基于绵羊肺炎支原体tuf基因的荧光定量pcr方法的建立与应用

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1、硕士学位论文题目基于绵羊肺炎支原体tuf基因的荧光定量PCR方法的建立与应用作者尹正军完成日期2015年3月25日学科门类农学专业临床兽医学研究方向兽医临床微生物指导教师汤承教授学院（系、部）生命科学与技术学院授予学位日期年月日Developmentareal-timePCRTargettufofMycoplasmaOvipneumoniaeandApplicationByZhengjunYinAThesisSubmittedToSouthwestUniversityforNationalitiesinFulfillmentoftheRe

2、quirementsForMasterDegreeSupervisorbyProf.ChengTANGCollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalitiesChengdu,610041,P.R.ChinaMarch2015基于绵羊肺炎支原体tuf基因的荧光定量PCR方法的建立与应用摘要绵羊肺炎支原体（Mycoplasmaovipneumoniae，Mo）是造成绵羊和山羊慢性非进行性间质性肺炎的一个主要呼吸道病原。目前Mo在世界范围内进行广泛的流行，造成了全

3、球范围内养羊业的经济损失。由于Mo基因序列存在极大的异质性，给PCR检测方法的建立造成较大的困扰。已有普通PCR和荧光定量PCR检测Mo的报道，但仍然存在敏感度不高和通用性不强等缺陷。延伸因子Tu(ElongationfactorTu,EF-Tu)由tuf基因编码，广泛存在于真核生物、原核生物及古细菌中，在蛋白质合成过程中对多肽链的延伸至关重要。tuf基因序列保守，已广泛用于真菌、细菌和支原体的生物分类鉴定和系统进化分析，但目前还未见关于绵羊肺炎支原体tuf基因结构特征和遗传多样性的报道。本研究旨在通过对Motuf基因的分子特征分析研究，

4、设计引物，建立通用性更好、敏感度更高的荧光定量PCR检测方法，并用该方法进行Mo感染的病原流行病学调查。1绵羊肺炎支原体tuf基因的分子特性研究根据GenBank中Motuf基因编码区（CDS区）序列自行设计引物，扩增Mo参考株Y98和11株Mo临床分离株CDS区，测序和序列分析发现：12株Mo的tuf基因CDS区长1209bp，编码402个氨基酸，其核苷酸序列及氨基酸序列同源性均为93.3%～100%，G+C含量为39.45%～40.12%；CDS两端保守，中间区域存在较大的变异，其中21～960bp区域碱基突变率仅为8.93%，突变率

5、高达26.9%的位点重点分布于961～1189bp区域内，但是在138～309bp和1047～1196bp区域内保守。有117个单核苷酸突变位点，有41个无义突变，76个有义突变，导致其编码的53个氨基酸发生突变,突变氨基酸主要集中在325～354位点。其中2株分离株含两个TGA密码子，而其他分离株只含一个TGA密码子。TGA是原核生物的终止密码子，而在支原体中却被翻译成色氨酸。I基于绵羊肺炎支原体tuf基因的荧光定量PCR方法的建立与应用基于tuf基因的遗传进化分析发现Mo与猪肺炎支原体亲源关系最近，其次为结膜炎支原体，与基于全基因组的

6、遗传进化分析结果完全吻合，但与基于16SrRNA建立的遗传关系不同，说明Motuf基因作为分子靶标进行遗传进化分析优于16SrRNA。对12株Mo的分析发现Y98单独聚为一支，而11株分离株全部聚为一支，却又分为两个亚支。有趣的是，来自Z地的3株分离株聚在一个亚支，来自J地的4株分离株聚在一个亚支，来自L地的分离株则不规则的分布在这两个亚支中。从本实验现有的样本数量观察发现，来自Z地和来自J地羊场的菌株似乎有地域性的倾向，若要证实这个现象还需进一步的扩大样本的数量。2基于绵羊肺炎支原体tuf基因的荧光定量PCR方法的建立由于支原体基因组的

7、G+C含量一般都较低且不同菌株之间存在很大的异质性而限制了分子检测方法的建立。目前Mo的分子检测方法有基于16SrRNA、Hsp70建立的PCR方法但是灵敏度不高，易造成假阴性结果的出现。前期研究发现，Mo的tuf基因在138～309bp和1047～1196bp区域内与其他感染羊的支原体差异较大，但种内保守，有作为设计检测Mo的分子靶点的潜力。因此用PRIMER5软件设计多对特异性引物并筛选到一对最佳引物，扩增150bp大小片段，扩增位点为1047～1196bp区域，以获得最低的Ct值分别对反应条件及体系进行优化。结果显示，以Mo的核酸为

8、模板通过基于tuf基因的荧光定量PCR扩增后的产物在熔解温度为81.5℃±0.3℃，呈现特异性单峰，无非特异扩增峰及二聚体。该方94法在5×10～5×10拷贝/反应线性范围良好，相关系数为0.