玉米弯孢叶斑病菌致病性分化定向选择机理和致病相关基因鉴定

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1、-------上海交通大学硕士论文玉米弯孢叶斑病菌致病性分化定向选择机理与致病相关基因鉴定摘要玉米弯孢菌叶斑病是由新月弯孢霉（Curvularialunata(Wakker)Boed）引起的，自上世纪90年代末，该病害在我国各玉米产区不断蔓延，成为制约我国玉米安全生产的主要病害之一。关于该病害的发生规律、品种资源抗性鉴定、病原流行学已有一些研究，然而关于寄主对该病原菌选择效应和致病相关基因却缺少深入研究。本文通过人工继代接种寄主和蛋白质组学技术相结合的方法，以弱致病类型的玉米弯孢叶斑病菌（Curvularialunata(Wakker)B

2、oed.）瓦试18（WS18）和C107为材料，反复接种（6代）玉米抗病自交系沈135，Mo17，78599-1，分析病菌致病性动态变化。在接种前二个世代，病情指数和菌丝蛋白图谱没有发生明显变化，到了第三代，病情指数明显增加，蛋白质图谱的差异蛋白数量和表达水平也同步发生变化。到接种第五代时，随着病情指数的增加，蛋白质图谱上的差异蛋白数量大幅增加。利用MALDI-TOP/MS鉴定出10个差异蛋白点，包括4个上调蛋白、4个下调蛋白和2特异诱导蛋白。其中3个蛋白点与致病性分化密切相关，包括两个与黑色素合成相关蛋白（下调蛋白Brn1,上调蛋白Sc

3、ytalonedehydratase）和1个甘油合成相关蛋白（上调蛋白NAD-dependentglycerol-3-phosphate）；2个过敏性相-----------1-----------上海交通大学硕士论文关蛋白（上调蛋白Serine/threonineproteinkinase,上调蛋白Iron/manganesesuperoxidedismutases），另外4个蛋白参与了能量代谢和信号转导过程（Triosephosphateisomerase,Phosphoglyceratemutase,RNBdomain,Ran/TC

4、4subfamily）。此外，还发现1种未知蛋白(hydrolasesoracyltransferases)。这些特异诱导或表达上调的蛋白与致病性分化关系密切，一方面可反映出抗病寄主对病菌的定向选择效应，另一方面可做为致病性分化标记，为深入研究致病性分化机理提供线索和技术方法。关于病菌致病相关基因的研究，本文利用限制性内切酶介导基因整合技术，用带有潮霉素和氨卞抗性基因的线性化质粒pv2和限制性内切酶HindⅢ转化经合适PEG浓度处理的弯孢菌CX3原生质体，构建获得200多个REMI突变体，经选择性培养基继代培养筛选出10株遗传稳定的白色转

5、化子，对这10株白化菌株进行致病性测定，接种结果显示具有很弱的致病性，从而形成了优化的弯孢菌异源基因转化体系。将单拷贝插入的白化菌株A－2进行质粒拯救，得到的特异性整合载体包含了430bp的弯孢菌基因组DNA序列信息，经NCBI数据库检索发现，插入位点侧翼序列与不饱和脂肪酸脱氢酶（FAD3）基因具有很高的同源性（93％），该酶是形成不饱和脂肪酸的关键酶类，可能与病菌孢子和菌丝的形成与萌发相关。关键词：玉米；弯孢菌；致病性分化；蛋白质组;REMI;突变；白化；质粒拯救-----------2-----------上海交通大学硕士论文STUD

6、IESONTHEMECHANISMOFDIRECTIONALSELECTIONOFCURVULARIALUNATAVIRULENCEDIFFERENTIATIONANDVIRULENCEGENEIDENTIFICATIONABSTRACTCurvularialeafspot,causedbyCurvularialunata(Wakker)Boed.,significantlyreducestheyieldsofmaizeinsomecountries.Thediseasehasbeenwidelyspreadfromnortheastto

7、southwestofChina.Sincetheendofnineteencentury,ithadbecomeoneofthemostseriousmaizediseasesonrestrictingthemaizeyields.Therearesomeresearchesonoccurrenceregulation,identificationofresistanceofvarietyresourceandepidemiologyofCurvularialunata,butlittlehasbeenknownabouttheviru

8、lencegenesandeffectsofselectionofthisdisease.Reinoculationandtwo-dimensionalelectrophoresiswerep