肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体的分离和鉴定

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1、肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体的分离和鉴定IsolationandCharacterizationofNewlyLyticBacteriophagesActiveagainstKlebsiellapneumoniaeClinicalIsolates作者姓名：逯茵茵茵茵专业名称：微生物学指导教师：孙延波教授延波教授学位类别：理学硕士答辩日期：2015年5月22日中文摘要肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体的分离和鉴定肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）属肠杆菌科细菌、革兰染色阴性杆菌，是引起医院内感染的病原菌之一。肺炎克雷伯菌引起的侵袭性感染可导致

2、器官（如肾脏、脾脏、大脑和前列腺）和组织的脓肿，特别是近年来，由肺炎克雷伯菌引起的社区获得性(community-acquired)的化脓性肝脓肿有增加的趋势。此外，携带编码超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumbeta-lactamases,ESBLs）质粒的多重耐药肺炎克雷伯菌所致医院内感染的报告也逐年上升。多重耐药细菌的不断出现一方面导致抗生素疗效的下降，另一方面亦大大增加了耐药性细菌在病人体内定植的可能性。噬菌体是一种可以特异性裂解细菌的病毒，广泛存在于自然界。利用噬菌体治疗细菌性感染，称为噬菌体疗法。本论文目的是分离裂解性

3、肺炎克雷伯菌噬菌体并分析生物学特性，为噬菌体用于耐药性肺炎克雷伯菌的感染提供初步的前期工作。本项研究以25株肺炎克雷伯菌临床分离株为宿主菌，从医院污水中分离出4株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体(分别命名为φKp-lyy15、φKp-lyy17、φKp-lyy19和φKp-lyy22)。透射电镜观察显示，4株噬菌体的形态学特征符合有尾病毒目(theCaudovirales)，其中噬菌体φKp-lyy15和φKp-lyy19为长尾病毒科(Siphoviridaefamily)噬菌体；噬菌体φKp-lyy17属于足尾病毒科(Podoviridaefamily)

4、噬菌体；而噬菌体φKp-lyy22则属于滴状病毒科(Guttaviridaefamily)噬菌体。通过生物学特性的分析发现，(1)噬菌体φKp-lyy22的潜伏期为15min、爆发期的时间近80min，爆发量为60PFU/cell。此外，φKp-lyy22仅能裂解3株肺炎克雷伯菌分离株（裂解率为12%），说明裂解谱较窄；(2)噬菌体φKp-lyy15的潜伏期为10min、爆发期的时间为30min，爆发量为65PFU/cell；(3)φKp-lyy15的基因组为dsDNA、含有EcoRV、NdeI和BglII的酶切位点；(4)φKp-lyy15的SD

5、S-PAGE分析，可见3个主要蛋白条带和8个次要蛋白条带，其相对分子量在15～170kDa之间；(5)噬菌体φKp-lyy15可裂解8株肺炎克雷伯菌分离株（裂解率为32%），I说明具有较宽的裂解谱；(6)稳定性试验显示，噬菌体φKp-lyy15在pH4～10的范围内以及在50℃～60℃的条件下仍可有效裂解宿主菌。综上所述，1.本项工作分离的4株肺炎克雷伯菌噬菌体为裂解性噬菌体，噬菌体φKp-lyy15和φKp-lyy19属有尾病毒目、长尾病毒科噬菌体；噬菌体φKp-lyy17和φKp-lyy22则分别属于足尾病毒科和滴状病毒科噬菌体。2.通过生物学

6、特性的分析发现，噬菌体φKp-lyy15是一潜伏期短、裂解性强、裂解谱宽以及对pH和温度具有耐受性的裂解性噬菌体，为进一步研究利用噬菌体治疗耐药性肺炎克雷伯菌感染提供了可能。关键词:噬菌体,噬菌体治疗,肺炎克雷伯菌,多重耐药性IIAbstractIsolationandCharacterizationofNewlyLyticBacteriophagesActiveagainstKlebsiellapneumoniaeClinicalIsolatesKlebsiellapneumoniae,agram-negativeentericbacterium

7、,isoneofcommonpathogensthatcausenosocomialinfection.K.pneumoniaehasbeendocumentedtocauseinvasiveinfectionsleadingtoabscessesatothersites(eg,kidney,spleen,brain,andprostate).Moreover,community-acquiredpyogenicliverabscesscausedbyK.pneumoniahasincreasinglyemergedrecently,andmult

8、i-drugresistantK.pneumoniaeisolatescarryingextended-spectrumb