基于致病性丧失突变体focr4-1366的香蕉枯萎病菌致病相关基因功能分析

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1、结大營硕士学位论文题目：基于致病性丧失突变体的香蕉枯萎病菌致病相关基因功能分析作者：符冬妹指导教师：曾会才研究员专业：微生物学时间：二〇一五年五月Functionanalysisonthepathogenicity-relatedgenefromthenon-virulencemutantFocr4-1366ofFusariumoxysporumf.sp.cubenserace4AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementFortheMasterDegr

2、eeinScienceByFuDong-meiSupervisor:ZengHui-caiMajor:MicrobiologySubmittedtime:May,2015海大学学位论文原创性声明和使用授权说明原纖声權本簿重声明《所蝥交翁擎瀹文嚴本人在辱萍镥螓下，麴爾得麴成果，鰺文中注稱引《容絝本论文不含任铐其他个人瘦集体已经发義戚撰、过的作品成成果对本文的研究出重鏞的个人和集体均在文中以明供方式矜明拿法律鳕梁由本人承担论文作養名■论文難賴授杻翻本人完全了解海南大学关于收集，保存使用竽位论文的規定，学校有授爾并詾家

3、有关部门或机构进交论文的复印件和电子饭，允许论文螓相济阌学校賴为存在馆作■关系見弟高校用户锔供文饞麴繼覼务換級务本人攒海南大以将本学位染文的全《或部分内容編入有关数癱库进行检，可以采用影印，缩等鍵翱手段傷存和汇锎本莩位论文论文作者签名沬鳴年月恥一年本人经认真簡读高校学位论文全文数靄瘅发布鐶程翁本人学位论交交高校学位论文全文数■库中全文发布，并坷裱中规定參受关》益意文傷交歸盾；二年发布论文作者签名缪师签名為片年年摘要香蕉枯萎病（国外称巴拿马病，是由尖镰孢古巴专化型，引起的极具破坏力的一种土传真菌病害。种下分为个小种

4、，号小种不仅寄主范围广且破坏力强，对香蕉产业造成了巨大的危害。到目前为止，国内外科学家在香蕉枯萎病病理学上做了许多卓有成效的研究，完成了号和号小种的全基因组测序，克隆了一些致病相关基因，但其致病分子机制仍不十分清楚。本实验室前期合作完成了号和号小种的全基因組测序，并且通过插入建立突变体库。通过致病性测定筛选获得了一批致病性丧失或减弱突变体，对一批致病性丧失或严重减弱突变体插入失活基因进行了拷贝数验证、插入位点定位和基因序列克隆。本研宄在此工作基础上，以其中号小种致病性丧失突变体为研究对象，幵展了致病性离体叶片快速

5、测定条件优化、号小种强致病性野生型菌株分离鉴定；通过反转录方法验证该插入失活基因在野生型菌株中的表达，该基因的敲除载体和互补载体构建，从强致病力野生型菌株中对该基因进行敲除和互补验证该基因的致病相关性，对获得的敲除子与互补子进行致病相关生物学表型观察。取得了如下个方面的研宄结果：对致病性离体叶片测定的温度条件进行了优化，避免了离体叶片测定结果因环境条件变化而变化的缺陷，提高了致病性测定结果的稳定性和可靠性。分离获得了株致病性强的号小种野生型菌株。成功构建插入失活基因的敲除载体和互补载体，对野生型菌株进行基因敲除和

6、互补。敲除子丧失了致病性，互补子恢复了致病性，从而验证了该基因为致病相关基因。通过对插入突变体、敲除子互补子及野生型菌株进行生物学表型观察。结果发现，插入突变体和敲除子产孢能力和碳源利用能力较野生型与互补子低，而在菌丝形态和孢子形态、最适温度、最适合生长值上没差别；除互补子」妨的孢子萌发率稍低外，与、孢子萌发率没有差别。初步推测插入失活基因影响产孢量和碳源的利用，而对孢子萌发及菌丝、孢子形态没有显著的影响。通过敲除子野生型菌株产生的粗毒素对香蕉苗的影响及它们对细胞壁降解酶敏感性进行测定。实验结果表明：侵泡在从野生

7、型菌株分泌的发酵液中，香蕉叶片黄化程度远比敲除突变体的严重。说明该致病相关基因与毒素的分泌相关，该基因敲除后影响了的毒素产生能力；在相同的酶解时间，突变体、野生型、互补子释放的原生质体量没明显差别，该基因不影响对细胞壁降解酶的敏感性。关键词：香蕉枯萎病菌；尖孢镰刀菌号生理小种；突变体；致病性相关基因生物学表型；插入突变体；基因敲除AbstractFusariumwiltofbanana,alsoknownasPanamadiseaseinforeigncountries，厶△(4)Thebiologicalphe

8、notypesoftheT-DNAinsertedmutantstrainFocr4-1366,thegene-knockoutmutantstrainAFocr4B-1366,thecomplementarymutantstrainAFocr4B-1366-cpandthewildstrainFocr4Bwerestudied.Theresultsshowedthats