vfa对亚急性瘤胃酸中毒肉牛瘤胃上皮细胞炎性信号通路的影响

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1、VFA对亚急性瘤胃酸中毒肉牛瘤胃上皮细胞炎性信号通路的影响EffectsofVFAoninflammatorysignalingpathwaysofrumenepithelialcellinbeefcattlewithsubacuterumenacidosis作者姓名：郭立辉专业：临床兽医学指导教师：王哲教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月5日中文摘要VFA对亚急性瘤胃酸中毒肉牛瘤胃上皮细胞炎性信号通路的影响亚急性瘤胃酸中毒（SARA）是由于反刍动物摄取大量快速发酵的碳水化合物，使瘤胃VFA蓄积，pH降低，瘤胃菌群紊乱所引发的一种以发病隐袭为临床特征的群发性消化障碍性疾病。瘤

2、胃上皮是机体防御病原微生物感染的第一道防线也是营养物质吸收转化的重要器官。虽然临床研究表明，SARA与瘤胃炎、肝脓肿、蹄叶炎和后腔静脉栓塞综合征等炎性疾病的发生有密切关系。但瘤胃内容物对瘤胃壁的局部炎性作用和全身的炎性作用还不清楚，其炎性信号通的研究还未见报道。本实验采用体内体外实验相结合的研究策略。体内实验：检测瘤胃液VFA和血液相关炎性指标IL-1β、IL-6、TNF-α含量，结合瘤胃组织学形态学，结果显示SARA与瘤胃组织的炎性损伤相关。体外实验：建立体外犊牛瘤胃上皮细胞培养方法。用不同低pH培养基处理细胞，分别添加不同浓度的VFA处理细胞。运用WesternBlot和RT-PC

3、R技术研究其对NF-κB、p38炎性通路及其下游炎性因子的影响。建立瘤胃上皮细胞培养方法，使用连续胰酶消化法分离细胞。然后对细胞进行生化和形态学的鉴定。细胞阳性表达细胞角蛋白CK-18，形态学上呈典型的铺路石状，超微结构形态具有典型的微绒毛、桥粒、紧密连接等上皮特征，在第4天细胞增殖活性和乳酸脱氢酶活性最强。可以作为细胞模型研究瘤胃的生理、病理分子生物学。体外培养犊牛瘤胃上皮细胞,研究低pH环境对瘤胃上皮细胞炎性因子表达的影响。在不同pH（5.5和7.2）的培养环境下处理细胞，检测NF-κBp65和IκB蛋白的表达与细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κBp65mRNA

4、表达。结果显示，在低pH环境（pH5.5）处理组，NF-κBp65和IκB蛋白的表达I显著升高；IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κBp65的mRNA表达水平均显著或极显著高于对照组(P<0.05/P<0.01)。为了进一步验证不同浓度VFA对瘤胃上皮细胞炎性信号通路的作用。设置处理组：0，×1倍浓度，×5倍浓度VFA，PDTC抑制剂20mM，PDTC抑制剂20mM+×5倍浓度VFA，SB203580，SB203580+×5倍浓度。结果显示，高浓度VFA活化NF-κB、p38炎性通路及其下游炎性因子。牛SARA对瘤胃上皮细胞炎性信号通路的活化，不仅受低pH的影响，还受VFA浓度的

5、影响，说明SARA的致炎作用是低pH和高浓度VFA两因素共同作用的结果。关键词：挥发性脂肪酸，亚急性瘤胃酸中毒，低pH，NF-κB/p38炎性通路，原代培养，瘤胃上皮细胞IIAbstractEffectsofVFAoninflammatorysignalingpathwaysofrumenepithelialcellinbeefcattlewithsubacuterumenacidosisSubacuteruminalacidosis(SARA)isduetoexcessiveintakeofrapidfermentationofcarbohydrates,resultinginVFA

6、saccumulation,lowpHenvironmentandthedysbacteriainrumen.ThentherumenepithelialcellstructureandbarrierfunctionweredestroyedbyhighconcentrationofVFAsintherumen.Ruminalepitheliumisnotonlythebody'sfirstlineofdefenseagainstpathogeninfection,butalsoisthevitalorganstoabsorbthenutrient.Althoughtherehaveb

7、eenalargenumberofstudieshavereportedSARAcantriggerrumenlocationinflammatoryreactionandsystemicinflammatorydisease.Itsinflammatorysignalingpathwayhasnotbeenreported.Theexperimentalstrategycombinedwithinvitroandinvivoexperimen