泌乳奶牛乳腺中小肽转运载体的鉴定及其生理特性的研究

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1、分类号S816.5学校代码10129UDC636学号2012301006泌乳奶牛乳腺中小肽转运载体的鉴定及其生理特性的研究StudyonIdentificationandPhysiologicalCharacteristicsofPeptideTransportersintheMammaryGlandofLactatingDairyCows申请人：崔艳学科门类：农学学科专业：动物营养与饲料科学研究方向：动物营养与畜产品品质指导教师：敖长金教授论文提交日期：二〇一五年十二月本项目由国家奶业“973计划”项目（No.2011CB100803）资助完成摘要本论文主要研究泌乳中期奶牛

2、乳腺组织及乳腺上皮细胞中小肽转运载体（PepTs）的表达定位及其潜在功能的调控，目的是确定泌乳奶牛乳腺中存在哪些小肽转运载体，在乳腺上皮细胞摄取小肽时所起的作用、发生的变化及其机理的初步探讨。从而为后期进一步深入研究小肽转运载体的分子功能及转运性能提供理论依据，也为完善小肽的摄取代谢模型及乳蛋白前体物的合理配比模块提供依据与积累资料。本论文主要包括四个试验，其结果如下：1．泌乳奶牛乳腺中小肽转运载体mRNA水平的鉴定随机采集三头泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织，部分样品进行提取组织总RNA，其余用于乳腺上皮细胞的培养，分别运用实时荧光定量PCR的方法和琼脂糖凝胶技术，通过基因转录

3、水平检测泌乳动物乳腺中重要的小肽转运载体PepT1、PepT2的表达。试验结果显示：无论是在泌乳奶牛乳腺组织中还是乳腺上皮细胞中，两种小肽转运载体的引物都存在特异性的扩增，并有着高度明显的表达；测序技术也证实了结果的可靠性，经分析比对后发现与目标序列同源性达到了100%，这说明泌乳奶牛乳腺中存在PepTs基因的表达。2．泌乳奶牛乳腺中PepTs的免疫学检测与定位首先从奶牛乳腺组织和体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中分别提取总蛋白，用WesternBlot的方法检测了小肽转运载体PepT1、PepT2两种蛋白的表达，随后制作切片采用IHC（免疫组织化学）与ICC（免疫细胞化学）试验技

4、术分别在奶牛乳腺组织及乳腺上皮细胞中对PepTs的分布进行了定位，最后用免疫荧光对结果进行了进一步证实。试验结果显示：两种小肽转运载体蛋白在泌乳奶牛乳腺中均有高强度的表达，PepT1主要存在于奶牛乳腺的细胞膜上，PepT2则主要存在于奶牛乳腺的细胞质中。3．奶牛乳腺中小肽转运载体的理化特性规律及功能调控试验从奶牛乳腺组织中提取上皮细胞进行纯化培养，命名为原代，待其生长到5总细胞数的80%～90%时，以1×10个/孔的密度接种并进行细胞传代处理，一直传到第五代，分别提取其总RNA进行RT-PCR试验，每个试验重复6次。结果发现：细胞培养代数对PepTs基因的表达影响显著，其中第

5、二代细胞相对于其它几代，无论对PepT1，还是PepT2的影响差异均显著（P﹤0.05），所以后续试验均选用第二代乳腺上皮细胞。随后设定不同的培养天数（第1d～6d）六个同一时间点，以每组试验6个重复，考察细胞分化过程中对PepTs基因表达的影响规律。结果发现：PepTsmRNA在奶牛乳腺上皮细胞上的表达是依赖时间进程而变化的，呈现先升高后下降的趋势，并在第5天高度表达（P﹤0.05）。为了进一步系统的研究泌乳奶牛乳腺中PepTs的调控规律，试验设计在培养基中添加不同浓度的泌乳相关激素(培养24h)及不同的肽底物(48h)进行培养乳腺上皮细胞。试验结果显示：与不添加小肽、只添

6、加游离氨基酸组相比，添加0.0002、0.002、0.02、0.2IU/mL的Prolactin，50、500、5000ng/mL的Insulin，100、1000ng/mL的Hydrocortisone均可显著的增加PepTsmRNA基因的表达（P﹤0.05）；添加10%Thr-Phe-Phe，5%Phe-Phe，10%Leu-Leu和6µg/mLLeu-Leu时，PepT1、PepT2及αs1casion基因mRNA的丰度均表现最高（P﹤0.05），且有利于乳蛋白的合成。4．奶牛乳腺小肽转运载体基因真核表达载体的构建及在乳腺上皮细胞中的表达泌乳奶牛小肽转运载体PepT1基

7、因采用PCR方法，进行扩增克隆，通过限制性内切酶进行酶切反应和T4连接酶连接，重组质粒，构建真核表达载体并命名为pIRES2-EGFP-PepT1。泌乳奶牛寡肽转运载体PepT2委托上海生工生物技术有限公司合成，命名为pcDNA3.1-PepT2质粒。经测序验证比对无误后将pIRES2-EGFP-PepT1与pcDNA3.1-PepT2转染奶牛乳腺上皮细胞，用RT-PCR方法检测单独转染后对小肽转运载体表达的稳定性及对乳蛋白基因表达量的变化。结果显示：成功构建了奶牛乳腺I型小肽转运载体的真核表达载体pI