猫杯状病毒fb-nj-13株的分离鉴定及生物学特性研究

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1、密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文猫杯状病毒FB-NJ_13株的分离鉴定及生物学特性研究IsolationandIdentificationofFelineCalicivirusFB-NJ-13andStudyonitsBiologicalCharacteristics硕士研究生：黄倩傭指导教师：曲连东研宄员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研宄生院2015年5月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猫杯状病毒FB-NJ-13株的分离鉴定及生物

2、学特性研究IsolationandIdentificationofFelineCalicivirusFB-NJ-13andStudyonitsBiologicalCharacteristics硕士研究生：黄倩倩指导教师：曲连东研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationIsolationandIdentificat

3、ionofFelineCalicivirusFB-NJ-13andStudyonitsBiologicalCharacteristicsMs.Candidate：HuangQian-qianSupervisor：Prof.QuLian-dongMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:AnimalVaccineandMolecularImmunologyMay2015III摘要猫杯状病毒(Felinecalicivirus，FCV)可引发猫科动物的上呼吸道疾病、口腔水疱性疾病

4、以及慢性胃肠炎等疾病，临床症状表现为口腔溃疡、鼻炎、结膜炎、慢性胃肠炎、急性关节炎等，还会导致肺脏、脾脏和胰脏等损伤，严重的可导致动物死亡。FCV仅有1个血清型，基因组由3个开放阅读框编码，基因表现多样性。FCV呈世界性分布，且已在一些国家和地区的珍稀猫科野生动物中分离到了FCV，我国猎豹和虎之间也有流行的报道，给宠物和野生动物的生存带来了威胁。因此，进行FCV的分离鉴定以及生物学特性的研究可为FCV的流行病学研究、疾病防控和基础生物学研究提供重要的科学依据。本实验将疑似感染FCV的猫鼻咽拭子接种于敏感细胞CRFK，盲传

5、至第3代时CRFK细胞可出现圆缩、脱落等特征性的病变。对分离株进行RT-PCR检测可以扩增到目的条带，命名为FB-NJ-13；EvaGreen实时荧光定量RT-PCR方法能够检测到分离株病毒拷贝数为2.03×106copies/uL；电镜下观察到病毒粒子呈圆球形，没有囊膜，大小在35~39nm之间，符合FCV的形态学特征；间接免疫荧光试验表明分离株可与FCV阳性血清反应，在荧光显微镜下能够看到绿色荧光；测定分离株的病毒滴度为108TCID50/mL；对分离株进行噬斑纯化，获得了纯化的病毒株。本实验根据GenBank中收录

6、的FCV全基因组序列，设计了3对引物，对分离株进行全基因组测序，结果表明FB-NJ-13全长7684bp，并将序列提交至GenBank，登录号为KM111557。本实验对FB-NJ-13分离株的理化特性、细胞致病性、全基因组序列和遗传演化分析以及小鼠致病性等生物学特性进行研究。温度、酸碱、有机溶剂及干燥和紫外照射等理化特性研究表明，FB-NJ-13株在50℃30min或70℃5min可被灭活；在pH3.0和pH10.0以上的环境中不稳定；对氯仿、乙醚等有机溶剂不敏感；经相同时间处理，紫外照射比干燥处理的杀伤作用强。细胞致

7、病性试验显示FB-NJ-13对CRFK细胞、Vero细胞、MDCK细胞具有致病性，对DFI细胞、PK15细胞、BHK-21细胞等无致病性。全基因核苷酸序列分析结果显示，FB-NJ-13与其他33株参考毒株的同源性为76.2%~79.5%，与GD株的同源性最高（79.5%）。分析分离株ORF1、ORF2及ORF3氨基酸序列及系统进化树知，ORF3氨基酸序列相对保守（82.2%~86.9%），ORF1、ORF2和ORF3均与GD株处于较近的分支上，推测FB-NJ-13与GD亲缘关系最近。FB-NJ-13感染小鼠后，仅灌胃组小

8、鼠体重下降；实时荧光定量RT-PCR方法未在小鼠脏器中检测到FCV。本研究分离得到1株FCV即FB-NJ-13株，测得其全基因组序列并提交至GenBank；对分离株FB-NJ-13的理化特性、细胞致病性、全基因组序列和遗传演化分析以及小鼠致病性等生物学特性进行研究。本实验为FCV流行病学研究和疾病防控提供了参考依据。