本与整体分布情况致，曲线几近重合，超过半的人抗体瀉度水平在１：５１２Ｗ下，明显高于抗ＨｉＮｉ流感病毒的抗体滴度水平。不同年龄组的分布曲线图中，少年组的曲线偏离整体情况曲线较多一。但不同组间及整体抗体滴度分布曲线的总体趋势致。表１．９小巧性別抗体阳性率义抗化１记ＭＴＴａｂ．１．９Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｉｆｆｅｒｓ打ｔｇｅｎｄｅｒｓ尸值性别分析人数阳性率％ＧＭＴ（标准差）９５％ＣＩ中位数ＧＭＴ）（女４％９９．１２３２１．５６（８０３．２４６２Ｗ．１７３４７．２９２５６．００），０．９５７男４１９９７．８５３１５．３３９６９．７３２２％．０３３４７．巧２Ｗ）．ＯＯ，（合计巧５９８．５１３１８．５６８８６．８５１３００．２５３３７．７９２Ｗ．ＯＯ（），打ｓｈｅｒ精确检验户＝０．化３统计学显著性水平：化０５与其他型流感病毒相比，抗１１３１＾２流感病毒中国流行株的抗体阳性率和抗体几何平均滴度均较高。不同性别抗Ｈ３Ｎ２流感病毒中国流行株抗体的阳性率不同，女性１６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文的抗体阳性率达到了９９．１２％９７．８５％，男性的为，两者之间的差异没有统计学意义＝（户０：．１６３），暂不能认为不同性别之间的抗Ｈ３Ｎ２流感病毒中国流行株抗体的阳性率不同。此外，女性的抗体几何平均滴度较男性的高，为１：３２１．５６，两性抗体几何均数之间的差异也没有统计学意义＝（戶０．％７）。本次研究对象的抗体滴度整体集中：２５６：。在１，按照性别分组后，各组的抗体滴度水平也集中在１２５６表１．１０各年龄组抗体阳性率及抗体１：ＧＭＴＴａｂ．１．１０Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｅｒｏｕｓｙｙｇｇｐ中位Ｐ值年龄分析人数阳性率％ＧＭＴ（标准差）９５％ＣＩ数（ＧＭＴ）少年９０１００３８８．０２９５１．３２５）３２８．５＾４５８．２５５１２．００（成年５４９９８．１７２９０．４５（７５８．６５７）如８．７２，３１３．００２５６．０００．０００老年Ｗ６９８．７２３６６．３２（１１０３．２２４）３２６．２９，４１３．００２５６．００９８．５１３化％８８６．５１３００．２５３３７．７９２％．００合计（），＾统计学显著性水平：０．０５一＝步两两比较结果：０各年齡组间抗体平均水平进少年组与成年組比较戶．００１，少年组与老年＝组比较Ｐ０．３３７，成年组与老年组比较户０．００２。一＝各年龄组间抗体平均水平进步两两比较结果：少年组与成年组比较户０，．３２７少年组与老年＝，成年组与老年组比较ｉＭ组比较Ｐ０．５６４）．７６４。不同年龄组抗Ｈ３Ｎ２流感病毒中国流行株抗体阳性率不同，但均较高，其中少年組的抗体阳性率达到了１００％，老年组的抗体阳性率也较成年组的高约０．５５％，为Ｗ．７２％。两两比较各年龄组间的抗体阳性率差异，各组间差异均没有统计学差异（户值分别为０．３２７、０．５６４、０．７６４）。比较各组的抗体几何平均滴度，少年组最高为１：３８８，：．０２最低的是成年组１２９０．４５。比较组间抗体几何平均滴度差异具有统计学意义＞＝（／０．０００），两两比较发现差异主要存在于成年组与其他各组间（Ｐ值分别为０．００１、０．００２）。研究对象的抗体滴度水平集中在１：２５６，少年组的则集中在１：５１２。１７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文■２．２．３人群血清中抗Ｂｖ流感病毒抗体水平研究结果表１．１１不同性别人群血清中抗Ｂｖ流感病毒抗体滴度分布Ｔａｂ１１１Ｔｉｔｒｅ出ｉｂｔｉａｎｔｉｂｏｄａａｉｎＢｙｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｅｎｄｅｒｓｏｆ．．ｓｔｒｕｏｎｏｆｙｓｔｓｇｇｐｏｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍｐ＝＝女（Ｎ４％）男（Ｎ４巧）合计滴度％ｍ％％＾＾Ｓｉ巧巧４７３．２２９８７１．２６３２１１２１１６６８１４．９５９１４．１１２７１４．５：１：３２３９８．６２８６．７６７７．７１：６４１０２．２２２５．３３２３．７１：１２８５Ｕ１０２．４１５１．７１：２５６００．０２０．５２０．２合计４％１００４１９１００８７５１００表１．口不同年龄人群血清中抗Ｂｖ流感病毒抗体滴度分布Ｔａｂ．１．１２ＴｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａａｉｎｓｔＢｖｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｅｓｏｆｇｇｏｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍｐｐ少年成年老年合计満度数％％数％数％＾＜１：８５８６４．４４０４７３．６１８０７２６３２７２．２１１９６２１１３１５．３１１．：１６２１．１３．６２７４５１：３２９１０．０４０７．３１８７．６６７７．７１６４３３．３２０３６９３．８．：．３２３７１：１２８１１．１１２２．２２０．８１５１．７１：２５６００．０１０．２１０．４２０．２合计９０１００５４９１００２％１００８７５１００８１ 中凹医学科学院北成协和医学院硕±论文－１００１ｍ女性＼ｍ＼８０－４－整体＼７０－＼抑－ｇＶ曼＼±－＼５４０孤－、２０－－１０－＊—〇—————ＩＩＩＩＷ０１：：：巧１：１６１：３２１６４１１２８１：２５６１５１２抗体滴度图１．５小巧性别抗Ｂｖ抗化滴度逆分化图ｉｔｉｔＢｉｆｆｅｒｅｎｅｎｄｅｒｓＦｉｇ．１．５Ｔｉｔｒｅｒｅｖｅｒｓｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｎｏｆａｎｉｂｏｄｙａａｎｓｖｉ打ｄｔｇｇ－１００１■少年９０－＼？＊■成年■８０－＼一老年一￣７０－＼整体＾抑－＼前受＼出４０－Ｖ：Ｖ〇－＊—＇—Ｉ１１１ｉｆ？￥０１：１２５６１：５１２：８１：１６１３２：６４１：１２８１：抗体滴度图．６Ｂｖ１小巧年龄抗抗体滴度逆分布图Ｆｉｇ．１．６Ｔｉｔｒｅ出ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＢｖｉｎ出ｆｅｒｅｎｔａｇｅｓ１．１２１：６，结合表图１．６看出不同性别抗体滴度分布在４处出现了不同女性滴度分布曲线在男性的下方，除此之外不同性别抗体滴度分布曲线基本接近重合。不同年龄组抗Ｂｖ流感病毒中国流行株的抗体滴度逆分布图中，少年姐的曲线出现了两１８次与整体曲线的相交，少年组曲线在抗体水平约为：和１：１６出现明显拐点，与其他组和整体的曲线发生了较明显的偏离。１９ 中凹医学科学院北巧协和医学院硕ｄｒ论文表１．１３不同性别抗体阳性率及抗体１；ＧＭＴＴａｂ－１．１３Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔ化ｏｄｙａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｉｎ出ｆｅｒｅｎｔｇｅｎｄｅｒｓ性另ｙ分巧人数阳性率％ＧＭＴ标准差９５％ＣＩ中位数Ｐ值ＧＭＴ（）（）４％３．女．４０４．２９１７．巧３．７８４８９８．００（刊：化０００４１９８．．男．１１４．５０８．８４３８９５．２１８００口＾，合汁８７５３方９４．巧２３．６２３．７１，４．８２８．００（＾．片９．６１７，卢０００２统计学显著性水平：化０５与之前两个小节中的抗Ａ型流感病毒的抗体研究倩况相比，抗Ｂｖ流感病毒中国流行株的抗体阳性率及抗体几何平均滴度都较低。在本次研究对象中，女性抗Ｂｖ流１感病毒中国流行株的抗体阳性率仅有３．４％，男性的较之稍高为８．１％。但均＝在１０％Ｗ下。不同性别么间的抗体阳性率差异有统计学意义（户０．００２）。两种性别的抗体几何平均滴度不尽相同，男性的为１：４．５０，女性的则为１：４．２９较男性低，两＾者的差异有统计学意义（ｉＯ．ＯＯＯ），结果有别于抗Ａ型流感病毒抗体阳性率及几何平均滴度在不同性别间差异不存在统计学意义。表１：Ｇ．１４各年龄組抗体阳性率及抗体１ＭＴＴａｂ－１ｉｔｖｅｒｔ化ａ１ｏｆａｎｔ化ｏｄｉ出ｆｔａｅｒｏ１．４Ｐｏｓｉａｔｉｏｏｆａｎｏｄｙｎｄ：ＧＭＴｎｅｒｅｎｕｓｙｇｇｐ年龄分析人数阳性率％ＧＭＴ（标准差）９５％ＣＩ中位数Ｐ值（ＧＭＴ）９０４．５少年．４４４．０６１８７３０２．９５．５８１．００（），５４９６．成年．０１４．４７２４３０６３．９４５．０６８．０００．９７５（），老年２３６５．０８４．Ｗ（２３．７４６）３．６１，４．８２８．００合计８７５５．６０４，３９（２３．６２１）３．７１，４．８２８．００２＝义〇．巧１，卢０．７７１统计学显著性水平：０．０５Ｂｖ流感如表１．１４所示，不同年龄组的抗体阳性率存在差异，少年组的抗病毒中国流行株抗体阳性率为４．４４％，是Ｈ个年龄组中最低。其次是老年组，为５．０８％。最高的是成年组，抗体阳性率达到了６．０１％。少年组和老年组抗体阳性率均低于此次研究整体的抗Ｂｖ流感病毒中国流行株抗体阳性率５．６％。卡方检验不同年龄组间的抗体阳性率差异．７７１）。比，差异不具有统计学意义（片０较Ｈ个年龄组之间的抗二体几何平均滴度：４．０６：４．３３，仍然是少年组最低为１，老年姐第低１，少年组和老：４：年组抗体几何平均滴度均低于成年组１．４７，也低于整体的几何平均滴度１４．３９。２０ 中凶医学科学院北南协和医学院硕±论文秩和检验各组间的抗体平均水平差异＾，没有统汁学意义（ｉＯ．９７５），暂不能认为各年龄组的抗体平均水平不同一。未进步进行组间抗体平均水平的两两比较。成年组和老年组的抗体的滴度集中在１：８，少年组则集中在１：１。２．２．４人群血清中抗Ｂｙ流感病毒抗体水平研究结果表１．１５不同性别人群血清中抗Ｂｙ流感病專抗体滴度分布Ｔａｂ．１．１５Ｔｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａａｉｎｓｔｂｙｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｎｄｅｒｓｏｆｇｇｐｏｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍｐ女＝＝（Ｎ４５６）男（Ｎ４１９）合汁滴度％％数％＾＾＜１：８３７２８１．６３；３７８０．４７０９８１．１１１１：６４６１０．３９９．３８５９．７１：３２２９６．４１９４．５４８５．５４７２．４１：６１．５１０１７１．９１１２８２０４３３１．：．１．１５１７１：５１２００．０１０．２１０．１合许４％１００４１９１００８７５１００表１．１６小同年龄人群血清中抗Ｂｙ流感病毒抗体滴度分布Ｔａｂ．１．１６Ｔｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄａａｉｎｓｔｂｉｎｆｌｕｅｎｚｉｒｕｓｉｎｄｉｆｅｔｅｓｏｆｏｆｙｇｙａｖｒｅｎａｇｏｕｌａｔｉｏｎｓｅｒｕｍｐｐ少年成年老年合计髓度数％数％数％数％１４．１．含巧８１９０３１７８５１９７巧．５７０９８１１：１６３３．３６１１１．１２１８．９８５９．７１：３２６６．７３２５．８１０４．２４８５．５１４：６００．０１０１．８７３．０１７１．９１１：１２８００．０１５２．７００．０１５．７１：２％００１．１．０００．００４１０．合计９０１００５４９１００２３６１００８７５１００２１ 中坦医学科学院北点协和医学院硕±论文１０〇■１一－女性＼＋巧性＼＋整体＼７０－＼说－是＼Ｍ４０－、３０－２０－１０－￣￣＊〇－￣—Ｉ１１ｆ，？０１：８１１６１：３２１：６４１１２８１：２５６１：５１２１１０２：：：４抗体巧度图１．７不巧性别抗Ｂｙ抗体滴度逆分化图Ｆｉ．１．７Ｔｉｔｒｅｉｉｇｒｅｖｅｒｓｅｄｓｔｒｂｕｔｉｏ打ｏｆａｎｉａａｎｓｔｎｉｒｅ打ｅｎｄｅｒｓｔｂｏｄｙｉｂｉｄｆｆｅｔｇｙｇ－９０＼成年８０－－Ａ－老年＼７０－整体：歴ｉ－＼＼ｋＳ４０＼ｉＪ■■〇＿Ｉ，ｆｐ，，＾ｆ０１巧１：１６１：３２１：６４１：１２８１：２５６１１２１：１０２４巧抗体滴度图１．８不巧年龄抗Ｂｙ抗体滴度逆分布图Ｆｉｇ．１．８Ｔｉｔｒｅｒｅｖｅｒｓｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ打ｏｆａｎｔ化ｏｄｙａｇａｉｎｓｔｂｙｉｎ出ｆｆｅｒｅｎｔａｇｅｓ不同性别组抗体滴度分布曲线只在抗体滴度较高的部分出现了明显的互相之间的分离：５１２，但几乎在１的抗体滴度处不同性别及整体的抗体滴度逆分布曲线发生了汇合一。不同年龄组的抗体滴度分布图则从开始就能明显看出少年组曲线直位于其他组的曲线的下方，即少年组的抗体滴度明显低于其他组，也低于整体的抗体滴度水平。２２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±讫文表１．１７不同性别抗体阳性率及抗体１：ＧＭＴＴａｂ．１．１７Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｅｎｄｅｒｓｙｙｇ性别分析人数阳性率％ＧＭＴ标准差）９５％ＣＩ中位数ｆ值ＧＭＴ（（）女４％１．９７２．６２（口．６１４２．３１，２．９７１．００）０．３３９男４１９５．７２２．９８（３４．３１句２．５８，３．４３１．００合计８７５３．７７２，７９（２５．７８６）２．５３，３．０５１．００＝＝８，ｆ．２９５户０．００４统计学显著性水平：０．０５不同性别抗Ｂｙ流感病毒中国流行株的抗体阳性率不同，男性为５．７２％高于女性＝．９７％，。此外抗体阳性率１两者之间的差异经卡方检验具有统计学意义（戶０．００４），１２９８１么拍，抗体几何平均滴度男性的为：．较女性的高两个性别之间的抗体几何平＝均滴度差异不具有统计学意义（戶０．巧９）。不同性别的抗体滴度水平均集中在１：１。．００表１．１８各年龄组抗体阳性率及抗体１：ＧＭＴＴａｂ，１，１８Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｅｒｏｕｓｙｇｇｐ年齡分析人数阳性率％ＧＭＴ标准差）９５％ＣＩ中位数Ｐ值（ＧＭＴ（）少年９００．０１．６２（８．１５Ｕ１．２９，２．０４１．００成年５４９４．５５３．０４（２２．７０５）２．６９，３．４３１．０００．０００老年２３６３．３８２．８０（３５．１０９）２．３５，３．３２１．００合计３．７７２．７９口５．７８６）２．５３，３．０５１．００＾统计学显著性水平：０．０５一＝各年齡组间抗体平均水平进步两两比较结果：少年组与成年组比较戶０，．０００少年组与老年户＝＝组比较０．００１，成年组与老年姐比较？０．８８８。？＝各年齡组间抗体阳性率两两比较结果：少年组与成年組比较ｉ０．的７，少年组与老年组比较＝＝户０，．１１２成年组与老年组比较户０．４５６不同年龄组之间的抗体阳性率不同（如表１．１８所示），少年组的抗Ｂ流感病毒ｙ中国流行株抗体阳性率已经为化０％．５５％老年组，抗体阳性率最高的是成年组为４，的为３．％％。两两比较Ｈ组之间的抗体阳性率差异，少年组与成年组间的抗体阳性＝（？０．０３７）。Ｈ个年龄组的抗体滴度水平均集１：１．００率的差异具有统计学意义中在，１３．０４但Ｈ个组的抗体几何平均滴度不同，最高的是成年组为：，最低的是少年组为一１．化。：１秩和检验Ｈ个年龄组间抗体儿何平均滴度差异具有统计学意义，进步两两比较发现组间差异主要存在于少年组与其他年龄组间（Ｐ值分别为化０００、０．００１）。巧 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文３对论６２６一，＾流感病毒ｔ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓ）是引起人和动物传染病的最重要的病原体之。能够通过空气中的飞沫，、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播从而引起？７’１１呼吸道疾病甚至造成动物和人类的死亡，给社会带来经济负担。流感己经一一８［是个全球性的公共卫生问题］。也是第个实行全球监测的传染病。人群多次重复的暴露在不同抗原性的流感病毒中，能够产生针对不同毒株的抗体获得相应的免疫保护一。人体产生的抗体能与之后感染的同病毒甚至是同型流感病毒表面抗原发生结合，从而阻断流感病毒感染细胞，人体内存在的抗。因此流感病毒的抗体水平能够反应人群感染相关流感病毒后获得的免疫保护的情况。本论文使用流感病毒中国流行株Ｂｙ／广东窺湾／１１３３／２０１４，Ｂｖ／北京海淀＾３８０／２０１４，ＨｉＮｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４，八３／江苏崇川＾８３０／２０１４对人群抗体水平进行了研究。流感病毒特异性血凝抑制抗体滴度＞１：４０时，抗体水平成阳性，被认为对人体具有保护性。本研究发现，人群抗ＨｉＮｉ流感病毒中国流行株的抗体阳性率为４０．８０％，１２２，抗体几何平均滴度（ＧＭＴ）为：．９３抗Ｈ３Ｎ２流感病毒中国流行株的抗体阳性率为％，，．５１％抗体几何平均滴度为１：３１８．％抗Ｂｖ流感病毒中国流斤株的抗体阳性率为５，：，流感病毒中国流行株的抗体阳性率．６０％抗体几何平均滴度为１４．３９抗Ｂｙ为３，１．７７％抗体几何平均滴度为：２．７９。人群抗甲、艺两个型的流感病毒中国流行株的抗体水平存在不同，抗甲型流感病毒的抗体阳性率和ＧＭＴ均比抗艺型抗体的＝高。抗不同流感病毒中国流行株抗体的阳性率差异有统计学意义（＾２１７８，．３２９戶＝０．０００）。抗Ａ型流感病毒的抗体阳性率较抗Ｂ型的抗体阳性率高，可能由于目前流感的流行是甲型流感为主。若是病毒再次出现，由于人群血清抗Ｂ型流感病毒抗体水平较Ａ型的低，因此Ｂ型流感病毒可能更容易引起流行。研究还发现抗ＨｉＮｉ、Ｈ３Ｎ２两种甲型流感病毒抗体的阳性率及抗体几何平均滴度在不同性别间的差异没有统计学意义一些流感病毒相关血清学调查结果，込与其他ＰＷＷ相似。但研究中的抗Ｂｖ、Ｂｙ流感病毒中国流行株的抗体阳性率及抗体几何滴度在性别上的差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），男性的抗体阳性率和ＧＭＴ均比女性高。这可能与不同性别人群接触流感病毒的机会不同有关。男性是社会主要活跃人群，社交活动较为广泛，接触人群较多，，与流感病毒的接触机会较多可能产生隐一ｔＷ。形或显性感染的机会较多，可能积累抗体存在于体内为进步明确Ｂ型流感病毒抗体阳性率及几何平均滴度是否存在性别上的差异一，今后我们将会进步扩大样一，进行进步的研究调查本及地区范围。不同年龄组人群抗流感病毒的抗体阳性率及抗体几何平均滴度均存在不同。抗ＨｉＮｉ流感病毒抗体阳性率在老年组中最低仅为２４．１５％，少年组的为５１．１１％略高，２４ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文可能是近年流感病毒在青少年中的接种率有所提髙。也可能是青少年大发生了隐性感染刺激机体产生相应抗体。抗战Ｎ２及Ｂｖ、Ｂｙ抗体阳性率均是老年人组最低分别为９８．７２％、５．６０％、３．７７％。证明老年人和青少年较成年人对流感病毒中国流行株抵抗力弱，当流感爆发时，这两个人群可能成为流感病毒的易感人群。这可能因为青少年还在成长，其免疫系统还不够完善，对病毒的防御能力较弱。老年人自身免疫系统已经衰老，免疫应答不灵敏，导致对流感病毒的感染应答降低，体内产生具有保护性的抗体减少。在今后流感疫苗接种工作中，应该Ｗ老年人和青少年为主要接种对象。进一步的我们将采巧中和试验评价疫苗免疫血清对中国流行株交叉中和抗体水。平的差异，决定是否有必要采用中国流行株制备流感疫苗２５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文第二部分人群血清中抗流感病毒ＨｓＮｉ抗体水平研究、＞、？．削旨禽流感病毒，属于甲型流感病毒。在世界范围内、，家禽中流巧的主要有Ｈｓ、Ｈ６ＰＵ战、Ｈｇ等亚型，战和战亚型的某些毒株可Ｗ造成禽类很高的发病率和死亡率。禽流感病毒原本是在禽类和鸟类中传播，送可能是因为人类流感病毒特异性结合－２６唾ａ，该受体存在于人类上呼吸道表皮细胞上，而大多禽流感病毒则特异性，液酸３２ａ－２３［１结合唾液酸，这类受体存在于禽类肠上皮细胞。，禽流感病毒与普通人类流一感病毒一样种校正和修复复制错误的机制，缺乏，当其在人和动物体内复制时容Ｐ３３。，可能发生抗原漂移和抗原转移近几年来易发生变异，已有病例报道ＨｓＮｉ可Ｗ从鸟类传播给人。有研究表明ＨｓＮｉ亚型禽流感病毒ＰＢ蛋白Ｄ７０１化Ｗ及ＮＳ２ｉＰ４‘３ｑ蛋白Ｐ４２Ｓ均参与病毒哺乳动物致病力的増强。此外科研人员利用Ｈ５Ｎ１哺乳动物模型适应株的血凝素蛋白晶体结构从与受体结合的角度闻明了ＨＡ蛋白Ｐ６位丝氨酸等关键位点突变可Ｗ增强病毒在哺乳动物间传播的特性ＨｓＮｉ禽流感病毒ＰＷ能够感染人体并导致患者并发肺炎，或是多器官衰竭甚至是死亡。截止２０１５年１ＰＷ。月，高致病性禽流感病毒战Ｎ８４０人感染，４４７ｉ已造成人死亡ｉ。目前，还不能证明ＨｓＮｉ可ｌｉｌ在人与人之间传播大多数人类感染病例均是由于感染者与禽类有亲密接触造成的。由于人群暴露于ＨｓＮ，ｉ的几率较小人群中含有的抗战Ｎ一ｉ流感病毒的抗体较低目前，战Ｎ依旧是ｉ个可能引起大流行的，目前有两种药物可用于治疗流感病毒。对于ＨｓＮ流感病毒，由于病毒变异不断ｉ产生的抗药性，药物治疗和控制ＨｓＮｉ病毒感染的有效性受到了制约。此外，可能导致ＨｓＮｉ大流行的病毒毒株还未出现，研发有效预防ＨｓＮｉ流感的疫苗尚存难题。因此防治ＨｓＮｉ流感病毒时对病毒的监测显得尤为重要。若能准确监测ＨｓＮｉ的流行情况及人群对病毒的免疫力水平，将对ＨｓＮｉ的防控工作具有重要指导工作。本研究采集健康体检人群血清样本，进行人群血清抗ＨｓＮｒ流感病毒抗体水平研究，旨在了解人群对ＨｓＮｉ流感病毒的群体免疫能力，期能为今后的疫苗接种工作提供数据支持。１？．实验材料和方法１．１实验材料１．１．１细胞与病毒（１）细胞：２６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文Ｖｅｒｏ细胞，第１３３代，购自美国模式培养物中也（ＡＴＣＣ），现由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存ＭＤＣＫ细胞，由中国医学科学院，第６０代，购自美国模式培养物中也（ＡＴＣＣ）医学生物学研究所生物制品五室传代保存。（２）病毒：Ａ／Ａｎｈｕｉ／ｌ／２００５（Ｈ５Ｎ〇减毒株（战ＮｉＡ），美国疾病控制中也（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ）提供，之后经过连续传代使适应于Ｖｅｒｏ细胞，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。１．１．２试剂和耗材－ｔ－ｔｒｅａｔｅｄｒｉｎ）ＴＰＣＫ膜酶（ＴＰＣＫＴｙｐｓ；购自ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｉｏｎ公司；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）：购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；ＤＭＥＭ／Ｆ１２（干粉）：胸自美国扣ｅｍｏ科技公司；ＭＥＭ基础培养基（液体）：由中国医学科学院医学生物学研究所溶液组自主配制；４００Ｕ／ｍｌ双抗（１００００Ｕ／ｉｎｌ青霉素、６．６％ＮａＨＣ〇溶液、３％谷，和２ｍｇ／ｍｌ链霉素）３氨酷胺溶液：，１％膜蛋白酶溶液、０．０１％ＰＢＳ（憐酸盐缓冲液）均由中国医学科学院医学生物学研究所溶液组自主配制；：购自兰州民海生物工程有限公司新生小牛血清；Ａ／Ａｎｈｕｉ／ｌ／２００５（Ｈ５Ｎｉ）抗血清：由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室制备；ＮａＣｌ、ＫＣ１、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰ０４：购自北京鼎国生物技术有限公司；ＲＤＥ：日本生研株式会社。Ｌ１．３仪器设备超净工作台－－；苏州净化设备有限公司ＳＷＣＪ２ＦＤ；倒置光学显微镜：ＬｅｉｃａＩＣＣ５０ＨＤ；Ｃ〇：ＴｈｅｒｍｏＣＯ２ＩｎｃｕｂａｔｏｒＭｏｄｅｌ：３１１１２湿培养箱；恒超低温冰箱：ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ９００ｓｅｒｉｅｓ；祸旋震荡仪；德国ＩＫＡＬａｂＤａｎｃｅｒ；微量移液器；Ｇｉｌｓｏｎ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ１８０ｓｅｒｉｅｓｗａｔｅｒｂａｔｈ恒温水浴锅；连续波长酶标仪；ＴｈｅｒｍｏＶａｒｉｏｓｋａｎＦｌａｓｈ；－高压灭菌锅：日本ＴｏｉｎＳ；Ｘ５０ｙｉ２７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文台式高速冷冻离也机：湖南长沙湘仪Ｈ１８５０Ｒ。１丄４血清使用第一部分中经伦理委员会批准并知情的情况下，采集某Ｈ甲医院健康人群的血清的５份，除去缺失样本，此次研究共使用８０５份血清。１．２实验方法１．２．１病毒培养２地长成＝使用单层的Ｖｅｒｏ细胞按照ＭＯＩ０．０５接种流感病毒Ａ／Ａｎｌｍ＾±ｒＣ进行培泰观－ｉ／１／２００５ＨＮ（５〇，于察细胞病变到达８０％９０％时收获病毒液即细胞培养上清液‘Ｃ。将收获病毒培养液装入５０ｍｌ离也管，４离也两次，每次’８０００ｎｎ／ｍｉｎ－Ｃ冰箱备，２０ｍｉｎ。取上清混匀后分装在１ｐ．５ｍｌ无菌离也管中冻存于８０用（具体操作见附录ＩＩ）。１．２．２血清的采集及保存详细请见第一部分血清预处理１．２．３血清的预处理详细请见第一部分血清预处理１２．４血．凝抑制试验根据血凝试验的结果配制４ＨＡＵ的病毒抗原Ａ。Ｗ完全血凝的病毒最高稀释（ｇ）倍数作为终点，终点稀释倍数除Ｗ４即为含４ＨＡＵ的巧原的稀释倍数。在微量反应板的￣１孔１１孔加入２５山ＰＢＳ，第１２孔加入５０山巧Ｓ。吸取２５ｉｌ血清加入第１孔｜内，充分混匀后吸出２５２孔０化叫于第，依次倍稀释至第１，从第１０孔吸取２５叫°￣弃去。１孔１１１；５１１温（约２０〇静置至孔均加入含佛乂混匀的病毒抗原液２＾，室３０￣少ｍｉｎ６０ｍｉｎ。每孔加入５０１％的鸡红细胞悬液轻轻混匀叫体积分数，静置约°°３０ｍｉｎ（室温约２０Ｃ，若环境温度太高可置于４Ｃ条件下进行），对照红细胞将呈现纽扣状孔沉于孔底。结果判定当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可Ｗ抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。２８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文１．２．５质量控制（１）设立阳性对照：每次实验必须在９６孔板上设立阳性对照和阴性对照，同批次的阳性对照结果滴度应保持２倍Ｗ内。一（２）实验可根据红细胞对照来判断反应时间，尽可能在每块％孔板上设计孔红细胞对照（ＰＢＳ＋１％红细胞悬液）。（３）抗原回滴：每次实验前，均须对配置好的含４个血凝单位的抗原进行回滴，回滴合格后方可使用。１．２．６实验结果处理ｔＷ抗体滴度三１：８０的判为血清抗体出检测阳性。，即血凝抑制抗体有保护性使用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ进行数据整理，建立数据库，使用ＳＰＳＳ＾．Ｏ进行统计学分析。’抗体的阳性率使用Ｐｅｒｓｏｎ／和Ｆｉ組ｅｒｓ精确概率统计法进行分析，组间抗体几何平均滴度的差异性使用秩和分析或方差分析，给出检验统计量及其对应的Ｐ值，用？Ｆｉｓｈｅｒ精确概率法直接计算出戶值，Ｗｉ５〇．〇５作为差异有统计学意义的标准。２．结果与分析２．１样本情况分析表２．１研究对象性别情况分析表Ｔａｂ．２．１Ｇｅｎｄｅｒｓｉｓｆｓｕｄｅｃａｎａｌｙｏｔｙｏｂｔｊ年龄女男合计，ＮＸ（ｄｉｌ）ｆ值组Ｎ％Ｎ％Ｎ％少年３９４３．３５１说ｎ９０１００３．２０００．０７４成年２７８５４．６２３１４５．４５０９１００８．６８００．００３老年１０２４９．５１０４５０．５２０６１０００朋９０．８４４合计４１９５２．０３％４８．０８０５１００２．７０６０．１００料．６１４，护０．１０统计学显著性水平；化０５２９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文表２．２研究对象年齡情况分析表Ｔａｂ．２．２ａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔｕｄｙｏｂｊｅｃｔ年齡组人数均数（掠准差）中位数最小值最大值少年９０５．３３４．５０５５．０００．００（Ｉｄ）１５．００（）成年５０９４０．８４（１１．１７９）４２．００１７．００６０．００老年２０６７１．３０８．２３５的．００６１．００９７．００（）合计８０５４４．６６（２１．５１１）４５．０００．００（Ｉｄ）９７．００＝＝组间比较户２巧，．１６６？０．０００统汁学显著性水平：０．０５研究一共采用健康体检人群血清样本８０５份，其中女性样本４１９份，占比５２．０％，男性样本巧６份．０％。：１０９，占比４８男女比例为１．，男女比例差异经卡方检验无统＝－０Ｈ组－计学意义（户．１００）研究对象的按照（１１６）、６０年龄分成：少年组岁成年组（１７岁）、老年组（６０岁Ｗ上）。少年组中男性较女性人数多，男女比例为１．３０：１，其余两个年龄组的女性人数均较男性多。各年龄组性别分别在各性别占比之间的差异进行卡方检验（具体戶值见表１．１）除成年组外其他各组的差异均无统计学意义。Ｈ个年龄组间的男女比例差异无统计学意义．１００）。（ｉＭ）全部研究对象的年龄均值为４４．６６岁，年龄中位数为４５．００岁，其中最小年龄者为出生后１天（Ｉｄ），最大年龄者为９７岁。研究对象包含的年龄范围较广，研究对象的年龄集中在４５岁。３０ 中凶医学科学院北方协和医学院硕±论文２．２人群血清中抗ＨＮ流感病泰抗体水平研究结果ｓｉ表２．３抗ＨｓＮｉ抗体滴度巧不巧性别中的分布情况表Ｔａｂ．２．３ＴｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｉｎｓｔＨＮｉｉｎｆｌｕｅｎｚ过ｖｉｒｕｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｅ打ｄｅｒｓｏｆｏｕｌａｔｉｏｎｇａｓｇｐｐｓｅｒｕｍ＝＝女（Ｎ４１９）男（Ｎ３８６）合计滿度％％数％＾＾＞：３５８４３２８４．７６．３１５２７７９８４＞２２３８６１５０１．２１：１０２６３６．８．６６２＞４２．１：２０１７７３１５３３９．６３３０４１．１＞１７６２：４０９３２２．３１９．７１６９１．１＞．２１８０３３８．０２４６５７７．１：＞１：１６０７１．７５１．３１２１．５＞：１３２０００．０００００表２．４不同年龄人群ｉｆｌｉ清中抗ＨｓＮｉ病荐抗体牆度分命情况表Ｔａｂ．２．４ＴｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨＮ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｉｎ化ｆｅｒｅ打ｔａｅｒｏｕｓｏｆ５ｇｇｐｏｕｌａｔｉｏｎｕｍｐｐｓｅｒ少年成年老年合计猶度数％數％数％数％＞１０４２４５：５６３７．０４８６．８１７８４．６巧８４．３＞１６５６１１：１０４６５１．巧９６６．６１１．３５０６２．２＞２０２５７．２２．７８．巧０４１．１：２８７４４６３７９０＞１：４０１１１２２１２２２４６１７．５２１．０．３１６９＞１：８０３３．３４０７．９１４６．８５７７．１之１１６０１１１９１．８２１．０１２１．５：．＞：１３２０００００００００３１ 中凶医学巧学院北病协和医学院硕±论文１＇＼？女性兰］＋＼巧性抑－＼＋整体巧－＼乏助－＼５０运＾４０－＼３０－２０－Ｖ－１００：１４０１１２００１５：１０１：２０１：：８０１：１６０：３抗体滴度２图．１不巧性别抗体滴度逆分化图巧ｇ．２．１ＴｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨ５Ｎ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｄｅｒｓｉ〇〇－？■少年１－９０■■■成年８０－＼＼ｖ老年一？７０－Ｗ整体１：Ｖ０－１—１１１１１，０１：５１：１０１：２０１：４０１：８０１：１６０１：３２０抗体滴度２２图．小巧年龄抗体滴度逆分命图Ｆｉｇ．２．２Ｔｉｔｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ打ｏｆａｎｔ化ｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨＮｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｅｓ５１ｇ２２．１２．４及．结合表．３和图、表图２２ＨＮｒ流感病毒抗体的大，可Ｗ看出人群抗ｓ致分布情况。抗体分布几乎不受性别差异的影响。不同性别的抗体分布曲线几乎与一整体分布情况相同。大约半Ｗ上人群的抗体滴度在１：２０Ｗ下。不同年龄的人群抗体分布存在一定差异２。从图曲线可看出少年组及老年组在相同人数百分比水平上，抗体滴度均较成年组低且低于人群的整体水平。３２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文表２．５不同性别组抗体阳性率及抗体几何平均滴度１记ＭＴＴａｂ．２．５Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｇｅｎｄｅｒｓ指柄合计Ｐ值老＾分析人数４９３８６８０５－１阳性率％７．８８６．２２７．０８０．３９３ＧＭＴＸ标准差９．９７４７．１２９．５２７２４．７９９．７５７２６．０３０．５３４）口）（）（）９５％Ｃ－Ｉ８．７９０１１．３２４８．３９５１０．８１４８．９３３１０．６６６，，，－中位数１０．００１０．００１０．０００－极大值１６．０１６０．０１６０．０极小值－统计学显著性水平：化０５根据ＷＨＯ推荐的实验室检测ＨｓＮｉ实验指南将特异性抗战Ｎｉ流感病毒血凝抑制抗体滴度三１：８０的样本视为血清抗体阳性，当病毒再次感染时抗体可Ｗ对机体产生保护作用。计算不同性别抗体阳性率及抗体几何平均滴度后绘制表２．３。表中显。示，女性的抗体阳性率为７．８８％，男性的抗体阳性率为６．２２％研究的样本整体血清抗体阳性率为７．０８％。比较不同性别间的血清抗体阳性率差异不具有统计学意义＝（ｆ０．巧３）。不同性别的抗体几何平均滴度也不同，女性的为１：９．９７４，男性的则为１：９．５２７，较女性的低，经统计学检验，两者之间的差异也不具有统计学意义（护０３９３）。表２．６不同龄组抗体阳性率及抗体１泪ＭＴＴａｂ．２．６Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｏｆａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄ１：ＧＭＴｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｏｆ出ｆｅｒｅｎｔａｇｅｇｒｏｕｐｓ年龄分析人数阳性率％ＧＭＴ（标准差）％％ＣＩ中位数Ｐ值（ＧＭＴ）少年９０３．９．巧５８３（２１．７７８）４．４９８７．９６２１０．００，成年５０９７．８６１１．０：３７口７．２７９）９．８８６，１２．３３１１０．０００．０００老年２０６６．８０８．９１０（２４．０６８）７．４９９，１０．巧２１０．００合计８０５７．０８９．７５７口６．０２６）８．９３３，１０．６６６１０．００，扣２．１巧卢０．３４１；０统计学显著性水平．０５一＝各年齡组间抗体平均水平进步两两比较结果：少年组与成年组比较ｆ０．０００，少年组与老年＝组比较户＝組比较Ｐ０．０４４，成年组与老年０．０２３。．６反应的是不同年龄分组下抗ＨｓＮ表２ｉ抗体水平的研究结果。研究对象按照年３３ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文龄差异分为少年成年和老年组，各组的抗体阳性率不同，其中最低的是少年组为３．３３％，其次是老年组为７．０８％，抗体阳性率最高的是成年组为７．８６％。比较各组间＝阳性率差异没有统计学意义（户０．３４１）。整体来看，人群抗Ｈ５Ｎ１流感病毒的抗体阳性率均较低，都在１０％Ｗ下水平。比较各年龄组间抗体几何平均滴度，最低的是少年组仅有１：５．％３，老年组的较少年组高，为１：８．９１０。抗体几何平均滴度在各年龄组中的高低差异趋势与抗体阳性率差异趋势相近，都是成年组的最高。成年组抗体几何平均滴度为１．。：１１０３７各组一＝间的抗体几何平均滴度差异经检验有统计学意义（戶０．０００）。进步两两比较各组间差异，发现每两组间的差异均具有统计学意义。义讨论通过此次对人群血清中抗ＨｓＮｉ流感病毒抗体水平的研究发现，在采集的８０５份普：８０通健康体检人群血清样本中，有５７化血清样本的抗Ｈ５Ｎ１抗体滴度封，被认为血，计算出人群整体抗ＨｓＮ．０８％。将整体样本按照性别分清抗体阳性ｉ抗体阳性率为７．８８％６．２２％。血组后统计各组血清抗体阳性率为女性７，男性清抗体几何平均滴度女性和男性分别为１：９．９７４和１：９．５２７，不同性别间的抗体阳性率和几何平均滴度差异不一具统计学意义。这可能与目前些报道ＨｓＮｉ病例中男牲多于女性的结果有所不一同。进步的还需要采集更具广泛性的人群血清样本进行分析。本研究根据年龄不同，将样本其分为Ｈ个组后讨论组间抗体阳性率差异及抗体几何平均滴度差异，发现少年组的抗体阳性率和抗体几何平均滴度均为最低，老年組其次。这两个组抗体阳性率和抗体几何平均滴度都低于成年组的并且低于人群整体水平。可能是由于成年人免疫系统较为健全和完善，对于流感病毒的感染能够产生较为完善的免疫应答反应，，并且能够产生具有保护效力的抗体。此外随着年龄的增长，成年人较少年组人接触各种流感病毒的机会增多，同型流感病毒感染产生的抗体可能对同型的流感病毒产生交叉反应，为机体提供交叉保护，使得成年组人群感染ＨｓＮｉ的几率下降。老年组人群较少年组人群抗体阳性率和几何平均滴度高可能是因为老年人也较青一年人有更多的流感病毒暴露史，体内存在着定的交叉保护性抗体和免疫记忆。但由于老年人自身免疫功能下降，老年人组的抗ＨＮｉ抗体阳性率及抗体几何平均滴ｓ度较成年组低。一为了进步明确研究结果，之后再采集涵盖范围更广泛，样本容量更大的样本一步调查研究是十分必须的进。并且采集样本时还需对样本来源的个体职业信息进行收集。对于实验数据除了整体进行分析外还需将人群按照职业不同进行特定人群一划分后进步分析。总之，对于ＨｓＮｉ的人群免疫能力更为详细和深入的谓查是具有重大意义的。３４ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文第Ｓ部分流感病毒中国流行株与ＷＨＯ推荐疫苗株亲缘关系的研究■、＞．１？目Ｕ目流感病毒（虹ｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓ）是引起流行性感冒的主要病原体，目前预防和控制流感最有效的方法依然是接种流感疫苗。每年，用于流感疫苗生产的流感病毒毒株均是由ＷＨＯ推荐。因为流感病毒容易发生抗原漂移，ＷＨＯ每年都会重新确认流感疫苗生产使巧的毒株，。ＷＨＯ推荐的毒株针对的是全球广泛性的这些毒株对于中国特定环境下流感病毒抗原的变异情况及流感病毒的流行情况不能够完全反应。这可能使得流感疫苗接种后疫苗成分不能与人群中流行毒株相匹配，使得流感疫苗的有效性降低。现使用流感病毒中国流行株与ＷＨＯ推荐近年疫苗株进行亲缘关系研究，旨在了解国家流感中也发布的流感病毒中国流行株与ＷＨＯ推荐疫苗株之间的亲缘关系，大致推测ＷＨＯ推荐年度流感病毒疫苗株对中国流感病毒流行情况的反应力一。再结合本文第部分关于人群抗流感病毒中国流行株抗体水平的研究结果一，希望能够对中国流感流行株的疫苗株选择及研究工作起到定作用。１．实验材料和方法１．１实验材料１．１．１病毒Ｂｙ／广东蒜湾Ａ１３３／２０１４，国家流感中也提供，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４，国家流感中也提化由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。ＨｉＮｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４，国家流感中也提供，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。Ａｓ／江苏崇川／１８３０／２０１４，国家流感中也提供，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。Ｌ１．２鸡胚９－１０日龄ＳＰＦ鸡配购自北京梅里亚维通实验动物技术技术有限公司。１．１．３菌种３５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文／ＤＨ大肠杆菌￡．ｃｏｉ５ａ由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。１１．４．试剂和耗材（１）试剂ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｒｓｅ、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ水、ｒＴａｑ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒＯＬＳＯＯＱ酶（５０００，３０００，２０００，１５００，１０００，７５０，５００，２５０，１００）购自宝生物工捂（大连）有限公司；ＲｅｖｅｒｔＡｉ过ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔＫ１６２２，购自Ｆｅｍｅ抽ａｓ公司；ＡｘｙＰｒｅｐＤＮＡ凝胶回收试剂盒，购自ＡＸＹＧＥＮ公司；ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒ＶＴ２０６，购自天根生物科技有限公司；ＤＥＰＣ（液体）：购自索莱宝生物科技有限公司。（２）耗材：２００ｌｌ移液器吸头、１．５ｍｌ离也管：购自Ａｘｙｅｎ公司，（将１．５ｍｌ离也管和Ｔｉｐｓ放＾ｇ入干烤过的烧杯中，用超纯水配置成终浓度为０．１％的ＤＥＰＣ水，室温放置７２ｈ，１２ｒｃｉ压２０ｍｉｎ，置温箱烤干，烤干后室温放置待用）；１５ｍｌ、５０ｍｌ离也管：购自美国Ｃｏｍｉｎｇ公司；５００ｍｌ离也桶：购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司；细胞培养用小方瓶、各种规格的灭菌玻璃吸管：由中国医学科学院医学生物学研究所中也供应科提供。（３）仪器和设备ＰＣＲ仪；ＴＡＫＡＲＡＰＣＲ化ｅｒａｉａｌｃｃｌｅｒｄｉｃｅＴＰ６００ｙ；电泳仪ｒｈｏｒｉｗｅｒｌ－６０１：ＧＥＥｌｅｃｔｏｅｓｓＰｏＳｙＥＰＳｐ叩ｐ；一电泳檐北京六－３仪器厂ＤＹＣＰ１ＤＮ；－Ｍｏｅｃｕｒｅｒ＋凝胶成像分析系统：ＢＩＯＲＡＤｌｌａＩｍａＧｅｌＤＯＣＸＲ；，ｇ超微量分光光度仪：ＴｈｅｒｍｏＮａｎｏＤｒｏｐ２０００；；ＴｈｅｒｍｏＭｏｄｅｌ４２０摇床；恒温水浴箱：上海乔枫ＨＨ４２０；超速离也机：ＢＥＣＫＭＡＮＯｐｔｉｍａＬ９０；科裕解化机：山东夏津解化设备研充所；－－超净工作台：苏州净化设备有限公司ＳＷＣＪ２ＦＤ；祸旋震荡仪：德国ＩＫＡＬａｂＤａｎｃｅｒ；微量移液器：ＧｉｌｓｏｎＥｅｎｄｏｒｆ；；ｐｐｔ１１Ｄ电子天平：Ｓａｒｏｒｉｏｕｓ公司ＢＰ２；－高压灭菌锅：日本ＴｏｍｙＳＸ５０。３６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文（４）生物学软件及网站ＤＮＡＳｔａｒ，ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ＃），ＭＥＧＡ５．１１．２实验方法１．２．１病毒培养Ｈ７－。配制Ｐ．２７．４的ＰＢＳ溶液，高压灭菌后用作病毒稀释液将实验使用的病毒■＂毒种分别按照１０倍倍比稀释到适合浓度（实验使用１０倍稀释液），接种１０日龄＞８１？鸡化尿裹液于３４±ｒＣ培养７化，之后收获鸡胚尿囊液，按照附录ＩＩ中所述方‘－法纯化鸡胚尿寞液。分装在１．５ｍｌ无菌离也管中冻存于撕Ｃ冰箱备用或直接使用。１．２．２流感病毒基因片段测序分析（１）引物设计与合成：根据Ｈｏｆｉｎａｎｎ等报道的流感片段扩增通用引物设计ＰＣＲ扩増引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。具体通用引物序列见附录ＩＶ。（２）使用Ｔｒｉｚｏｌ法从鸡胚巧索液中提取病毒ＲＮＡ（３）使用ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔＫ１６２２试剂盒逆转录病毒ＲＮＡ逆转率使用的反应体系见表３．１：表３．１逆转录反应体系Ｔａｂ．３．１Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｓｔｅｍｙ＾－ＭＬＶ＾ＭＢｕｆｅｒ８．０冲ｄＮＴＰ２．０ｉＬ＼ＲＮａｓｅＩｎｈａｂｉｔｏｒ４０Ｕ／Ｌ１．０ｉＬ（＾）｜．ＲＴｓｅ－ＭＬＶ／ａＭＲＮａｓｅＨＯＯＵｊＬ１．５（）口ｆ）阵ＲＮＡａｎｄＰｒｉｍｅｒＭｉｘｔｕｒｅ２１Ｌ＾ＲＮａｓｅＦｒｅｅｗａｔｅｒ６．５呼Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ５０ｉＬ）反应条件：’°°—Ｃ６０ｍ＂一４２ｉｎ＞７０Ｃ１５ｍｉｎ４Ｃ２ｍｉｎ（４）目的基因的ＰＣＲ扩増将步骤（３）中逆转率得到的病毒ｃＤＮＡ作为模板，进行体外扩增。反应体系如表３．２３７ 中国医学科学院化京协和医学院硕±论文表３．２ＰＣＲ反应体系Ｔａｂ．３．２ＰＣ民巧ａｃｔｉｏ打巧Ｓｔｅｍ＾＾？ｒｉｆ＾ＰｍｅｒＳＴＡＲＢｕｅｒ…阵ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ口．５ｍＭ４ｘＬ）｜上游引物口邸ｍｏｌ／冲）ｌ＾Ｌ下游引物口Ｏｐｍｏｌ／ｎＬ）１阵ｃＤＮＡＩＬｍ？ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＨＳＤＮＡｏｌｍｅｒａｓｅ／ｉＬ０．５ｊＬｐｙ。Ｕｆ）｜ｄｄＨＯ３２．５ＬｓｍＴｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ５０＼ｘＬ°‘’一反应条件：９５Ｃｍｉｎ（：，３９８，１０８°°？－６０Ｃ．１５Ｓ（３０ｃｙｃｌｅｓ）＞７２Ｃｍｉｎ，８°７２Ｃ３ｍｉｎ．，（５）凝胶电泳检测ＰＣＲ结果；称取Ｉ琼脂糖置于３００ｍＬ锥形瓶中ＯｍＬ＾ＴＡＥ配制１％琼脂糖凝胶ｇ，加入ｌＯ一缓冲液，摇匀后在微波炉中加热溶解，待其冷却到定温度后，加入如Ｌ（１０ｍｇ／ｒｎＬ）漠化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的已插好梳子的凝胶盘平板中，胶厚度约为５ｍｍ。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，将平板放入水平电泳槽中，电泳液刚好淹没ｘ胶面为最佳。５ｌＬＰＣ民产物和２６ＬｏａｄｉｎＢｕｆｅｒ混匀后加入样品孔中，使用；将叱＾ｇＤＮＡ标准分子量ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ作对照；１２０Ｖ，６５ｍＡ，１０Ｗ，２５ｍｉｎ。于凝胶成像系统中观察有无特异性ＤＮＡ片段扩增产物并保存电泳结果。（６）目的片段切胶回收与载体连接参照Ｍａｒｋｅｒ切下目标片段大小条带，采用ＡＸＹＧＥＮ公司的ＡｘｙＰｒｅＤＮＡ凝ｐ胶回收试剂盒，操作步骤参考试剂盒说明书。回收好的片段使用ＴｈｅｒｍｏＮａｎｏＤｒｏｐ２０００测定片段浓度，之后按照零背景平末端快速连接试剂盒说明书连接ＬＢ－Ｓ至ｉｍｌｅＶｅｃｔｏｒ。载体ｐｐ３８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文表３．３连接反应体系Ｔａｂ．３．３Ｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｌｉｇａｔｉｏｎ？＾纯化的ＰＣＲ片段３．〇ｍＬＬＢ－ＳｐｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ３５ｎ／Ｌｌ．ＯＬ（ｇｎ）ｐ２ｘＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎ５．０〇Ｌ｜Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（３Ｕ／＾Ｌ）１－〇ｍＬＴｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ１０阵反应条件：２２心５ｍｉｎ。（７）感受态的转化：实验时采用热激法转化感受态（具体操作见附录ＩＩ）（８）单菌落筛选：从转化涂布的平板上挑取形态较好、大小适中的单菌落，接种°于ＬＢ（Ａｍｐ＋）液体培养基中，３７Ｃ、２２０ｒｐｍ振荡培养至对数生长期。ＩＵ该菌液为模板，进行ＰＣＲ扩增。用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段大小，保存ＰＣＲ鉴定为阳性的菌液，每个片段取４份样品用于测序。（９）将测序后的序列在ＮＣＢＩ上进行比对，之后使巧ＭＥＧＡ５．１将序列与ＷＨＯ推。荐疫苗株进行进化树绘制，分析其亲缘性２．实验结果与分析２．１病毒基因序列测定２．１．１病毒基因片段ＰＣＲ扩増结果如图３．１所示，Ｗ病毒ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣ民扩増后，经１％琼脂糖凝胶电泳，左图中从左往右四个泳道鉴定，泳道１和２为ＨｉＮｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４，泳道３和４为Ａ３／江苏崇川／１８３０／２０１４ＨＡ片段。右图从左往右四个泳道，泳道１和２为Ｂｙ／广东慕湾／１１３３／２０１４／ＨＡ片段，泳道３和４为Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４ＨＡ片段。中条带大小均正确。切胶后进行纯化回收。３９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文ｂｐＭ＾ＰＭ１２３４：！２３每￣■５０００５０００３〇〇〇Ｐ＾Ｂ＾ＭＭ誦？：＆ｍ７５０ｌＯＤＯ７００己橄）ＩＣ３—ｌｌｉｌｉｔ＾＾Ｅ３ｊ￡＊ＳｗｍｉＨ＾＾巧歡读．甲－—■ａａａＭａ＾ＪＫ＾ｌＫｌｉＨＨＨ－｜，？：ｉ｜｜｜｜｜＾Ｂ＾＾Ｐ王擲巧０—ｗｉｉｉｉｙｔ＾Ｂ１００—ｉｉｉＨｕｍｉ图３．１病毒ＨＡ片段ＰＣ民扩增电泳图Ｆｉ．３．１ＥｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｒａｍｏｆＨＡｓｅｇｍｅｎｔｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｇｐｇＭ１２￥４Ｍ１ａ４Ａ．，，Ｓ８）ＣＫ２０００＊＝）ｐ＇ｌｗｍｍ－？ｈｔｈｐＪｉｇ１禱１励■＾＾？■＊＇＊巧〇＇—Ｓ＂７妨，＂…ｉＲ、Ｍ？叩ｉ胥口ｊｌＩ而耳巧ｉｊ；ｉ’ｆｌ＊？５００苦５鄉ＩＨＭｅ．Ｖ居爲＿Ｊ．．１，，誦２Ｓ０２５０．請考图３．２病毒ＮＡ片段ＰＣＲ扩增电泳图＊ｍｎｚａＦ．ＥｅｃＮＡｓｎｆｌｕＶｒｉｇ３．２ｌｔｒｏｐｈｏｉｅｇｒａｍｏｆｅｇｅｎｔｏｆｉｅｉｕｓ图３．２中，左图中从左往右四个泳道，泳道１和２为ＨｉＮｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４，泳道３和４为Ａ３／江苏崇川／１８３０／２０１４ＮＡ片段。右图从左往右四个泳道，泳道１和２为Ｂｙ／广东蒜湾／１１３３／２０１４／ＮＡ片段，泳道３和４为Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４ＮＡ片４０ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文段。切胶后进行纯化回收。２丄２菌液ＰＣＲ鉴定阳性克隆ＬＢ－ＳｍｌｅＶ，纯化回收的病毒基因片段经浓度测定后连接到ｐｉｐｅｃｔｏｒ转化大肠杆菌感受态ＤＨ５ａ感受态细胞。平板上挑取单克隆菌落后在含有Ａｍｐ的ＬＢ培养基中进行培养，之后使用菌液作为模板采取与之前ＰＣＲ相同的条件进行菌液ＰＣＲ，结－果如图１．３３．３１２Ｎ／８７／２０Ｈ．２和１所示。（图中从左起１号泳道为Ｈ吉林朝阳／１１１４Ａｉｉ－片段菌液ＰＣ民结果图，１３２４泳道为Ａ３／江苏崇川＾８３０／２０１４ＨＡ片段菌液ＰＣ民结３－２０果图．４中１２／１４ＨＡ；图左起１号泳道为Ｂｙ广东窺湾／１１巧／片段菌液ＰＣ反结果３－２４８０图，１号泳道义Ｂｖ／北京海淀／１３／２０１４ＨＡ片段茵液ＰＣ民结果图）。选取具有目标条带的阳性克隆茵液送测序。ｂＭｌ２３４５７８９ＷＵ口１３Ｗ巧化ｎ巧１巧２ｐ６１９汾２３２４‘＊－王奶国類ＴＳ奇—＇－ｒｉＢｒ巧ｒ＊刮Ｊｙ＾Ｍｆ＊ｊｕｙｐ＾｜＾＾Ｖ图３．３Ａ型流感病毒ＨＡ片段菌液ＰＣ民电泳圓Ｆｉｇ．３．３ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰＣＲｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｇｒａｍｏｆＨＡｓｅｇｍｅｎｔｏｆｔｙｐｅＡｉ打打ｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＭｌ２３４５６７８９１０Ｕ１２１３ｉ４Ｕ１６１７ＩＳ巧２０２１２２２３２４３Ｂ图．４型流感病毒ＨＡ片段菌液ＰＣＲ电泳图Ｆｉｇ．３．４ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰＣＲｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｇｒａｍｏｆＨＡｓｅｇｍｅｎｔｏｆｔｙｐｅＢｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ４１ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文Ｍ１２３４５６７Ｓ９？１１１２？Ｍ巧１６ｎ证１９２０过２２巧ｂｌＩ＂ｌｌｌｐ—１—ｆＩ１１１１１１１—图３．５Ａ型流感病毒ＮＡ片段菌液ＰＣ民电泳圏＊ｍＦｉ．３５ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰＣ民ｅｌｅｃｔｒｏｈｏｉｅｒａｍｏｆＮＡｓｅｅｎｔｏｆｔｅＡｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｇ．ｐｇｇｙｐＭｌ２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５化１７巧巧２０２１２２ｇ圍ＩＭｌｌｌｌｉｉｍｉＭｉｙｉｉ—ｌｌＢ？‘＂－７５０？带．巧瓦協罕巧画草解输洲ＨＩＰ階留图３．６Ｂ型流感病毒ＮＡ片段菌液ＰＣ民电泳圈Ｆｉ．３．６ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰＣ民ｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｒａｍｏｆＮＡｓｅｍｅｎｔｏｆｔｅＢｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｇｐｇｇｙｐ３１－１Ａ片图．５中从左起１２号泳道为Ｈ８７／２０１４Ｎ段菌液ＰＣ民结果ｉＮｉ／吉林朝阳Ａ團－，１３Ｕ泳道为Ａ３化苏崇川／１８３０／２０１４ＮＡ片段菌液ＰＣＲ结果图３．６；图中左起－－ＮＡ片１１５号泳道为Ｂｙ／广东窺湾／１１３３／２０１４段菌液ＰＣ民结果图，１６２２号泳道为’Ｂｖ／北京海淀パ３８０／２０１４ＮＡ片段菌液ＰＣ艮结果图。选取具有目标条带的阳性克隆菌液送测序。２．２流感病毒中国流行株与ＷＨＯ推荐疫苗株表面抗原基因比较将测序结果进行拼接后得到病毒基因的全序列。选取２０－２０１０至２０１４年北半球各个地区流行的主要代表毒株与２０１３１５年的疫５－苗株进行ＨＡ序列全长的比对使用ＭＥＧＡ．１构建进化树（ＮＪ法），此来分析各个毒株间与疫苗株ＨＡ蛋白的差异，。ＷＨＯ推荐疫苗株在ＷＨＯ网站查询并且在ＮＣＢＩ上获取其ＨＡ片段的全序列加入进化树绘制，结果如下所示。４２ 中国医学科学院北京协和医学晚硕±论文Ａｆ３ａｒａ／１２２６８＾１３Ｈ１Ｎ１（）ＩＷ加ｔａｒｉＷ５４／２０１３Ｈ１Ｎ１１日＜）？Ａ＾ｅｗ＊Ｙｏｒｋ／Ｗ０４■他１３０１１湖１！雖…）２７一ＷＮＡ／Ｑｕｅ！ｊｅｃ／３ｒａ）１４１（）ｅｓＡ細如７５佩１村巧／Ｈｔ／＾１挪１Ｉ５５Ａｓｖ４／Ｇ＾Ｂｔｅ／Ｏ５／２０１Ｈ１Ｎ１苗＾１＾古（）、＾ＩｉＶＳｉＡ／Ｇ＾的娜ｅ／腑２０１３Ｈ１Ｗ身如（３．Ｉ。ＳＷＬ１：ＭＪ咖伽〇１股。０１４Ｆ純Ｅ．辟东１醉－１：Ｉ畑／ｉ脱０ＡＲｌ／２０１４护州１）ＩＡ／Ｋｅｎａ／泌８／２０１３Ｈ１Ｗｙ（）Ａ／如料畑知ＧＰ２８９２／＾１０ＨＷ｛）广ＩＡ／ｒｔａｎｔ－ａ－ｒｅａｓｓｏ／ＮＹＭＣＸ１７９ＡＣａｌｉｆｏｍｉ／０７＾００５ｘＮＹＭＣＸ１Ｓ７１Ｎ１（ＫＨ）Ｉ＇０．００１图３．７ＨＮ流感病毒中国流行株表面抗原ＨＡ进化树ｉｉＦｉｇ．３．７ＣｌａｄｏｇｒａｍｏｆＨｉＮｉｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉ打ｉｎＣｈｉｎａ＾ｒｎｎｈｉｍｔｉｍｉｍｍｍｍｍｍｍｉＩＥｌＡｉａ？｜ｙ？ａ＾６１？ＦＷｍＢＢａＭ３｜ＩｄｔＭｇｊ＊化ｇｙＭａｗＭＢａＨａｇｆｉｉｙｕｍｍｍｍｓｅｍｕＭｍｍｒｎｍｕｍｍＭｍＭｐｉｍｍｘｗｇｍｍＩ１ｍｔ３流感病毒中国流行株表面抗原ＮＡ进化树图．８ＨＮｉｉＦｉｇ．３．８ＣｌａｄｏｇｒａｍｏｆＨｉＮｉｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｉｎＣｈｉｎａ如图３．７图３．８所示，ＨｉＮｒ流感病毒中国流行株町Ｎｉ／吉林朝阳／１１８７／２０１４与ｓｏｒ－ＷＨＯ推荐疫苗株Ａ／ｒｅａｓｔａｎｔ／ＮＹＭＣ／Ｘ１７９Ａ分别在进化树上的两枝，两个毒株表，一定差异面抗原蛋白在遗传上可能上存有。ｆａ４Ａ＾（＾ｅ／Ｃ２０Ｏ９．８６３Ｓ０Ｇ＾＾２５＾ｔｐ）ｊ巧－－ｎｏｎＱ９０？２６Ｖ１０Ａ／２００３／ＨｏｇＫ＾＾＾）２Ｃｕｓｔｒａ＾＾０＾ＨＡ／ＡＢ３４３Ｎ２）涵如祕１Ｗ城琴孤２）巧Ｉ＊１沉＊１００ＡｓｕｉＨｉ（ｕａｎ／４ｇＣｈ９＾＾１８３０／２０１４—Ａ／Ａ００ａｉｓｔｒ油公谢２＾玛Ｌ．Ａｆｃｍ＾ｓｒｊｍ２８６ｍ＞ｍ＾４２｝ＩＩ麵ｉｂｉｒｓｋ／£Ｓ泌潮Ｍｅａ－ｓｓｏｒｔａｎｔＷＭ＾Ｘ２２３ＷＲ３ｅｉｔｏ胁〇／泌１微ＸＡ／Ｔｅｘａｓ／ｙ＾１２（）ＩＩａ放２圍３．９Ｈ３Ｎ２流感病毒中国流行株表面抗原ＨＡ进化树ＦｉｌｄｏｆｉｆｌｉｉｄｉｔｒｉｉＣｈｉｇ．３．９ＣａｇｒａｍｏＨ３Ｎ２ｎｕｅｎｚａｖｒｕｓｅｐｅｍｃｓａｎｎｎａ４３ 中国医学科学院北京协和匿学院硕±论文ＡＡ？７２ｍ２０ｌｉｉｅＲｚａｉｙｍｓＡ／ＨｏｒｔＷＨ０８＆ｉ＾０＾Ｎ＾（＾Ｉ０Ｇｍｔｕｔｒ！ａＡ＾Ｐｒｎ＾ｙｍｍｆ＾＾Ｉ－ＩＡｔｆＭ？渝綱Ａ化ｓｌ０ｔｆａｉａ呪２０８（閒哟ＩＷｉｒｓｉｒｕｓＷＳｂｏｒｅ？ｆｌ〇ｅ／０ＮｒａＡ（ｇａｐ２ａ８３２ＣＷ３２｜ＩＩｉｕ＆ｎｚａｖｔｉａａａｉｒＭＡｉＡ／Ｃ０ｆｏｍｒ／Ｒａ２Ｓ５２ＣＫｆｉｐ｛３Ｎ２３（｜ＩＭｗｍａ＼ｎｉｓｃＭ〇ｉ）ｒｓ（ＡｉＡＭｉｉｌ＾２Ｂｆ２００９ＱＮ２（＾ｇ■Ａｉｔｏｎｃｉｉ／ＪａｎｇｉＣｈｇｈａｔｆＳ３Ｂ２０１４［ＩｆｉｏｄｔｎＨｕａｎｚａＡＭ＾Ａ＾ｆｉｉａｔａ＾ｌＵ？７２Ｄ１０ｌ３Ｍ２｛ｇｐ＾ｋ＾ｌ口ａｎａＡ加ｓｒｅａ巧ｏｒｔａｎｔ＾ＭＣＸ２２３Ａ／ＰｕｆｔｏＲｉｃｃ＾议ＸＡｒｒＢＣｕｆｉｆ２（？２ｌ３Ｎ２與（）９｜Ｉ１９ｊｍ图３．１０Ｈ３Ｎ流感病毒中国流行株表面抗原ＮＡ进化树２Ｆｉｇ．Ｓ．ｌＯＣｌａｄｏｇｒａｍｏｆＨ３Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｉｎＣｈｉｎａＨＮ２流感病毒中国流行株Ａ３／江苏崇川／１８３０／２０１４与ＷＨＯ推荐疫苗株３一Ａ／ｒｅａｓｓｏｒａｎ－ｔｔ／ＮＹＭＣＸ２３未出现在进化树上的同分支，说明两者表面抗原蛋白在进化上存在一定的差异即其遠传背景可能存在差别。日旧ｒｉｓｂａ口日巧日／２０。８９５Ｉ－＾Ｂ／ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ／ＮＹＭＣＢＸ３１＾巧ＩＢ／Ａｕｃｋｎｄ／／ｌａ１０６２００８ＢＡ／ｉｃｔｏｒｉａ／８０４／２０１１■５８巧Ｉ日巧ｙｄｎｅｙ／５１５Ｃ０１１ＩＢ／Ｋｅｎｙ如１０３／２０１１ＩｐＱＩ—１日／ＣｈＷ１０１／２０１１ｒ４８ｒｉｓｔｃｈｕｒｃ日／ＮｅｗＹｏｒｋ／１：３７ｙ２０１２（Ｉ３７Ｉ日氾ｅｉ／／ｉｈＶＯ目２０１１５７ＩＫ／ＢＵａｍｍｕａｓｈｍｉｒ／Ｖ０２２０１１＇Ｉ日／Ｂｏｓｔｏｎ／ＹＧ巨０１Ｍ５／２０１３ＩＢ－／Ｎｉｃａｒａｕａ／ＡＧ日２／１ｇ３０２０２—＇＊日ｅｉｔｎＨａｉ／。８６。０１３ｉｄ加ＭａｊｇｙＩ１０．００１图３．１１目Ｖ流感病毒中国流行株表面抗原ＨＡ进化树Ｆｉ．３．１１ＣｌａｄｏｒａｍｏｆＢｖｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｉｎＣｈｉｎａｇｇｐ斗４ 中闊原学科学院北京协巧医学院硕±论文ｈ＾ｓｎｚａ５々ＩＳ０／Ｖ虹拉化Ｉ城巧（巧Ｉ３１抗巧曲脏（Ｂ／ＶＩｃｔａｌａ／微４？１巧￡巧ＩＢ＞ｌＢ／Ｓｄｎａｙ／５１＆２Ｄ１１ｉｕｓ（ｙ）ｎｉ想巧ｎｚａＢ々ｕｓＢ／Ｑｓｌｓｔ诚ＵＴＣ把１０１／滋１（巧姑ｈｉ册巧巧地巧贷／Ａｌｌ泳細违１０６猫）０８）Ｉｈｔｏｎｚａ改扣瞄＾汾解Ｂｖｈｉｓ目抵姑（Ｊ￣＾脯觸８Ｂ輪（孜ｒｅ＾ＫｔａｎＷＪＹＭＣ機１｛蜘１９４０Ｘ臟細㈱峰如触碱巧Ｉ＂ＢＳＭｕ说ｚａ８地说騰觀哄ａ＾ＡＧ磁Ｃ從０巧Ｗ（Ｊ＾ＩｎＳ贿ｎｚａＢ地说似Ｂｏｓｔｏｎ／ＹＧ良０１００５＾扔巧Ｉ１ｉｍ％图３．１２Ｂｖ流感病毒中国流行株表面抗原ＮＡ进化树Ｆｉ．３．１２ＣｌａｄｏｒａｆＢｖｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｉｄｉｔｉｉＣｈｉｎｇｇｍｏｓｅｐｅｍｃｓｒａｎｎａ如上两图所示，流感病毒中国流行株Ｂｖ／北京海淀／１３８０／２０１４ＨＡ片段与ＷＨＯＢｒｔｔ／ＮＹＭＣＢＸ－３１推荐疫苗株／ｒｅａｓｓｏａｎ表面抗原蛋白分别位于进化树上的不同分枝，遗传上同源性较低。Ｂｕｅｂｅｃ日７／Ｑ／０７／２０１４Ｉ日Ｉ—Ｂ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｍ２／２Ｑ１４叫化防ＮｅｗＹ加１？／。３０。０１２－—Ｂ／ＧｕａｎｏｎＬ如ｇｉｗａｎ…巧猫）１４Ｆｅｂ：Ｅ＇团Ｂ２５／２０１拍ｒｉｓｂａｎｅ＂１—Ｂ／Ｓｙｄｎｅｙ／３４／２００ＳＢ／Ｃｈｒｋｔｃｈｕｒｃｈ３＾００８／—Ｉ８／１＾ａｎａ：ｇｕａ／３３８７．Ｑ３／２００８９ｔ１—Ｂｃａｒａｕａ５／Ｎｉｇ／１１０１／２００８Ｂ／Ｎｓｉｒｏｂｉ／１５巧前３５４ｌＢ／Ｍｉｓｓｏｕｉ／０３／２００８Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／Ｃ］２／２０１２Ｉ１ａ如２３１Ｂ图．３ｙ流感病毒中国流行株表面抗原ＨＡ进化树Ｆｉｇ．３．１３ＣｌａｄｏｇｒａｍｏｆＢｙｉｎｆｌｕｅｎｚ汪ｖｉｍｓｅｉｄｅｍｉｃＳｔｒａｉｎｉｎＣｈｉｎａｐ４５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文－Ｂ伽綠呵泌５１１＠ｇｙ￣—１Ｍ．Ｏ３２￡ＭＢｉｆｏｉ８Ｂｉｙａｎ０ｉ／３＾７／ｍｏＭｉａ）（＾—Ｂ伽／Ｓｌｉ３４／２０（％Ｃｆ？＾ｐ］ｆ》４４—。Ｂ脯０觀ＯＭ＾俯＞Ｏ＾５８ｍｍｉｄ１３３ＣｍｉｉＢｖｉｒｍｐＮｅ＾Ｙｏｉｔｃ／＾厂—Ｉ—ＢＭｕｋｚ。曲ｓ／Ｏ＾ｔｃｔｕｒｃｈｆＳ＾＾Ｋ巧＾—ＩＩｑＢｕｂ＾ＢｉｉｍＩｉ＾ｗ，献＾脚８ｔｔ＾２ｉ２０Ｉｔ）ｒＳ巧—？ｄｏｎ４Ｊ？ｍｍａｆｌＭ４＾Ｇ＾＾ｇ１ＩｏｉｍｓＮＡ进化树图３．１４Ｂｙ流感病毒中国流行株表面抗原ｃｎｈｉｎａＦ．１ｒａｉｆｌｖｉｒｕｓｅｉｄｅｍｉｓｔｒａｉｉｎＣｉｇ３．４ＣｌａｄｏｇｍｏｆＢｙｎｕｅｎｚａｐＢｙ／广东窺湾／１１３３／２０１４与ＷＨＯ推荐疫苗株Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｓｅｔｓ／０２／２０１２遗传上存在一ｅｗｏｒｋ／３／２０１４Ｙ／１３３０／２（Ｈ２进化树上距离定差异。相比下，Ｂｙ／广东蒜湾１１３与Ｂ／Ｎ还较近。３対论流感病毒中国流行株每年由国家流感中也经过各方面综合评定分析后向社会公布。流感病毒中国流行株能够反映相应型别流感病毒在中国的流行情况。流感病毒ＷＨＯ推荐同的流行在不同地区存在不同，所本研究采用流感病毒中国流行株与一年份流感疫苗推荐株进行表面抗原蛋白基因的亲缘关系分析，发现流感病毒中国一定差异流行株与相应型别的ＷＨＯ推荐疫苗株在进化上存在，这可能造成使用推荐疫苗株生产的流感疫苗，其中的有效成分与在中国流行的流感病毒匹配度不够高，进而影响疫苗的保护效率。一ＨＮｉ、本文第部分人群血清抗流感病毒中国流行株抗体水平的研究发现对于ｉＢｖ、Ｂｙ流感病毒中国流行株，人群血清中抗这Ｈ个流感病毒中国流行株的抗体阳乏相应抗体而感染，ＨＮ、Ｂｖ、性率较低，当这些病毒再次出现时，人群会由于缺ｉｉ一。Ｂｙ流感病毒中国流行株有可能引起流行，尤其是在老年人和青少年中从另角。使用此类毒株制度来看，此类型具有潜在流行可能的毒株可作为流感疫苗备选株备疫苗，疫苗成分更能与流感病毒在中国人群中流斤情况匹配，疫苗免疫效果有可能更佳一国流行株交叉中和抗。但进步的还需采用中和试验评价疫苗免疫血清对中体水平的差异。，Ｗ为评定是否有必要采用中国流行株制备流感疫苗提供依据４６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文参考文献ＴｏｎＳＺｈｕ义Ｌｉｅｔａｌ．Ｎｅｗｗｏｒｌ过ｂａｔｓｈａｒｂｏｒｄｉｖｅ巧ｅｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓＪ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏ［。ｇ，，义［〕ｇ，２０１３，９（１０）：ｅｌ００３６５７．２Ｔｏ打ＳＬｉＹＲｉｖａｉｌｌｅｒＰｅｔａｌ．ＡｄｉｓｔｉｎｃｔｌｉｎｅａｅｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｍｓｆｒｏｍｂａｔｓＪ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ［］ｇ，，［］，ｇ－ＳｃｉＵＳＡ２０１２１０９１１：４２６９７４．，，（）＂口］ＩｎｆｌｕｅｎｚａＴｙｐｅＡＶｉｒｕｓｅｓａｎｄＳｕｂｌｙｐ巧Ｇｅ打ｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏ打ｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅ打ｔｉｏｎ．２Ａｐｒｉｌ２０１３．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ１３Ｊｕｎｅ２０１３．＂＂Ｕｎｉｅ打ｅｗｆｌｕｖｉｒｕｓｆｏｕｎｄｉｎｂａｔｓ．ＮＨＳＣｈｏｉｃｅｓ．１Ｍａｒｃｈ２０１２．［Ｗｑｕｍｅ打－ＦｅｎＳＺＪｉａｏＰｉＷＢｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｔａｎｄｓｔｒａｔｅｉｅｓｏｆｃｅＵｃｕｌｔｕｒｅ１：ｅｃｈｎｏｌｏｆｂｒ口］ｇ，氏Ｑ，ｐｇｇｙ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅＪ．ＡｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ目ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１１８９４：８９３９０２．［］ｐｐ，，（）［巧ＫａｓｈＪＣａｎｄＴａｕｂｅ打ｂｅｒｇｅｒＪＫ．ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＶｉｒａｌ，ＨｏｓｔｊａｎｄＳｅｃｏｎｄａｒｙＢａｃｔｅｒｉａｌＦａｃｔｏｒｓｉｎ－ＩｎｆｌｕｅｎｚａＰａｔｈｏｅｎｅｓｉｓＪ．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ２０１５１８５：１５２８１巧６．ｇ［］，，巧）７ｈｔｔ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｏｖ／ｆｌｕ／ａｂｏｕｔ／ｄｉｓｅａｓｅ／ｈｉｈｒｉｓｋ．ｈｔｍ［］ｐｇｇ＿［８］ＤａｖｅｎｐｏｒｔＦＭ，ＨｅｎｎｅｓｓｙＡＶａｎｄＦｒａｎｃｉｓＴ，Ｊｒ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆａｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ打ｏｆａｎｔｉｂｏｄ化ａｎｔｉｅｎｉｃｖａｒｉａｔｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｓＪ．Ｊ巨ｅｄ１９５３９８６ｇｙｇｎｍ［］邱Ｍ，，（）：６４－１５６．［９］ＥｕｒｏｐｅａｎＭｅｄｉｃｉｎｅｓ，ＱｕｅｓｔｉｏｎｓａｎｄＡｎｓｗｅｒｓｏｎｔｈｅＲｅｖｉｅｗｏｆＰｒｅｆｌｕｃｅｌａｎｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＧｅｎｅｓ，２０１２．°－－１０ＩｎｆｌｕｅｎｚａｅａｓｏｎａｌＦａｃｔｓｈｅ巧Ｎ２１１．ｗｈｏ．ｉｎｔ．Ｍａｒｃｈ２０１４２０１４１１２？［］巧）［別Ｄａｗｏｏｄ巧ｌｕｌｉｄｌｌｍｏｒｔａｌｉｉｔｉ化化ｉａｎｏＡＤＲｅｅｄＣｅｔａｌ．Ｅｓｔｍａｔｅｏｂａｔａｓｓｏｃａｅｄｗｅｆｉｒ巧１２，，，ｇｙｍｏｎｔｈｓｏｆ２００９ａｎｄｅｍｉｃｉｎｆｌｕｅｎｚａＡＨｌＮｌｖｉｍｓｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：江ｍｏｄｅｌｌｉｎｓｔｕｄＪ，ＴｈｅＬａｎｅ巧ｐｇｙ［］ｎｆｅＤｉ２０１２口－Ｉｃｔｉｏｕｓ：．ｓｅａｓｅｓ６８７６９５，，巧）１ａｗａｒｄＡＣＦｒａａｓｚＥＢ，ＢｅｒｍｉｎｈａｍＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍａｒａｔｉｖｅｃｏｍｍｕｎｉｂｕｒｄｅｎａｎｄｓｅｖｅｒｉｔ［巧Ｈｙ，ｇｙｇｐｔｙｙ＊ｏｆｓｅａｓｏｎａｌａｎｄａｎｄｅｍｉｃｉｎｆｌｕｅｎｚａｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅＦｌＷａｔｃｈｃｏｈｏｒｔｓｔｕｄＪ，Ｌａｎｅ巧民ｅｓｉｄ：ｉｅｕｒＭｅｐｙ［］ｐ，２０－１４２６４４５５４．，（）：－１３曾祥兴，李康生．流感百年：２０世纪流感大流行的回顾与肩示化医学与社会，２０１０，１１：４６．［］Ｍ曹觀扬蒲区人群甲型Ｈ１Ｎ１流感感染状况及疫苗免疫接种效果巧估脚雇旦大学，２０１２．［］（１５耿兴良．化血清及无血清培养Ｖｅｒｏ细施和甲型流感病毒Ｈ１Ｎ１）的硏究Ｄ．北京协和医学［］［］院名０１４．１６杨景哮．描Ｎ２亚型流感病毒Ｖｅｒｏ细胞冷适应株减毒特性及假病毒评价中和抗体的研究０？［］［］北京协巧医学院，２０１４．。７ＦａｕｃｉＡＳａｎｄＭｏｒｅｎｓＤＭ．ＴｈｅＰｅｒｅｔｕａｌＣｈａｌｌｅｎｅｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ＾］．ＮｅｗＥｎｌａｎｄ］ｐｇｇ２０１２－Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ；３４５４４６１．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，，６６（５）：１８純宏辉侯俊，赵敏，ｅｔａｌ．ｌＮｌ流感患者血清流感病毒血凝抑制抗体滴度变化分祈［］，甲型Ｈ２０１２２６４２７０－２７２化中华实验和临床病毒学杂志，（）：，４７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文１９ＺｈａｎｃｍＸＰａｎＷｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏ打ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔ［］ｇＲｇ，，ｇ２００９化ａｓｏｏａｌｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｓｔｒａｉ打ａｎｄｔｈｅｅｍｅｒｉｎｇｓｔｒａｉｎｓＨｌＮｌａｎｄａｖｉａｎｇＳｃａｎｄ－ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０１１４３３２１６２０，：，（）［２０］ＹｅｎＨＬａｎｄＰｅｉｒｉｓＪＳ．ＭａｐｐｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｔｈｅａｖｉａｎＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａＶＰＬｏＳＭｅｄ，２００９，６（４）：ｅｌ００００６４２ｋｉｅｒｔＤＢｈａｂｈａＧＥｌｓｌｉ巧ＭＡ，ｅｔａｌ．Ａ打ｔｉｂｏｄｏｎｉｔｉｏｎｏｆａｈｉｈｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｆｌｕｅｎｚａ［。Ｅ。ｇｙＫｃｇｇｙｖ－ｉｍｓｉｔｏｅＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００９３２４５９２４：２４６５１，，巧ｐ［］（）口巧ＰｅｉＳ，ＸｉｏｎｇＮ，ＺｈａｎｇＹ，ｅｔａｌ．ＩｎｃｒｅａｓｉｎｇＭ２ｅｐｉｔｏｐｅｄｅｎｓｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｓｓｙｓｔｅｍｉｃａｎｄｍｕｃｏｓａｌ－ｉｍｍｕｎｅＫｓｏｎｓｅｓ化ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓＪ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔ２００９３１１２：１８５１６．ｐ［］，，（）３Ｐ－口ｉｃｈａｎｋｕｌＳＪｏｎｋａｅｗｗａｔａｎａＡ，ＴｈｉｔｉｔｈａｎａｎｏｎｔＡ，ｅｔａｌ．ＣｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｅＡｎｔｉｂｏｄｉ巧ａｉｎｓｔ］ｙｇ，ｇｙｇａａｖ－ｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓＡＨ５Ｎ１Ｊ］．ＥｍｅｒＩ打ｆｅｅｔＤｉｓ，２００９，１５：１５３７９．（）［ｇ巧）［２４］熙业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案田Ｂ］．：中国国家流感中也资源中也，２０－－１１８１５．５Ａ－ｌｌｗｉｎｎＲＧｅＵｅｒＪＢｅｒｅｒＡｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔｓｗｉｎｅｏｒｉｉｎ口］ｊ，ｇ，ｇｇｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｍｓＨｌＮｌ／０９ｂｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｈａｅｍａｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂｙ，ｇｇ，ｙｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔｓ：ｈｏｗｉｓｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｒａｔｅｏｆｒｏｔｅｃｔｉｎａｎｔｉｂｏ出ｅｓｉｎｈｕｉｎａｎｓ？Ｊ．Ｍｅｄｐｇ［］ｂ－ＭｉｃｒｏｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ２０１０１９９２：１１７２１，，（）口巧ＲａｈｎＪ，ＨｏｆｉｎａｎｎＤ，ＨａｒｄｅｒＴＣ，巧ａｌ．ＶａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｍｓ巧ｉｎｐｏｕｌｔｒｙａｎｄｓｗｉｎｅ：－Ｓｔａｔｕｓａｎｄｆｏｔｕｒｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ２０１５３３１：２４１４２４２４ｐ，，｜７］口）口７］ＴａｂｙｎｏｖＫ，ＫｙｄｙｒｂａｙｅｖＺ，ＲｙｓｋｅｌｄｉｎｏｖａＳ，ｅｔａｌ．Ｓａｆｅｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａｎｏｖｅｌ－ｌｄ－ｔ－ｃｏａｄａｅｄｍｏｄｉｆｉｅｄｌｉｖｅｅｕｉｎｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｉｉｎｅ？ＡｔＶｔＪ２０１４９２１１４５０．ｐｑｖｍｓｖａｃｃ口］ｕｓｅ，，（）：７［２８］康来仪编．实用传染病防治［Ｍ］净苑出版化，２０１０：巧ｔ２９黄婷，潘明唐欣宇，李天舒刘磊，孙唯，张晓春，陈恒郝彩霞，刘学成．四川省成都市甲型Ｈ１Ｎ１［］，，，Ｊ－．预防医学情报杂志２０１０１０７８０７８３．流感血清学调查结果分析［］，，：［３０］吕锡宏，杨忠东，陈浩，蒋懿，居丽委，朱渭萍，申惠国，周艳冰，蒋露芳，施强，姜庆五．上海地区２００９年人群甲型流感病毒抗伟水平监测［Ａ］．安徽省预防医学会、江西省预防医学会、江苏省预防医学会、浙江省预防医学会、山东省预防医学会、福建省预防医学会、上海市预防医学会．华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议２０周年庆典论文汇编［Ｃ］．安徽省预防医学会、江西省预防医学会、江苏省预防医学会、浙江省预防医学会、山东省预防医学会、福建省预防医学会、上海市预防医学会：２０１０：４．，［３Ｕ张毅，王幼明，王芳，王静静，毕玉海，尹燕博，Ｔ家波．我国禽流感研究进展及成就［Ｊ］．微生物２０－学通报，１４，０３：４９７５０３．口马Ｗａｔａｎａｂｅ义Ａｒａｉ义。ａｉｄｏｊｉＴ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｖａｒｉａｎｔｓｗｉｔｈｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］，ＭＢｉｏ，２０１５，６口）？魏传芳庫咏觀禽流感病毒与人类流感病毒的关系阴－３．莱钢科技２００６０２：７３７４．［引，，４８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文３４ＬｉＺＣｈｅｎＨＪｉａｏＰ的沁ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｏｆｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｕｃｋＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ巧ｉｎａ［］，，，ｐｍａｍｍａ－ｌｉａｎｄｅｌｉｌ８：１２０ｍｏｕｓｅｍｏ［Ｊ］．ＪＶｒｏ２００５７９５８６４．，，＾）－－３５ＪｉａｏＰＴｉａｎＬｉＹｅｔａｌ．ＡｓｉｎｌｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅＮＳ１ｒｏｔｅｉｎｃｈａｎｅｓｔｈｅ［］，Ｑ，ｇｐｇ－ａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｏｆＨ５Ｎ１ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｍｉｃｅＪ．Ｊ＼Ｔｒｏｌ，２００８，８２３：１１４６５４．ｐｙ［］（）３６ＺｈａｎＳｕｎＹ，ＳｕｎＨ，ｅｔａｌ．Ａｓｉｎｌｅａｍｉｎｏａｃｉｄａｔｔｈｅｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｃｌｅａｖａｅｓｉｔｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ［］ｇ乂ｇｇｇｇｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄ打ｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅ打ｃｅｏｆＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｍｉｃｅ口］．Ｊ２０１２，８６（１２）：６９２４－３１．［３７］ＺｈａｎｇＷ，ＳｈｉＹ，ＬｕＸ，巧ａｌ．Ａｎａｉｒｂｏｒｎｅｔｒａｎｓｍｉ巧化ｌｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＨ５ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓｅｅｎａｔ－化ｅａｔｏｍｉｃｌｅｖｅｌ阴？Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３，３４０６１巧：１４６３７．，（）－Ｗｏ－３８ｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒａｎｉｚａｔｉｏｎＷＨＯａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｗｅｂｓｉｔｅ２０１５５１８．［］ｇ（），口种Ｒｅｖｉｅｗｏｆｌａｔ巧ｔａｖａｉｌａｂｌｅｅｖｉｄｅｎｃｅｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｈ５Ｎ。ｔｈｒｏｕｇｈｗａｔｅｒａｎｄｓｅｗａｇｅａｎｄｗａｙｓｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｒｉｓｋｓ化ｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈ．＊Ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｗａｔｅｒｓａｎｉｔａｔｉｏｎｈｅａｌｔｈ／ｅｍｅｉｉｎ／ｈ５打１ｂａｃｋｒｏｕｎｄ．２００７．１０．１０．＿＿ｇｇｇ［４０］许阳驚张钟，吴小清，王煉翔，苏晶晶，洪鍾库罗菊，马涛，谢国祥．南京市人感染Ｈ７Ｎ９禽流感－流行病学调查Ｊ：．现代预防医学２０１４１０：１７３４１７巧．［］，，－＂郭元吉，程小霎流行性感冒病毒及其实验技术［Ｍ］．北京：中国Ｈ峡出版社，１９９７：２３４５．［］［４引ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＪＳ，ＮｉｃｏｌｓｏｎＣ，ＢｏｏｔｍａｎＪＳ，巧ａｌ．Ｓｅｑｕｅ打ｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈａｅｒｎａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）ｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡＨｌＮｌ）ｖｉｒｕｓｅｓｒｅｓｅｎｔｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｃｏｍａｒｉｓｏ打ｗｉｔｈｔｈｅＨＡｏｆ（ｐｐ－ｔ－ｌａｂｏｒａｔｏｒｄｅｒｉｖｅｄｖｉｒｕｓ．ＧｅｎＶｉｒｏｌｌ９９１７２Ｐｌｌ：２６７１２６７７．ｙＷ，（）４３Ｈｏｆｉｎａｎｎ－ＥＳｔｅｃｈＪＧｕａｎ义巧ａｌ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｒｉｍｅｒｓｅｔｆｏｒｔｈｅｆｉｉｌｌｌｅ打ｔｈａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｌ，，［］ｐｇｐ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ａｒｃｈ＼％ｏｌ２００１１４６１２：２２７５８乂，，［］（）４９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文附录Ｉ英文名缩写ＡｂＡｎｔｉｂｏｄｙＡＡｎｔｉｅｎｇｇＡＴＣＣＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＢＳＡＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎＣＰＥＣｙｔｏｐａｔｈｉｃＥｆｅ。ｄｄＨＯＤｅｉｏｎｉｚｅｄＤｉｓｔｉｌｌｅｄＷａｔｅｒ２ＤＭＳＯＤｉｍｅｔｈｙｌＳｕｌｆｏｘｉｄｅＥＤＴＡＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅＴｅｔｒａｃｅｔｉｃＡｃｉｄＥＧＦＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＦＩＴＣＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅＨＡＨｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＩＧＩｍｍｕｎｏｌｏｂｉｎＧｇｇＭＥＭＭｉｎｉｍｖｉｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＭＴＴＴｈｉａｚｏｌｙｌＢｌｕｅＴｅｔｒａｚｏｌｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅＭＯＩＭｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎＮＡＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＯＤＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙＰＢＳＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅＲＤＥＲｅｃｅｐｔｏｒＤｅｓｔｒｏｙｉｎｇＥｎｚｅｙｍ民ＨｃｖｏｈｉｔｉｏｎｓＰｅｒＭｉｎｕｔｅｐｍＳＦＭＳｅｒｕｍＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍＳＰＦＳｐｅｃｉｆｉｃＰａｔｈｏｇｅｎＦｒｅｅＴＦＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎＴＩＴｒｙｐｓｉｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒＶａＶｅｒｏＣｅｌｌＡｄａｐｔａｔｉｏｎＡｍＡｍｉｃｉｌｉｎｐｐＥ．ｃｏｌｉＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＶｅｒｏＡｆｒｉｃａｎＧｒｅｅｎＭｏｎｋｅｙＫｉｄｎｅｙＴＰＣＫＴｏｓｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＣｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌＫｅｔｏｎｅＴＣＩＤｓｏ５０％ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｏｓｅＲＮＡＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄＰＣＲＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ５０ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文ＬＢＬｕｒｉ过ＢｅｒｔａｎｉＨＩＨｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃＤＮＡＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄＤＮＡＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ５１ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文附录口基本实蒙操作１．细胞培养及冻存１．１培养条件完全培养基：ＭＥＭ，１０％新生牛血清，１％联合抗生素，２％谷氨邸胺，２％ＮａＨＣ〇３。冻存液：新生牛血清或完全培养基，１０％ＤＭＳＯ。１．２细胞复苏’（１）把需用的溶液置于室温或３７Ｃ水浴中预热。‘（２）配制完全培养基，放入３７Ｃ预热。‘（３）调制３７Ｃ蒸懼水。°（４）从液氮管中取出冻存的细胞，将冻存管放在巧Ｃ水浴溶化，期间不停地湿和摇动，直到冻存管内看不到结冰。（５）冻存管在水浴中继续解育约３０秒，期间温和的摇动（６）再放入超净台之前，用７５％的酒精棉擦拭消毒。（７）在超净台内的酒精灯火焰旁打开冻存管，把细胞液转移到无菌的１５ｍｌ离也管中。°（８）加入１．５ｍｌ３７Ｃ预热的细胞培养液，静置５ｍｉｎ。（９）加入３ｍｌ预热的细胞培养液，再静置５ｉｎｉｎ。（１０）加入６ｍｌ预热的细胞培养液，静置５ｍｉｎ。（１１）１５〇ｘｇ离也细胞悬液ｌＯｍｉｎ。２（１２）１０ｍｌｃｍ弃上清，缓慢加入预热的培养基重悬细胞，之后转移到２５培养瓶中。（１３）在细胞培养瓶上标记细胞名称，代次，日期等信息。一一（１４）段时间观察下－显微镜下观察细胞，估计存活率，每隔，并记录变化。１２ｈｌ化后换液１．３Ｖｅｒｏ细胞的传代‘（１）室温或３７Ｃ预热细胞传代所需溶液。（２）取出已成致密单层的Ｖｅｒｏ细胞，倒掉细胞培养瓶内的培养液３Ｓ（带酪红指－（）用ＰＢ示剂，据ＰＢＳ洗液颜色变化情况洗２３）洗细胞次。－（４）加入少量的ａ２ｍｌ）的０－．１２５％的ＥＤＴＡ膜蛋白酶到细胞面对壁，翻转细胞培ＥＤＴＡ－养瓶，使膜蛋白酶液能够均匀地分布在细胞面，在显微镜下观察，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相连，表明消化时间己到。（５）细胞消化完毕，迅速加入适量培养液终止消化，并使用吸管适当吹打细胞，５２ 中国医学科净底化京巧和医学院硕±论文＇成均匀的细胞悬液。（６），按照传代需求，加入适当量的完全培养基，混匀细胞悬液分装到新的培养°瓶中３７Ｃ静止培养。１．４Ｖｅｒｏ细胞的冻存‘（１）室溫或巧Ｃ预热细胞传代所需溶液。（２）取出己成致密单层的Ｖｅｒｏ细胞，倒掉细胞培养瓶内的培养液红指示剂ＰＢＳ洗２－（３）用ＰＢＳ（带龄）洗细胞，据液颜色变化情况洗３次。－－２ｍｌＴＡ（４）加入少量的（ｌ）的化１２５％的ＥＤ膜蛋白酶到细胞面对壁，翻转细胞培－养瓶，使ＥＤＴＡ膀蛋白酶液能够均匀地分布在细胞面，在显微镜下观察，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相连，表明消化时间已到。（５）细胞消化完毕，迅速加入适量培养液终止消化，并使用吸管适当吹打细胞，成巧匀的细胞悬液。‘‘Ｃ－Ｃ－（６）加入细胞冻存液，混合均匀后分装到冻存管，４，０．化转放２０，化后８０，‘’入程序降湿盒－ＣＣ巧夜，８０，放液氮中长期保存；或者是放降温１化后转入液氮保存。１．５ＭＤＣＫ细胞的传代‘Ｃ预热细胞传（１）室温或３７代所需溶液。（２）取出已成致密单层的Ｖｅｒｏ细胞，倒掉细胞培养瓶内的培养液３ＰＢＳ红指示剂）洗细胞ＰＢＳ洗液颜色变化情况洗２－３（）用（带龄，据次。４化２５％的ＥＤＴＡ－（）加入少量的的膀蛋白酶到细胞面对壁，翻转细胞培°￣－ｍｎ养瓶，使ＥＤＴＡ膜蛋白酶液能够均匀地分布在细跑面，置３７Ｃ温箱５１０ｉ在显。微镜下观察，表，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相连明消化时间曰到（５）细胞消化完毕，迅速加入适量培养液终止消化，并使用吸管适当吹打细胞，使细胞分散均匀，成均匀的细胞悬液。（６）按照传代需求，加入适当量的完全培养基，混匀细胞悬液，分装到新的培养‘瓶中３７Ｃ静置培养。２．细胞计数（１）４％台盼蓝母：台盼藍加少量蒸馈水研磨５ｍｌ液称取化２，加蒸溜水至，滤纸ｇ，‘过滤，４Ｃ保存。使用时用ＰＢＳ稀释至０．４％。（２）取少许配好的４％台盼蓝母液，用ＰＢＳ稀释至化４％。（３）０．１２５％的膜酶瓣化铺满单层的Ｖｅｒｏ细胞，制备成单细胞悬液。（４）染色：细胞悬液与０．４％的台盼蓝溶液按１：１混匀。５３ 中国医学科学院化京协和医学院硕±论文（５）将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。（６）将细胞悬液滴入计数板：待测细胞悬液吹均匀后，使用微量移液器吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。（７）计算原细胞悬液的细胞数：按照下面公式计算细胞密度：４＝＋ｘ（细胞悬液的细胞数）／ｍＬ（４个１６方小格子细胞数之和４ｌ〇）３．１％新鲜鸡红细胞悬液的配制（１）红细胞采集：取至少２只ＳＰＦ鸡如果没有ＳＰＦ鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗（￣体的鸡），采血约２４ｍｌ，加入到１：１的比例加入阿氏液中。混匀放入到１０ｍｌ离也管中。（２）洗洛鸡红细胞：？将离也管中的血液经１５００１８００ｒ／ｍｉｎ离也８ｍｉｎ，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，捏轻混合，再经１５０（Ｍ８００ｒ／ｍｉｎ离也８ｍｉｎ，用吸管吸取上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复２次Ｗ上过程后，加入阿氏液２０ｍｌ，捏轻混合成红细胞悬液，‘４Ｃ保持备用，不超过５天。（３）１０％鸡红细胞悬液：￣ｍ取阿氏液保持不超过５天的红细胞，在锥形刻度离也管中离也１５００１８００ｒ／ｉｎ８ｍｉｎ，ｍｌｍｌ弃去上清液，准确观察刻度离也管中红细胞体积（）加入９倍体积）的生理盐水，，（用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。（４）１％鸡红细胞液：取混合均匀的１０％鸡红细胞悬液１ｍｌ，加入９ｍｌ生理盐水，混合均匀即可。４．红细胞凝集血凝）试验（－（１）在％孔血凝板从Ａ１Ｈ１２孔加入５０叫生理盐水或巧Ｓ（ｐＨ７巧。（２）Ａ１－Ｈ在从１孔中各加５０叫的流感病毒样品，充分混匀。－－－（３）从Ａ１书１孔各吸出５０叫加到Ａ２Ｈ２中，混匀（吹打８１６下），至Ａ１１Ｈ１１，－讯２作为阴性对照孔混匀后５０。。，弃掉叫第Ｍ２（４）在Ａ１书１２加５０叫％的鸡红细胞悬液，在振荡器混匀后，室温静置３０ｍｉｎ，观察结果。（５）结果判定。将板倾斜，对光观察血凝板，判读结果（见下表）５４ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文血凝实验结果判读标准类别孔底所见结果１红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即１００％红细胞凝集＋＋＋＋２红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈＋＋＋３红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块＋＋４红细胞与孔底形成小圆点，四周有少许凝块＋５红细胞于孔底呈小圆点—，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集能使红细胞完全凝集（１００％凝集，，＋＋＋＋）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价此效价为一１个血凝单位（ＨＡＵ）。注意对照孔应呈现完全不凝集（），否则此次检验无效。５．红细胞凝集抑制（血抑）试验（微量法）（１）根据血凝实验的结果配制４ＨＡＵ的病毒抗原（Ａｇ）。完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除Ｗ４即为含４ＨＡＵ的抗原的稀释倍数。？２在微量反应板的１１１孔加入２５ＰＢＳ，第口孔加入５０ＰＢＳ。（）叫叫（３）吸取２５叫血清加入第１孔内，充分混匀后吸出２５叫于第２孔，依次倍比稀释至第１０孔，从第１０孔吸取２５叫弃去。°￣２５温（４）１孔１１孔均加入含４ＨＡＵ混匀的病毒抗原液叫，室（约２０Ｃ）静置至少￣３０ｍｉｎ６０ｍｉｉｉ。（５）每孔加入５０山体积分数１％的鸡红细跑悬液混匀，轻轻混匀，静置约４０ｍｉｎ（室°°温约２０Ｃ，若环境温度太高可置于４Ｃ条件下进行），对照红细胞将呈现纽扣状孔沉于孔底。结果判定（巧完全抑制４个ＨＡＵ抗原的血清最寓稀释倍数作为Ｈ。Ｉ滴度只有阴性对照孔血清滴度不大于２１ｏｇ２，阳性对照孔血清误差不超过１个滴度，试验结果才有效。ＨＩ价小于或等于２１ｏ２判定ＨＩ试验阴性；曲价等于３１ｏ２为可疑，ｇｇ需要重复试验；ＨＩ价大于或等于４１ｏ２为阳性。ｇ６．半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤｓｏ）测定流感病毒感染性滴度（１）实验用细胞ｍ侍ＭＤＣＫ细胞长至无细胞间隙且细胞状态好时，加膜酶消化，加细胞培养液２０ｌ／°瓶，１０３７Ｃ％，混匀细胞将细胞悬液加至％孔板，每孔加０叫细胞悬液，置、５Ｃ〇２解育箱培养待细胞长为单层无间隙即可进行滴定实验。，５５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文（２）病毒的稀释毒种稀释液的雨制：２％ＮａＨＣ〇３、２％谷氨酷胺、１％双抗、１％ＴＰＣＫ膜酶、１％牛血清白蛋白、补加ＤＭＥＭ／Ｆ１２至ｌＯＯｍＬ－１－１０５－取１０个高压灭菌的ｍｌ邸管置于巧管架上，分别标注１０１０。每管加入２．７ｍｌ的ｉ一病毒稀释液，然后向第（ＩＣｒ）加入０．３ｍｌ病毒液。游祸震荡混匀．管稀释度，吸０３一ｍｌ至下个稀释度的ＥＰ管。，依次倍比稀释（３）病毒的滴定用洗液（含２％ＮａＨＣ〇３的ＭＥＭ）反复洗９６孔板３遍，洗净残余小牛血清，按不同稀释度接种病毒，每孔１〇〇山，每个稀释度设８个复孔，设８孔毒种稀释液°阴性对照和８？Ｌ洗液阴性对照。置３５Ｃ，５％Ｃ０育箱培养３天后观察结果并测２解每孔血凝效价。（４）滴定结果读取观察ＣＰＥ结果培养７２１娜察每孔ＣＰＥ情况，细胞圆缩、分界不明显，或有拉网表明病变。病－变阳性Ｗ＋化未病变阴性Ｗ。）（祀按Ｋａｒｂｅｒ公式计算＝Ｌｏ阻５０ＬｄＳ－０ｇＴＣ．５（）Ｌ＝本次试验中起始稀释度的对数（即最高浓度）二ｄ两连接稀释对数之差Ｓ＝阳性部分的总和（出现ＣＰＥ者）此外，读取结果也可是将细胞培养板中的培养液混匀后取出５０ｕｌ，放入９６化Ｕ型板中，对应标记化之后加入５０山新鲜１％鸡红细胞，室温反应３０ｍ虹后，读取结果，，读取方法同血凝实验但只是记录阳性或是阴性么后在按照上述公式计算ＴＣＩＤ５０。值７．鸡胚培养流感病毒７．１鸡胚接种实验前对所用毒株进行血凝效价的测定，（１）通过血凝试验检查毒种效价，若效价达上，则可直接进行毒种稀释而用于接种，否则则需进行毒种的扩增（扩增方法与下文接种方法相同，若是所用病毒来源于细胞，则可不进行稀释直接扩增，若是病毒来自于鸡胚培养，且效价较高，则可适当稀释后进行扩增）。．（２）毒种稀释，稀释前需对所需病毒量按每个鸡胚０．２ｍｌ用量进行计算，效价达要求的毒种可进行倍稀释（例；１＋８２＋１８２＋１８５＋４５）一（３）将高压过的小剪刀提前放于超净台里，连同超净工作台起用紫外照射约５６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文２０ｍｉｎ，之后打开无菌风，关闭紫外Ｗ备用。４ｄ龄鸡胚从恒温腊化器一（）将已达ｌｉ中拿出，在暗室用照蛋器在鸡胚有气室头气室上方１ｍｍ处划线标记，标记时要尽量避开鸡胚主要的大血管及鸡头，若实在一有困难则应选择纵向血管处而避开横向血管处。划线完成后，将划线处调致同方向Ｗ备用。（５）将已划线的鸡胚放置于平整的洁净牛皮纸上，用医用棉签沾取适量规酒在已画线条部位及其周围适当区域进行消毒。消毒完成后将鸡胚放入超净工作台Ｗ备用。（６）将島压过的小剪刀在超净台中打开，并在酒精灯外焰上加热在此消毒，放凉，备用。（７）打孔：用小剪刀在鸡胚标记线上或其上方钻孔，直径约在２ｉｍｎ左右即刚好可让接种室使用的无菌注射用针头通过。若所打孔径过大，则应把该鸡胚丢弃，免后续接种后由于孔大而造成污染。医用注射器倾斜°（８）接种：用４５角插入鸡胚巧囊腔接种病毒，每枚鸡脏按０．２ｍｌ的病毒量进行接种，然后用医用胶带封口。巧°（９）．６Ｃ６０％。将接种好的鸡胚放入解化箱培养，此时的培养条件为，湿度一（１０）鸡胚将被培养７２ｈ，此间最好每日照检鸡化次，于接种后２他内死亡者为非将异性死亡应丢弃。７．２尿囊液的收获及初步处理‘ｈ－（１），随机抽取Ｃ冻比病毒培养７２几枚鸡胚，于２０，吸取尿囊液（方法如下所，提前检测其病毒效价化），对整体鸡胚原囊液内病毒效价有所预测和了解。（２）用照蛋器于暗室照检鸡胚，挑出弱胚和死胚弃之，剩余鸡胚转移到小蛋盘６ｘ６（‘Ｃ冰箱化或过夜规格需经如上文所述方法消毒）中，置４。（３）预先用电子天平称出所要用转瓶的质量，并记录。（４）用７５％酒精消毒全部卵壳，在洁净牛皮纸上用已灭菌的大镜子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之。（５）将敲好的鸡胚转移入超净工作台，用已灭菌的小镇子揭开绒毛尿囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液放于无菌转瓶内。（６）称重，算出尿囊液的质量，将质量转为体积，然后加入１巧０体积的ＥＤＴＡ、’Ｃ保存备用ＰＢ及梓樣酸兰钻，混匀，用于离也或４。（７）将尿囊液混合液倒入无菌５００ｍｌ离也桶，配平后８０００ｒ／ｍｉｎ离也２０ｍｉｉｒ，弃沉一淀，上清转移入另个无菌新５００ｍｌ离也桶，同样条件离必，取上清于新无菌转瓶‘Ｃ备用４。（８）将８０００ｒ／ｍｉｎ离也后的上清液分装入５０ｍｌ离也管，配平，２００００ｒ／ｍｉｎ离也２ｈ，一若尿囊液较多时每只离也管使用两次后则需进行次沉淀冲洗，即用５％廉糖（或５７ 中国医学科学院北京协和医学院硕壬论文弃上清后管内剩余尿囊液￣）反复冲洗离也后沉淀并混匀（每只离必管可洗２３次），’标记后－２０Ｃ保存备用。８．流感病毒抗原的纯化（１）收获的细胞或鸡胚来源的病毒液，ＳＯＯＯｒｐｍ离也２０ｍｉｎ收集上清，再次ＳＯＯＯｒｐｍ离屯、２０ｉｎｉｎ收集上清。（２）离也后上清装入超速离也机专用离也管内在天平上两两平衡２００００ｒｍ，，ｐ离也２ｈ。°（３）弃上清，加ＰＢＳ于沉淀中４Ｃ过夜再用毛细吸管轻轻吹打悬液均匀。，，，使（４）先将３ｍＬ无菌６０％藤糖加入离也管中巧缓慢加入７ｍＬ无菌３０％薦糖，最后将病毒悬液置于顶层２００００ｒ离也比。，ｐｍ、（５）缓慢取拿离屯管病毒带即６０％和３０％薦糖溶液间的白色区带吸去上层液体，，后缓慢吸取病毒带到干净离也管中。，（６）收集的病毒液中加入５倍体积ＰＢＳ，混匀，２００００ｒｐｍ离也比。。（７）ＰＢＳ－－弃上清ｌ２ｍＬ８０（：保存待用。，加溶解沉淀分乾９．血清处理°（１）将采集的血标本在室温２２－２５Ｃ－２ｈ（）放置ｌ，待其自发凝集。一（２）３０００ｒｉｎ离也ＳＯＯＯｒｍｌＯｍｉｎｐｌＯｍｉｎ，吸取血清至另管中，再次ｐ离也小也吸，取上清。一（３）要进行血抑试验或中和试验的血清需进步用受体破坏酶处理去除血清中的‘。非特异抑制素巧－。１体积血清加入４体积ＲＤＥＣ１６１８ｈ后置％Ｃ水浴中３０ｍｉｎ，，’Ｃ保勿冻存灭活置４存待用。，，１０．使用Ｖｅｒｏ细胞培养流感病毒（１）选取２化长满单层的Ｖｅｒｏ细胞，弃去培养液；（２）填量ＰＢＳ洗络细胞面３次，Ｗ去除残余的血清及膜蛋白酶抑制剂；（３）用吸附液稀释流感病毒，Ｗ０．０５ＭＯＩ的病毒量接种细胞，巧±ｒｃ条件下吸附化，每隔２０ｎ血捏晃培养瓶Ｗ保证更多的病毒吸附到细胞上；（４）化后，弃去培养瓶内的吸附液，补加适量的病毒维持液，捏晃培养瓶使病毒均匀分布于细胞面上。（５）每次接种病毒均需设置细胞对照实验，细胞对照组只加入病毒维持液；（６）继续置巧±ｒｃ培养箱中培养；（７）每隔２他补加初始浓度的ＴＰＣＫ－膜蛋白酶和ＮａＨＣ０３－（８）每日光学显微镜下观察细胞病变情况，出现典型的病变达８０９０％时，即可进５８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文行收获。１１．ＭＯＩ的计算感染复数ＭＯＩ指感染时病毒与细施数的比例，即：ＩＯＰ５〇ｘＦ服＝Ｘｘａ其中：Ｖ表不接种病毒的体积；Ｘ表示病毒感染时的细胞密度；ａ表示ＭＯＩ的系数５９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文附录阻主要溶液及培养基的配制￣１．ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２７．４）ＮａＣｌ８ｇＫＣｌ０．２ｇＮａ２ＨＰ（Ｖ１２Ｈ２〇２．７７ｇＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ酶红０．２２解于ＩＭＮａＯＨ０ｇＣ溶．１２５ｍｌ）加去离子水ＩＬ，髙压灭菌。２．双抗Ｐ．Ｓ．（）青霉素４０万单位５０瓶链霉素１００万单位２０瓶‘加冷蒸墙水－Ｃ保存备。１Ｌ，过滤除菌，２０用３．谷氨醜胺Ｇ虹３％（，）谷氨酌胺３０ｇ‘－Ｃ备用加ＰＢＳ溶液至１Ｌ，充分溶解后，过滤除菌，２０。４．ＮａＨＣ〇３溶液（６．６％）ＮａＨＣ〇３６６ｇ加双蒸水至°ＩＬ，过滤除菌，４Ｃ保存备用。５．膜蛋白酶４％）ＰＢＳ溶液１Ｌ膜蛋白酶粉ｌＯｇ‘ｍ滤－揽拌使其充分溶解，普通滤纸过滤后，用化２２ｐ纸过滤除菌，２０Ｃ保存备用。６．ＥＤＴＡ４％溶液（）ＥＤＴＡ４０ｇ加ＰＢＳ溶液至１Ｌ，充分溶解后，高压灭菌。７．ＮａＯＨ溶液。Ｍ）６０ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文ＮａＯＨ４０ｇ加双蒸水至ＩＬ，充分溶解后，高压灭菌。８．ＢＳＡ洛液。０％）ＢＳＡｌＯｇ‘－Ｃ保存备加双蒸水至１００ｍｌ，充分溶解后，过滤除菌，２０用。９－．ＴＰＣＫ膜酶溶液１０％（）ＴＰＣＫ－族酶ｌＯｍｇ‘ａ－Ｃ保存备加ＭＥＭ至％ｍｌ，添加２ｍｌＮＨＣＸ）３，充分溶解，过滤除菌，２０用。１０．ＤＭＥＭ／Ｆ１２基础培养基ＤＭＥＭ／Ｆ１２１０．４ｇ‘加双蒸水至１Ｌ，４Ｃ保。，充分溶解后，过滤除菌存各用１１．细胞培养液（１０％Ｓ）－８６ｍ基础培养基８５ｌＰ．Ｓ．１ｍｌＧｉｎ２ｍｌ小牛血清１０ｍｌＮａＨＣ〇＾２ｍ￣３ｌ（调节ｐＨ７．２７．４）１２．细胞培养液（２％Ｓ）－９４ｍ基础培养基９３ｌＰ．Ｓ．１ｍｌＧｉｎ２ｍｌ小牛血清２ｍｌ￣ａｌ－２ｍＮＨＣＯｓｌ（调节Ｈ７．２７．４）ｐ１３．细胞培养液（ＳＦＭ）８９－９０ｍ基础培养基ｌＰ．Ｓ．１ｍｌＧｉｎ２ｍｌＢＳＡ１ｍｌａ－￣ＮＨＣ〇３ｌ２ｍｌ调节Ｈ７．２７．４（ｐ）转铁蛋白１ｍｌ６１ｉ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文ＥＧＦ２ｍｌ膜岛素１ｍｌ膜酶抑制剂１ｍｌ０－１４．ＥＤＴＡ膜蛋白酶（Ｏ．Ｉ２５／０）ＰＢＳ８６８ｍｌ１％膀蛋白酶１２５ｍｌ０４／０ＥＤＴＡ５ｍｌＩＭＮａＯＨ２ｍｌ（调节ｐＨ７．６）－１５．ＥＤＴＡ膜蛋白酶（０．０５％）ＰＢＳ９４３ｍｌ１％膜蛋白酶５０ｍｌ４％ＥＤＴＡ５ｍｌＩＭＮａＯＨ２ｍｌ调节Ｈ７．句（ｐ１６．ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）ＭＴＴ０．５ｇ‘Ｓ至－１００ｍｌ２０Ｃ避光。加ＰＢ，充分溶解后，过滤除菌，保存备用１７．病毒吸附液ＤＭＥＭ／Ｆ１２９．７ｍｌ６．６％ＮａＨＣ〇３０．２ｍｌＯ０－．１％ＴＰＣＫ膜酶０．１ｍｌ１８．病毒培养液ＭＥＭ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２１：１％ｍｌ（）Ｐ．Ｓ．１ｍｌ０３／ｏＧｌｎ２ｍｌ－１０％ＴＰＣＫ膜酶１ｍｌ１０％ＢＳＡ１ｍｌ６￣．６％ＮａＨＣ〇３２ｍｌ（调节Ｈ７．２７．４）ｐ１９．ＮａＣｌ溶液（０．８７％）ＮａＣｌ８７ｇ６２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文加去离子水至１０００ｍｌ，充分溶解后，室温保存备用。’２０．Ａｌｓｅｖｅｒｓ溶液葡萄糖２０．５ｇ二水梓樣酸钢（ＮａｓＣｓＨｓＯ？。＆〇）８ｇＮａＣｌ４．２ｇ梓樣酸但６印〇７）〇．５５ｇ溶解在ＩＬ蒸溜水中。‘Ｈ＝６．１±０．１。用０．２２ｎ的滤膜过滤４Ｃ保混匀后用ＩＭＮａＯＨ或１ＭＨＣ１调ｐ叫除菌，存。２１．２％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的配制ＢＳＡ２．０ｇ°加入１００ｍｌ的双蒸水，充分溶解，过滤除菌，４Ｃ保存备用。２２ＸＴＡＥＢｕｆｆｅｒ（８ｌＯＯＯｍＬ．５０ｐＨ．５，）称取下列试剂：，置于化烧杯中Ｔｒｉｓ２４２ｇ－２Ｈ〇巧Ｎａ２ＥＤＴＡ２．２ｇ醋酸巧．１ｍｌ向烧杯中加入８００ｍＬ去离子水，充分揽拌溶解，加去离子水将溶液定容至ｌＯＯＯｍＬ，室温保存。２３．ｌＯｍｇ／ｍＬ漠古锭（ｌＯＯｍＬ）称量Ｉ漠古佑加入到１００ｍＬ容器中，ｇ，加入去离子水１００ｍＬ充分揽拌数小时完全溶解漠乙锭，将溶液转移至栋色瓶中，室温避光保存。配置过程应在实验室指定区域完成，配置过程中使用的器具因按照相关规定进行处理。２４．Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（简写ＡＭＰ，１ＯＯｍｇ／ｍＬ）称量５ｇＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ置于５０ｍＬ离也管中，加入４０ｍＬ灭菌水，充分溶解后定容°ｍＬ－．。止５０，用０２２脚滤器过滤除菌，小管分装后，２０Ｃ保存２５．ＬＢ成份：营养肉汤（ｇ／Ｌ）：蛋白陈１０．０酵母粉３．０氯化钢５．０葡萄糖１．０６３ 中国医学科学院北京协和医学院硕±化文营养琼脂（ｇ／Ｌ）：１００３．０５．０５０蛋白膝．牛肉粉氯化钢琼脂１．：１９ＯＯｍＬ去离子水①ＬＢ液体培养基按照说明书，称取．ｇ营养肉汤，加入ｌ，‘Ｃ‘ｉＣ加热煮沸完全溶解后于１２１，１５ｍｎ高压灭菌，高皮灭菌后放置４保存。③ＬＢ（ＡＭＰ）液体培养液；在ＬＢ液体培养基中加入ＡＭＰ，使之终浓度为‘１００帖ＺｍＬ即可，４Ｃ保存。：按照使用说明书３．３③ＬＢ固体培养基，称取ｇ营养琼脂，加入ｌＯＯｍＬ去离子’‘水，加热煮沸完全溶解后于ｍＣ，１５ｍｉｎ高皮灭菌，室湿放置待其冷却至４５Ｃ左‘Ｃ。右时铺平板，４倒置保存‘④ＬＢ（ＡＭＰ）固体选择培养基：待ＬＢ固体培养基冷却至４５Ｃ左右加入ＡＭＰ‘ｌＯＯ／４Ｃ倒置。（ｕｇｍＬ），摇匀后铺平板，保存６４ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文附录ＩＶ－ＰＣＲ扩增Ａ型流感病毒８个病毒ＲＮＡ片段的引物用于ＲＴ；’’引物序列（５－３）限制性内切引物名称（下划线为限制性酶切位点）酶：ＰｒｆＡＣＡＡＡＡＣＡｇｇｇｇＰＢ２ＦＴＡＴＴＡＡＣＡＡＡＣＡ了ＣＥｃｏ３１ＩＢｓａＩｇ迎ＱｌＱｇｇｇｇｇｇ館（）ＰＢ２艮ＡＴＡＴｇｇＴＣＴＣｇＴＡＴＴＡｇＴＡｇＡＡＡＣＡＡｇ巧ＣｇＴＴＴＰＢＩＦＴＡＴＴＣｇｌＣＩＣＡｇｇｇＡｇＣｇＡＡＡｇＣＡｇｇＣＡＥｓｐ３ＩＢｓｍＢＩ（）ＦＢＩ民ＡＴＡＴＧｇｉｅｉＱｇＴＡＴＴＡｇＴＡｇＡＡＡＣＡＡｇｇＣＡＴＴＴＰＡＰＴＡＴＴＣｇＴＣＩＣＡｇｇｇＡｇＣｇＡＡＡｇＣＡｇｇＴＡＣＥｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩ）ＰＡ民ＡＴＡＴＣ巧ＣＴＣｇＴＡＴＴＡｅＴＡｇＡＡＡＣＡＡｇｇＴＡＣＴＴＨＡＦＴＡＴＴＣｇＩＣＩＣＡｇｇｇＡｇＣＡＡＡＡｇＣＡｇｇｇｇＥｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩ）ＨＡ反ＡＴＡＴ￡ＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴｇＩ￡Ｉ］ＱｇｇｇｇｇｇｇＮＰＦＴＡＴＴＣｇＩＣＴＣＡｇｇｇＡｇＣＡＡＡＡｇＣＡｇｇｇＴＡＥｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩ）ＮＰＲＡＴＡＴＣｇｌＣＴＣｇＴＡＴＴＡｇＴＡｇＡＡＡＣＡＡｇｇｇＴＡＴＴＴＴＴＮＡＦＴＡＴＴｇｇｌＣＴＣＡｇｇｇＡｇＣＡＡＡＡｇＣＡｇｇＡｇＴＥｃｏ３１ＩＢｓａＩ（）ＮＡ民ＡＴＡＴｇｇＩＱｌＱｇＴＡＴＴＡｇＴＡｇＡＡＡＣＡＡｇｇＡｇＴＴＴＴＴＴＭＦＴＡＴＴＣｇｌＣＴＣＡｇｇｇＡｇＣＡＡＡＡｇＣＡｇｇＴＡｇＥｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩ）ＭＲＡＴＡＴＣｇＴＣＩＣｇＴＡＴＴＡｇＴＡｇＡＡＡＣＡＡｇｇＴＡｇＴＴＴＴＴＮＳＦＴＡＴＴＣｇｌＣＴＣＡｇｇｇＡｇＣＡＡＡＡｇＣＡｇｇｇＴｇＥｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩ）ＮＳＲＡＴＡＴＣｇＴＣＴＣｇＴＡＴＴＡｇＴＡｇＡＡＡＣＡＡｇｇｇＴｇＴＴＴＴ６５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文致谢一晃而过Ｈ年硕±生生活，回首走过的岁月，我感受良多。在Ｈ年的求学生涯中，导师廖国阳研究员在学习和生活给予了我悉也指导和深切关怀，，本论文是在廖教授的指导下完成的。导师对科学的执着与热情无私忘我的敬业精神，，，严谨求实的治学精神，科学严密的思维方法诲人不倦的育人态度一不深深地感染着我，谨向导师表宽容待人的人格魅力，无。在硕±论文完成之际！示我最崇髙的敬意和衷也的感谢，感谢导师的辛勤培养和无微不至的关怀感谢李卫东老师、李映波老师给予我的帮助与关怀。一感谢生物制品五室这个温暖的集体。感谢实验室的每位老师和同学。特别感谢戴宗样老师对实验室各方面进行的协调工作，使得各项实验能够顺利开展；感谢宋绍辉师兄、张新文老师和刘猜师姐在实验技术方面的指导与帮助；感谢寸怡娜老师、高菁霞老师、马磊老师、钟翰斌老师、朱文勇老师、欧阳圣洁老师、代小虎老师和胡文著老师在课题完成过程中给予的帮助与支持、杨帆，师。感谢师兄耿兴良姐龙云凤在实验上的帮助和理论上的指导、王明清。感谢师。感谢同窗伙伴段盼盼、、弟李卓凡李在哈，师妹管娇琼李双丽等在实验中的协助和支持。本论文凝集着。大家辛勤的汗水，感谢你们在生活中给予的种种关也，我会铭记于也感谢石怀生老师为我拍摄了许多精美的实验照片；感谢戴素萍老师在实验过程中给予的无私帮助。感谢人事教育处的李艳梅老师和陈晨老师在学习生活中给予的所有关也和帮助。感谢。感谢陈瑜娜老师在平日生活中给大家带来的精彩活动及对我生活的关怀医学生物学研究所的培养。一直默默支持感谢、关必我的家人，他们是我克服困难、不断向前的不竭动力和坚强的后盾。６６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±论文个人简历９９０２０１２郭埼，女，回族，１年出生，年毕业于南京农业大学生命科学院生物科学专业，获得了理学学±学位。同年９月考入北京协和医学院医学生物学研究所，在廖国阳研究员的指导下攻读理学硕±学位。参与研究的谋题：季节性流感病毒检测试剂盒的制备ＳａｂｉｎＩＰＶ无针注射器基础免疫、增强免疫及中和抗体检测的研究无血清培养Ｖｅｒｏ细胞和Ｈ１Ｎ１流感病毒的研究一攻读硕±学位期间Ｗ第作者投稿的文章包括；《Ｈ３Ｎ２流感病毒冷适应株的无血清培养》医学研究杂志，待发表。６７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加Ｗ标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名；签字日期：可年＾月知日骑学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解北京协巧医挙院有关保存、使用学位论文的管理办法。有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授极北京协和医学院可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）：导师签名学位论文作者签名：■＂ｍｈ主签字日期：的５年６月ｆｏ日签字日期：年＜月／〇日学位论文作者毕业后去向：寸卞瓣缺部施轉飾教３抑读殘得去爹佐｝（王作单位；电话：通讯地址：邮编：
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