erk2f12信号传导通路在大鼠局灶性急性脑缺血再灌注中的作用

《erk2f12信号传导通路在大鼠局灶性急性脑缺血再灌注中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、·英文缩略语·5·论文·ERKl／2信号传导通路在大鼠局灶性急性脑缺血再灌注中的作用刖舌缺血性脑血管病所产生的神经功能损害一直是困扰医学界的一大难题，新近的研究提示，脑缺血后神经元的修复不仅与神经营养因子、生长相关因子等因素有关，还取决于缺血区新生血管的恢复情况⋯。血管生成素(Angiopoietin，Ang)是近年发现的一种蛋白质分子，参与多种生理以及病理情况下的血管新生，在脑缺血后可以通过多种作用机制改善脑血流灌注，挽救缺血半暗带的神经元，从而改善缺血性脑血管病的神经功能恢复。丝裂原活化蛋白激酶(mitogena

2、ctivatedproteinkinases，MAPKs)瞳3是一组在细胞内广泛存在的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，它包括细胞外信号调节激酶(extracellularsignalregulatedkinase，ERK)、p38、c—Jun氨基末端激酶(c．Jun—NH2一terminalkinase，JNK)和ERK5(BMKl)等，通过一系列激酶的链式磷酸化，激活转录因子从而调节细胞生存、分化及凋亡等。ERKl／2是MAPKs家族中最早被认识的激酶，研究发现Ang在Hela等肿瘤细胞的增殖过程中通过ERKl／2信号通路

3、发挥了促血管生成的重要作用口1。但是ERKl／2信号传导通路在大脑局灶性脑缺血中的作用机制尚缺乏深入的了解，本研究通过大鼠局灶性急性脑缺血／再灌注模型研究ERKl／2及Ang-2的表达水平，明确ERKl／2信号通路在大脑缺血／再灌注中的作用。实验方法一、实验材料实验动物：健康雄性SD大鼠36只，由中国医科大学实验动物中心提供。主要试剂：羊抗兔二步法试剂盒、枸椽酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；水合氯醛、甲醛、二甲苯、过氧化氢、氯化钠、氢氧化钠、多聚甲醛等药品均为国产分析纯。6实验动

4、物分组及模型制备2．1分组：健康雄性SD大鼠，鼠龄3．4个月，体重200．2509，由中国医科大学动物部提供，清洁级。大鼠自由进食水，常温、正常昼夜节律下饲养1周以适应环境。随机分为假手术组和缺血组，缺血组又分为脑缺血／再灌注6h、12h、24h、48h和72h组，每组6只，共计36只。大鼠术前禁食不禁水。2．2缺血再灌注模型制备：大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型【4】：应用线栓法制作大鼠大脑中动脉梗死模型。具体过程：大鼠全身麻醉后，颈正中部切开，显微镜下分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(I

5、CA)以及ECA和ICA的分支，并仔细分离迷走神经。O号线结扎CCA和ECA，ICA挂线备用。在CCA扎线上端臣OECA、ICA分叉膨大处下方剪一小口，以顶端烫成光滑球面的4．0单尼龙线为栓线插入小口并缓慢送／X．ICA，当插入约(18．5±O．5)mm时即大脑中动脉的起始部停止插线，此时应提拉ICA的挂线，阻断血从ICA颅内段流出，插线完毕后，将ICA矛H尼龙线一起结扎，消毒，缝合皮肤后留1cm尼龙线在皮肤外面。即可闭塞MCA，造成可靠的梗死灶。120min后，轻轻提拉栓线，有阻力是提示栓线头端已达ECA或CCA切

6、口处，制备再灌注模型，无需再次切开颈部。假手术组大鼠暴露颈内、颈外动脉后即缝合，其余处理同手术组。三、脑梗死模型的判定线栓法大鼠局灶性脑缺血模型评分：手术大鼠清醒后进行神经功能的评分，参照ZeaLonga[5】等的5分制评分标准，在大鼠麻醉清醒后观察并记录神经功能症状：无神经病学征象为0分；提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直为1分；向瘫痪侧旋转征象为2分；向病灶对侧跌倒为3分；无自发活动及意识障碍者为4分；评分在1．3分的大鼠认为模型制作成功，纳入实验分组。采用单盲法进行神经功能评分，即观察者不知实验分组。排除标准：手术

7、、麻醉意外等死亡，蛛网膜下腔出血、存活时间未达取材时间以及再灌注时未苏醒的动物。并按严格的实验条件统一补充动物。四、标本取材缺血组动物按分组情况至规定时间后立即断头，取海马组织并用4％中性缓冲7甲醛溶液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋。连续冠状切片，片厚4lam，分别行HE染色、免疫组化检测。假手术组取与缺血组对应区域海马组织，假手术组在缺血组对应时间点断头取脑，其余操作与缺血组相同。五、苏木素．伊红染色(Hematoxylin．Eosin，HE)取缺血区脑组织常规脱蜡至水。置于0．5％苏木素液中染色5min左右，水洗

8、lmin，75％盐酸酒精分化30s，自来水流动洗后，氨水反蓝处理30s，再水洗lmin后，0．5％酸化伊红乙醇染12min，流水快速冲洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性光学树脂封固。光学显微镜下观察缺血区脑组织神经元形态结构的改变。六、免疫组化染色检测Ang．2、ERKl／2、CD34缺血区海马组织石蜡切片常规脱蜡至水，置于3％H202的PBS