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1、儿科住院患者肺炎克雷伯菌分离株中β-->近年来感染率有逐步增加的趋势｡肺炎克雷伯菌是儿科患者中最常见的革兰阴性致病菌之一,其所致的院内感染可引起肺炎､伤口感染､尿路感染及菌血症等疾病,产β-内酰胺酶是肺炎克雷伯菌耐β-内酰胺类抗生素最常见的机制｡β-内酰胺酶相关基因赋予细菌编码对应酶的能力,而质粒介导的耐药性基因易于在细菌间传播,在临床上占有重要的地位｡β-内酰胺酶的种类多样,按其水解底物分类可分为青霉素酶､头孢菌素酶和碳青霉烯酶等,其对不同抗生素的水解能力有很大差异,对产酶株进行基因分型可
2、为临床选用相应抗生素提供参考依据｡本研究收集2012-2015年本院儿科住院患者150株肺炎克雷伯菌分离株,检测其携带的β-内酰胺酶基因类型,为进一步研究和控制细菌耐药性提供依据｡1材料与方法1.1菌株在本院分离的肺炎克雷伯菌中,产ESBL的菌株比例达到58.7%,这与广东省其他地区已报道的结果相比较一致｡选择2012年5月-2015年5月本院行微生物培养检查的儿科患者标本,标本类型包括痰液､尿液､血液､胸腹水和伤口分泌物等,收集患者培养肺炎克雷伯菌分离株共150株,剔除1年内同一患者相同感
3、染部位的重复分离株｡1.2菌株培养､鉴定及药敏试验各种培养标本按《全国临床检验操作规程》接种和培养,并采用VITEK2全自动微生物生化鉴定仪(生物梅里埃)对细菌进行鉴定,同时采用VITEKpact微生物药敏仪和纸片扩散法检测细菌对多种抗生素的耐药性,药敏结果判断参照美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)药敏试验执行标准｡1.3细菌DNA模板的提取从低温冰箱取出保存的菌种,置室温融化后接种于M-H普通琼脂平板,于35℃培养箱内培养18~24h｡挑取单个菌落于300μl无菌双蒸水,于100℃水浴10min后,离心取上清作
4、为模板DNA,于-20℃放置备用｡1.4β-内酰胺酶基因的PCR检测β-内酰胺酶基因检测采用PCR的方法,共检测TEM､SHV､CTX-M､DHA､PER､IMP､VIM和KPC等8种基因型,按文献报道序列进行引物合成｡PCR反应体系总体积为20μl,包括各种引物各1μl,DNA模板1μl,PCR酶混合物(Takara)10μl,并用双蒸水补至20μl｡反应条件为预热变性94℃5min,94℃变性30s,按对应退火温度退火30s,72℃延伸1min循
5、环35周期,最后一个72℃延长至7min｡所有PCR反应以大肠埃希菌ATCC25922DNA为阴性对照,PCR产物在2%琼脂糖凝胶,0.5TBE缓冲液中电泳40min,溴化乙锭溶液染色后进行凝胶成像｡1.5PCR产物测序与分析PCR产物用纯化试剂盒(天根)进行纯化,并送上海生工公司进行DNA序列测定,数据用BLAST网上工具进行分析比对｡2结果2.1菌株分布150株肺炎克雷伯菌中,2012-2015年的分离比例分别为18.7%(28/150)､30.0%(45/150)､35.3%(53/150)A
6、380;16.0%(24/150)｡150株菌株分别分离自痰液､尿液､血液､胸水､腹水和伤口分泌物等标本,在上述标本中的分离率分别为42.7%(64/150)､18.0%(27/150)､14.7%(22/150)､12.7%(19/150)､8.0%(12/150)､6.0%(9/150)｡2.2耐药性分析150株肺炎克雷伯菌中,产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)菌株88株,占比58.7%｡总体耐药性方面,本
7、研究中菌株对青霉素类和头孢菌素类药物耐药性较强(耐药率44%以上),对喹诺酮类药物的耐药率同样较高(46%~48%),对氨基糖苷类的敏感性则较高,对碳青霉烯类药物耐药率则很低｡2.3β-内酰胺酶基因的PCR检测在8种检测的β-内酰胺酶基因中,有4种(blaCTX-M､blaTEM､blaSHV和blaDHA)在研究菌株中被检出,PCR产物测序和序列分析结果与扩增结果相符｡其中阳性率最高的为blaCTX-M基因,占比47.3%(71/150);blaSHV的阳性
