sirt1在宫颈癌发生中作用的初步研究

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1、分类号：R737.3密级：不保密UDC：616.006学校代码：11065硕士学位论文SIRTl在宫颈癌发生中作用的初步研究王誉静指导教师于红教授病原生物学学科专业名称论文答辩日期2015年6月2日SIRTl在宫颈癌发生发展中作用的初步研究摘要目的:第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶亦称为Sirtuins，即沉默信息调节因子2（silentinformationregulator2，Sir2）的同源蛋白，研究表明SIRT1与肿瘤的发生发展密切相关，有望成为肿瘤治疗的新靶点。本研究拟通过在组织水平检测宫颈癌SIRT1的表达及其与临床病理特征之间的关系；在细胞水平研究SIRT1对宫颈癌

2、SiHa细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及其Notch信号通路相关蛋白的影响，探讨SIRTl在宫颈癌发生、发展中的作用机制及其与Notch-Hes信号通路的关系。方法:收集2012年9月-2014年3月青岛大学附属医院病理科宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织石蜡标本，选取临床病理资料完整者221例（包括CINI级，CINII-CINIII级，宫颈鳞癌及正常宫颈组织）。免疫组织化学方法检测SIRT1蛋白的表达，分析其表达与临床指标的相关性；化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA（siRNA），以LipofectamineRNAiMAX脂质体为载体转染SiHa细胞，转染72h后，提取各

3、组总RNA及总蛋白。RT-PCR检测SiHa细胞SIRT1mRNA的表达，免疫印迹法检测SiHa细胞中SIRT1、Notch1、Hes1及cyclinD1蛋白的表达，细胞毒性检测试剂盒（CCK-8)检测细胞增殖抑制率，迁移侵袭实验检测SiHa细胞的迁移侵袭能力，分别应用AnnexinV-PE双染法及Hoechst33258染色法检测细胞凋亡。结果:免疫组化结果显示：SIRT1在正常宫颈组织及程度较轻的宫颈上皮内瘤变（CINI级）中未见阳性表达；67例CINII-III组织中有16例SIRT1阳性（23.9％）；而54例宫颈癌组织中29例SIRT1表达阳性（53.7％）。

4、RT-PCR结果表明：与空白细胞对照组、转染试剂对照组、SIRT1阴性对照组相比，siRNA-SIRT1干扰组细胞SIRT1mRNA表达明显下调(P＜0.05)。Westernblot显示：与对照组相比，siRNA-SIRT1干扰组细胞SIRT1蛋白表达量明显下调(P＜0.05)，cyclinD1、Notch1和Hes1蛋白的表达明显上调(P＜0.05)。CCK-8细胞增殖实验结果表明：siRNA-SIRTl转染组抑制率为37％，SIRT1阴性对照组抑制率为8.7％，转染试剂对照组抑制率7.3％，转染组抑制率明显高于其他组。Transwell迁移及侵袭实验结果显示：与对

5、照组相比，siRNA-SIRT1干扰组穿过人工基底膜细胞数明显减少。流式细胞术结果表明：siRNA-SIRT1干扰组凋亡率为16％而SIRT1阴性对照组凋亡率仅为2.6％。Hoechst33258染色显示：siRNA-SIRT1干扰组SiHa细胞核明显变小，其染色质浓缩，并可见凋亡小体，而SIRT1阴性对照组、转染试剂对照组和空白细胞对照组细胞核呈均匀淡蓝色。结论:靶向SIRT1基因的siRNA能有效抑制SiHa细胞的增殖、迁移及侵袭并诱导细胞凋亡，siRNA-SIRT1诱导的细胞凋亡与Notch-Hes信号通路密切相关，有可能通过Notch-Hes信号通路参与高程度C

6、IN向宫颈浸润性癌的转化过程。硕士研究生王誉静(病原生物学)指导教师于红教授关键词：SIRT1；RNAi；宫颈癌细胞；Notch-信号通路；细胞凋亡AbstractObjective：TheclassIIIhistonedeacetylasebelongstoSirtuins,namelythehomologousproteinofsilentinformationregulator2.ItwaswellknownthatSIRT1iscloselyrelatedtotheoccurrenceoftumorandmightbeanoveltargetfortumortr

7、eatment.ThepurposeofthisstudywastodetecttheexpressionofSIRT1incervicalcancertissueanditsrelationshipwiththeclinicalcharaters,toinvestigatetheeffectofRNAinterferencetargetingSIRT1geneontheproliferation,migration,invasion,apoptosisandNotchsignalingpathwayinhumancervicalcanc