mir-206靶向zfp580调控平滑肌细胞表型转换研究

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1、_授予单位代码10089学号或申请号20122488HebeiMedicalUniversity硕士学位论文科学学位miR-206靶向ZFP580调控平滑肌细胞表型转换研究研究生：蔡松志导师：张梅教授张文成教授专业：内科学二级学院：武警后勤学院2015年3月河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公幵和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有

2、。否则，承担相应法律责任。••...-•.............研究生签名P师签章：/二级孪院领导盖章^夂年少：：歡曰河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师签章:/M年今月)p曰目录中文摘要…………………………………………………………………1英文摘要…………………………………………………………………4英文缩写…………………………………………………………………8研究论文miR-206靶向ZFP580调控平

3、滑肌细胞表型转换研究前言………………………………………………………………9材料与方法………………………………………………………10结果………………………………………………………………21附图………………………………………………………………24讨论………………………………………………………………30结论………………………………………………………………32参考文献…………………………………………………………32综述miRNA在调控血管平滑肌细胞的分化和表型转换的分子机制…36致谢……………………………………………………………………47个人简历………………………………………………………………48

4、中文摘要miR-206靶向ZFP580调控平滑肌细胞表型转换研究摘要目的：调控血管平滑肌（VSMC）表型转换是防治PCI术后再狭窄的新策略，microRNA作为VSMC表型转换的调节因子，可通过转录后水平调控下游靶基因的的表达从而影响VSMC的表型转换。本组首先克隆的C2H2型锌指核转录因子ZFP580可调控内皮细胞及VSMC的增殖及迁移而影响血管重塑。本组新近实验证明：microRNA-206既可靶向调控ZFP580的表达，又可促进VSMC从收缩型向合成型转换。本实验拟采用microRNA-up与microRNA-down技术，观察microRNA-206表达水平的变化对大鼠VSMC分化

5、功能的影响，并验证其可能的分子机制。方法:提取分离大鼠VSMC，通过形态学观察及免疫组化法进行鉴定。生物信息学分析ZFP580与miR-206的结合位点。利用TGF-β（根据文献参考选取2ng/ml）对大鼠VSMC进行不同时间点刺激，对照组选用等量的DMEM。Realtime-PCR测定miR-206的表达水平；Western-blot检测ZFP580、SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表达水平；使用慢病毒过表达或低表达miR-206、慢病毒过表达或低表达ZFP580和应用SB431542抑制剂后检测相关指标；荧光素酶报告实验（Lucifera

6、se）检测miR-206与ZFP5803‘UTR的结合作用。结果：（1）在大鼠VSMC加入适宜的TGF-β（根据文献参考选取2ng/ml）进行预处理，分别刺激大鼠VSMC6h、12h、24h、48h，对照组中加入等量的DMEM。利用Realtime-PCR测定miR-206的表达水平，结果发现在12h的时候miR-206的水平降至最低点，与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）。Western-blot检测ZFP580的表达水平，结果显示同样在12h时ZFP580的表达水平达到最高，与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）。故在随后的实验当中，时间节点选取12h作为实验刺激最佳时间点。

7、（2）SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表达水平：利用TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC不同时间点均导致phospho-Smad2/3的升高，随着刺激时间的延长呈现着表达减少的趋势。而Smad2/3的表达各组1中文摘要间无明显差异。TGF-β可诱导大鼠VSMC由合成表型向收缩表型的转换，促进VSMC的分化，在实验当中随着TGF-β的刺激，平滑肌细胞的分化标记物SMa-ac