rbm5-wntβ-catenin信号通路在香烟烟雾致肺泡上皮细胞损伤中的作用机制

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1、RBM5-Wnt/β-catenin信号通路在香烟烟雾致肺泡上皮细胞损伤中的作用机制RBM5-Wnt/β-cateninsignalingincigarettesmoke-inducedalveolarepithelialinjurymechanism作者姓名：郝玉秋专业名称：内科学研究方向：肺损伤的发生机制指导教师：张捷教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学第二医院论文答辩日期：2015年6月3日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位盲审专家王莉莉副研究员中国医科大学主席李玉林教授吉林大学基础医学院盲审专家李文教授浙江大学医学院附委员孙连

2、坤教授吉林大学基础医学院属第二医院王丽教授东北师范大学生命张捷教授吉林大学第二医院科学院鲍永利教授东北师范大学生命安东善教授吉林省人民医院科学院许力军教授吉林大学第一医院马忠森教授吉林大学第二医院李玉新教授东北师范大学本论文在以下项目资助下完成国家自然科学基金项目（81241069，2012年）中文摘要烟草相关性死亡已构成全球人口死因的第一位，在我国每年死于烟草相关性疾病的患者大约有100万，其中最常见的疾病是COPD和肺癌。近年来PM2.5污染的暴露对人类的健康的影响倍受关注，香烟燃烧的烟雾是室内PM2.5主要来源之一，香烟的烟雾(包括肉眼看不到的部分)是一些微小的颗粒物且富含PM

3、2.5，可直接进入呼吸道和肺泡从而对人体产生危害，PM2.5一旦被吸入呼吸道，即可沉积在直径2-4μm的小气道内，破坏呼吸道防御屏障，使肺功能受损，导致呼吸道系统疾病发病率的增加。同时，香烟烟雾里面还包含近六千种化学物质，其中绝大部分是对身体有害的，特别是苯并芘等，已证明它们是一类具有明显致癌作用的有机化合物。因此，探讨香烟烟雾PM2.5暴露引发的肺损伤的分子机制可为肺部疾病的防治提供新的靶点和科学依据。RBM家族是新近发现的，由HUGO基因命名委员会正式命名的RRB/RBM/RNP蛋白的亚群，由于此类蛋白是RNA结合蛋白，可能与RNA的剪接、翻译和稳定性有关。目前研究认为RBM5一

4、种新的肺癌候选抑癌基因，它最重要的特征是参与调控细胞促凋亡过程，而且与吸烟相关性肺癌的发生密切相关。Wnt信号通路是存在于生物体中，是一类高度保守的信号通路。Wnt信号通路在动物胚胎发育的早期、器官形成、组织再生及其它生理过程中，具有至关重要的作用。目前的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路与吸烟相关性疾病发生、发展，尤其在肺部疾病的发生、发展中至关重要。我们以前的研究中发现外源性导入RBM5后，人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP顺铂的耐药性逆转，β-catenin基因表达水平下调。我们推测，RBM5可能是β-catenin的上游调节基因，在吸烟相关性肺损伤中调控Wnt/β-

5、catenin信号通路。本研究以人肺泡上皮细胞（A549）为研究对象，以RBM5-Wnt/β-catenin为靶点，探讨RBM5-Wnt/β-catenin在香烟烟雾PM2.5暴露致肺泡上皮细胞损伤中的作用及分子调控机制，明确RBM5是否是Wnt/β-catenin信号通路的上游调节因子，为进一步研究吸烟相关性肺部疾病发生的分子机制提供科学依据，为肺部疾病的防治提供新的靶点及思路。方法：采用0,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml的香烟提取物（CSE）或者DMSO在24h、48h、72h给予人肺泡上皮细胞（A549细胞）检测如下：（1）MTT法分析A549细

6、胞的生存率；（2）Transwell法检测A549细胞的侵袭能力；（3）RT-PCR、real-time-PCR法检测RBM5的mRNA的表达水平；Westernblot法检测RBM5及Wnt/β-catenin信号通路相关元件的蛋白表达水平；（4）免疫荧光标记A549细胞内β-catenin的表达及分布：（5）流式细胞术、吖啶橙染色及Westernblot法检测细胞的增殖及凋亡率；（6）荧光素酶报告基因检测A549细胞的转录因子TCF的活性；（7）转染pcDNA3.1-RBM5/si-RBM5，采用Westernblot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关元件的蛋白表达；（

7、8）采用ICG-001阻断Wnt/β-catenin信号通路，Westernblot法检测RBM5及Wnt/β-catenin信号通路相关元件的蛋白表达；结果：（1）CSE抑制A549细胞的增殖，随着CSE作用时间的延长及浓度的增加，对A549细胞的生长的抑制率越大，具有时间及剂量的依赖性；当CSE的浓度增加到80ug/ml，时间延长到72h，A549细胞死亡的较多，提示CSE可以引起肺泡上皮细胞（A549细胞）的损伤；（2）给予CSE的A549细胞的细胞