rlz-8通过angtie-2信号通路改善大鼠局灶性脑缺血作用的研究

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1、rLZ-8通过Ang/Tie-2信号通路改善大鼠局灶性脑缺血作用的研究ThestudyofimprovementeffectsofrLZ-8throughAng/Tie-2signalingpathwayonratsafterfocalcerebralischemia作者姓名：蒋金凌专业名称：药理学指导教师：任立群教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年6月2日前言随着脑血管病的发病率逐年增加，其高致残率和高死亡率等特点使脑血管病日益受到广泛关注，成为威胁人类生命和健康的主要杀手之一。脑卒中是由脑血液循环障碍引起的临床危重脑血管病，可分为出血性和缺血性两种类型，其中缺血性脑

2、血管病最为常见，高达54%的患者5年内会再次发病，而其复发率也超过30%，严重影响了患者的生活质量，给社会和家庭带来沉重负担。随着世界范围内缺血性脑血管病防治的基础和临床医学研究的不断深入，探讨其发病机制和寻找有效药物成为当前面临的重要课题。血管生成素（Ang）及其受体酪氨酸激酶受体（Tie-2）信号转导通路在血管生成调节中发挥着重要的作用，Ang和Tie-2结合，可以促进血管重塑、成熟，同时通过调节内皮细胞与间质细胞的相互作用维持血管结构的稳定性和完整性。脑缺血刺激Ang等血管生成因子的分泌，诱导新生血管生成及侧支循环的有效开启，增加血流代偿，有利于保护组织细胞免受缺血缺氧

3、性损伤。Ang/Tie-2还可以通过激活PI3K/Akt信号转导通路发挥抗缺血区神经元凋亡的作用。PI3K/Akt信号转导通路是将信号由膜受体表面向细胞内转导的重要途径，在调节细胞增殖、分化、凋亡和死亡过程中起关键作用，是一条具有较确切神经保护作用的信号转导通路。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通过激活其下游无活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）转位至浆膜内表面，使Akt磷酸化，进而参与调节多种生命活动。Akt的活化也对缺血性脑损伤起着重要的神经保护作用，其机制为减少氧自由基生成、抑制炎症反应等。重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）是通过基因工程方法，将LZ-8的基因重组并在毕

4、赤酵母系统中分泌表达而得到的具有免疫调节作用的蛋白。rLZ-8具有与LZ-8相似的免疫活性，它能够上调外周血白细胞的数量，改善化疗小鼠白细胞低下症；具有抗肿瘤活性，延缓肿瘤生长速度，抑制瘤体的增生；还能够改善亚急性帕金森小鼠行为学损伤；通过抑制糖皮质激素骨质疏松大鼠骨量减少，对骨小梁的退行性损伤发挥积极作用。此外，rLZ-8还能够改善局灶性脑缺血大鼠神经功能障碍，抑制神经细胞凋亡，通过上调VEGF、Ang-1及TGF-β蛋白的表达，促进缺血区的血管新生，对大鼠局灶性脑缺血具有积极的保护作I用。本实验采用线栓法制备大脑中动脉阻塞大鼠局灶性脑缺血模型，通过神经功能评分、HE染色、

5、免疫组织化学、RT-qPCR和蛋白免疫印迹等方法，观察重组灵芝免疫调节蛋白对大鼠局灶性脑缺血的保护作用，探讨Ang/Tie-2信号通路及其下游PI3K/Akt信号转导通路相关基因和蛋白的影响，旨在阐明重组灵芝免疫调节蛋白保护大鼠局灶性脑缺血的作用机制，寻找有效的药物靶点，为脑缺血的治疗和重组灵芝免疫调节蛋白的开发提供依据。II中文摘要rLZ-8通过Ang/Tie-2信号通路改善大鼠局灶性脑缺血作用的研究背景：脑血管病是威胁人类健康和生命的三大疾病之一，不仅引起脑功能障碍，还会导致神经功能损伤，最终致残或死亡，其中，缺血性脑血管病的发病率一直居高不下。因此，积极寻找和开发有效治

6、疗脑缺血疾病的药物成为当前面临的重要课题。重组灵芝免疫调节蛋白是近年来发现的具有多种生物学活性的蛋白，有研究证实它对脑缺血损伤具有积极的保护作用，但其作用机制尚未明了。目的：通过观察脑组织形态学变化，Ang-1、Tie-2、PI3K、Akt和p-Akt基因和蛋白在缺血脑组织中的表达情况，探讨重组灵芝免疫调节蛋白通过Ang/Tie-2信号转导通路发挥神经保护的作用及机制。方法：采用改良ZeaLonga线栓法制备大脑中动脉阻塞大鼠局灶性脑缺血模型。将健康成年Wistar大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、阳性药对照组（GM-1,10mg/kg体重）、rLZ-8低剂量组（17.5μ

7、g/kg体重）、rLZ-8中剂量组（35μg/kg体重）及rLZ-8高剂量组（70μg/kg体重）。各给药组动物于造模当天开始采用腹腔注射方式给药，连续7d，每天给药两次，记录各组大鼠神经功能评分。于第8天取各组大鼠脑组织经石蜡包埋处理进行HE染色，观察大鼠脑缺血后脑组织损伤的病理学变化；Westernblot方法检测大鼠脑组织中Ang-1、Tie-2、Akt和p-Akt蛋白的表达；RT-qPCR方法检测PI3KmRNA的表达水平；免疫组织化学方法检测PI3K、Akt和p-Akt蛋白在脑组织中的表达。对