mir-34a靶向调控notch1抑制乳腺癌及增加其化疗敏感性的研究

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1、MiR-34a靶向调控Notch1抑制乳腺癌及增加其化疗敏感性的研究MiR-34asuppressesbreastcancerandincreasesthechemosensitivitybytargetingNotch1pathway作者姓名：康乐专业名称：病理学与病理生理学研究方向：分子病理生理学指导教师：杨宝学教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学基础医学院论文答辩日期：2015年6月1日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位李玉新教授东北师范大学主席李玉林教授吉林大学吕延杰教授哈尔滨医科大学委员金宁一教授中国人民解放军军

2、事医学科学院祝世功教授北京大学王恩华教授中国医科大学高鹏教授山东大学刘强教授大连医科大学盲审教授王丽颖教授吉林大学中文摘要MiR-34a靶向调控Notch1抑制乳腺癌及增加其化疗敏感性的研究研究背景：乳腺癌是女性易患肿瘤之一。虽然近年来在乳腺癌早期诊断与系统治疗方面有较大进展，但其复发率及难治率仍然居高不下。因而，寻找新的有效的诊断及治疗方法一直是乳腺癌研究中的热点问题。乳腺癌干细胞是乳腺癌中一小部分具有自我更新、无限增殖、多向分化等干细胞特性的癌细胞亚群。大量研究显示它是乳腺癌发生的根源，在乳腺癌的复发、转移及对化疗药物耐药性的产生等方面都扮演了重要角色。MicroRN

3、As（miRNAs）是一类内源性非编码单链小分子RNA，一般长约18～24个核苷酸。成熟的miRNA通过特异性结合靶mRNA的3’端非翻译区（3’-untranslatedregion，3’-UTR），使靶蛋白mRNA降解或使其翻译受到抑制，从而调节内源基因的表达。miRNA参与了细胞增殖、迁移、凋亡、分化等多种细胞生命活动的调节。大量研究证实miRNA在几乎所有的恶性肿瘤中都存在表达异常，认为其在肿瘤发生发展中起到重要作用。近来研究认为其在肿瘤干细胞的自我更新、分化等过程中也扮演重要角色。根据miRNA在肿瘤细胞中的作用可将其分为两类，一类在肿瘤细胞中表达升高，并且可通

4、过抑制抑癌基因的表达促进肿瘤的发生，被称为促癌miRNA；另一类则其可通过抑制癌基因的表达抑制肿瘤的发生发展，被称为抑癌miRNA。作为研究较早的抑癌miRNA，miR-34a在多种肿瘤中发挥抑癌作用，近年来研究发现其在前列腺癌干细胞、胰腺癌干细胞中也发挥重要的调节作用，但其在乳腺癌干细胞中的作用及机制尚需进一步研究。Notch信号通路是一个进化上相对保守的通路，在胚胎发育、器官成熟及肿瘤发生发展过程中均发挥重要的调控作用。Notch1是与乳腺癌的发生、转移及耐药密切相关的Notch受体之一。近年来研究发现其在维持乳腺癌干细胞的自我更新，调控其分化中扮演重要角色。Notc

5、h1是miR-34a的靶基因之一，因而miR-34a/Notch1可能在乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的调控中发挥重要作用。I本研究通过对临床组织样本的检测及体外实验，探讨了miR-34a靶向Notch1在乳腺癌细胞的增殖、侵袭迁移、乳腺癌干细胞调控及肿瘤耐药性中的作用，为乳腺癌的临床诊断及治疗提供了依据。方法：以qRT-PCR方法检测乳腺癌组织及正常组织中miR-34a及Notch1mRNA的表达水平，以免疫组化方法检测Notch1在乳腺癌中的表达水平，分析miR-34a与肿瘤转移、临床分期以及Notch1表达的相关关系。以miR-34a模拟物、Notch1siRNA或其阴性

6、对照分别转染MCF-7细胞，采用qRT-PCR及Westernblot方法检测Notch1及其下游因子的表达变化，采用CCK-8法检测细胞增殖水平，采用Transwell法检测细胞侵袭及迁移的变化，Westernblot法检测E-cadherin、Vimentin的表达变化。采用流式细胞术检测+-CD44/CD24细胞比例，Westernblot法检测ALDH1表达水平变化。构建表达Notch1胞内结构域的pcDNA3.1-Notch1质粒，并将其与miR-34a模拟物共转染于MCF-7细胞中，检测各组细胞增殖水平、迁移能力、+-CD44/CD24细胞比例及ALDH1的表

7、达变化，以观察miR-34a/Notch1在乳腺癌细胞增殖、侵袭迁移以及乳腺癌干细胞调控中的作用。将miR-34a模拟物与紫杉醇分别或联合作用于MCF-7细胞，以CCK-8法观察对细胞活力的影响，以乳腺球形成实验检测乳腺癌干细胞自我更新能力，以Westernblot方法检测Notch1、Hes1、ABCG2及ALDH1的表达水平，探讨miR-34a影响MCF-7细胞化疗敏感性的作用机制。结果：miR-34a在乳腺癌组织中的表达水平明显低于正常组织，在伴有淋巴结转移的乳腺癌组织中明显低于不伴淋巴结转移的乳腺癌组织。在临床Ⅰ-Ⅲ期