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《马尾松无性系接种松材线虫前后生理生化特性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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摘要马尾松（Pinusmassoniana）是我国南方主要用材树种之一，广泛分布于长江流域以南诸省，是重要的经济树种，近些年来由于松材线虫的入侵导致许多马尾松大面积的死亡。松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）是我国危害较大的外来入侵物种之一，能够引起松材线虫病（Pinewiltdisease,PWD）。它是世界上最具危险性的森林病害之一，使感病植株迅速枯死，且传播蔓延极快，一旦发病将造成极为严重的损失，到目前为止还没有什么很有效的方法来根治这种松树的“癌症”。本选题以安徽省林业科学研究院选育出的抗松材线虫病马尾松无性系为材料，这些抗性无性系已经过3次人工线虫接种，具有了较强的抗性。本研究再进行一次线虫的人工接种，以实验手段来探寻这些抗性品种在线虫接种前后光合生理的特性以及一些生理指标的变化情况，分析其与马尾松抗性的相关性，填补马尾松抗松材线虫病研究方面的一些空白，同时为抗性育种的进一步研究提供理论依据，并为寻找松材线虫病的防治措施和根治方法打下一些理论基础。本试验研究结果如下。（1）不同抗性的马尾松在接种前的7月份，净光合速率（Pn）、气孔导度（Cond）、和蒸腾速率（Tr）呈现明显的双峰型，具有明显的“午休”现象，决定Pn日变化的主要因子是光合有效辐射和空气相对湿度。接种后的9月份，11月份，Pn的双峰型不明显，Cond和Tr则为单峰型。胞间CO2浓度在接种前后总体上都是呈现先下降后升高的趋势。（2）不同抗性马尾松的光饱和点（LSP）与光补偿点（LCP）在接种前后都较高，说明它们对高光强有很强的适应性，是明显的阳生植物，在夏季具有最大的光合潜力。（3）接种松材线虫对叶绿素含量的影响不明显，但不同抗性之间的马尾松叶绿素a、a+b、a/b的含量差异显著，叶绿素b的含量差异不显著。不同抗性的马尾松在接种前后，叶绿素荧光参数的变化不同：抗性强、抗性中和抗性弱的马尾松，‘’其F0、Fv/Fm和ETR值都有显著差异，说明接种松材线虫对初始荧光、有效光化学量子产量和电子传递速率有影响。（4）不同抗性马尾松针叶内脯氨酸的含量差异达到显著水平，但并没有呈现正相关和负相关，而是抗性中等的含量最高，抗性强的次之，抗性弱的最低；接种前后不同抗性马尾松的脯氨酸含量差异显著，接种松材线虫对脯氨酸含量有显著影响。（5）不同抗性的马尾松之间SOD和POD酶活性差异不显著，CAT酶活性差异IV 显著；接种松材线虫对SOD和POD酶的活性产生了显著的影响，对CAT酶活性的影响不显著。关键词：马尾松，接种，松材线虫病，光合生理生态，叶绿素荧光，保护酶V AbstractMassonpine(Pinusmassoniana)isoneofthemaintimberspeciesinthesouthernChina.Duetoitsstrongadaptability,easypropagation,rapidgrowthandwidedistribution,Massonpineisanimportanteconomicspecies.Inrecentyears,however,theinvasionofpinewoodnematodecausedalotofMassonpinetreesdiedoff.BursaphelenchusxylophilusisoneofthemostdangerousinvasivespeciesinChina,whichcancausepinewiltdisease(PWD).ThePWDisthefataldiseaseofpineforests.StudiesonPWDathomeandabroadaremostlyconcentratedinBursaphelenchusxylophilusandmucronatusspeciesidentification,lifehistory,host,pinewoodnematodeinsectvectors,transmission,pathogenesis,preventionandtreatmentmeasures,butsofarfewstudieshasbeenconductedonwhichisaneffectivemethodtoprotectthispinewiltdisease.ThisstudyfocusdonthePWD-resistentMassonPineClonesselectedbytheForestryResearchInstituteofAnhuiProvince.Basedonthedifferentresistentclones,weconductedoncemoreinoculationexperimenttorevealthedifferencesinphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsamongsttheseclonesbeforeandaftertheinoculationandanalyzetheircorrelationwiththeresistanceofMassonpine.Theresultsobtainedareasfollows.(1)Thenetphotosyntheticrate(Pn),stomatalconductance,andtranspirationrate(Tr)ofneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpineclonesshowedabipeakpatternbeforeinoculation(inJuly)withanobvious"noon-break"phenomenon.Themaincontrollingfactorsarephotosyntheticallyactiveradiationandrelativeairhumidity.Afterinoculation,thediurnalpatternsofabove-mentioedparametersshowedmonopeakinSeptemberandNovember.IntercellularCO2concentrationsweregenerallydecreasedatfirstandthenincreasedbothbeforeandafterinoculation.(2)ThelightsaturationpointandlightcompensationpointwerehigherbeforeinoculationthanafterinoculationforthedifferentPWD-resistentMassonpineclones,indicatingastrongadaptabilitytohighlightintensityforthispinespecieswithgreatphotosyntheticpotentialinsummer.(3)Theeffectsofinoculationofpinewoodnematodeonchlorophyllcontentwasnotsignificant.However,thecontentsofchlorophyllaandratioofchlorophyllatobweresignificantdifferentamongthedifferentPWD-resistentclones.ThechangesofchlorophyllfluorescenceparameterssuchasFo,Fo'/Fm'andETRweresignificantVI differencesamongthedifferentPWD-resistentclonesafterinoculation.Thissuggeststhatpinewoodnematodeinoculationhadasignificantimpactontheinitialfluorescence,effectivephotochemicalquantumyieldandelectrontransferrate.Thethreeparameterscanbeusedasphysiologicalindicesforevaluatingwhetherthetreeinfectedwoodnematode.(4)ThereweresignificantdifferencesinprolinecontentsofneedlesamongthedifferentPWD-resistentclones,withthehighestcontentinthemid-resistentcloneandlowestinthelow-resistentclone.Theinoculationhadasignificanteffectontheprolinecontent.(5)TheactivitiesofSODandPODwerenotsignificantdifferencebetweenthedifferentresistentclones,whiletheactivityofCATwassignificantlydifferent.ThisresultindicatedthattheinoculationhadsignificanteffectontheactivitiesofSODandPOD.Keywords:Pinusmassoniana;incolation;pinewiltdisease;photosyntheticalecophysiology;chlorophyllfluorescence;protectiveenzymeVII 目录1文献综述..........................................................................................................................................11.1马尾松松材线虫病研究进展：....................................................................................................11.1.1不同树龄马尾松的抗病性差异......................................................................................11.1.2马尾松不同种源的抗病差异.........................................................................................11.1.3与种源抗病性有关的主要成分......................................................................................21.1.4马尾松的诱导抗性.........................................................................................................41.1.5马尾松抗性育种.............................................................................................................41.2马尾松生理特性研究进展.............................................................................................................51.2.1马尾松光合生理特性......................................................................................................51.2.2马尾松叶绿素含量..........................................................................................................61.2.3马尾松保护酶系统..........................................................................................................62引言................................................................................................................................................73试验材料和方法..............................................................................................................................83.1实验地概况及实验材料................................................................................................................83.1.1实验地概况.....................................................................................................................83.1.2实验材料..........................................................................................................................83.2研究方法.......................................................................................................................................83.2.1光合测定.........................................................................................................................83.2.2叶绿素含量的测定.........................................................................................................93.2.3游离脯氨酸（Pro）的测定.........................................................................................103.2.4植物保护酶的活性测定...............................................................................................103.3数据分析与处理.........................................................................................................................134结果与分析....................................................................................................................................144.1接种前后抗性马尾松光合特性变化..........................................................................................144.1.1接种前后抗性马尾松光合日变化...............................................................................144.1.2接种前后抗性马尾松光响应曲线拟合.......................................................................214.1.3接种前后抗性马尾松叶绿素荧光特性变化...............................................................244.2接种前后抗性马尾松的叶绿素含量变化..................................................................................284.3接种前后抗性马尾松的脯氨酸含量变化..................................................................................294.4接种前后抗性马尾松保护性酶的含量变化..............................................................................315讨论与结论....................................................................................................................................32VIII 5.1讨论.............................................................................................................................................325.1.1接种前后抗性马尾松光合日变化................................................................................325.1.2接种前后抗性马尾松光响应曲线拟合........................................................................335.1.3接种前后抗性马尾松叶绿素荧光特性变化................................................................335.1.4接种前后抗性马尾松叶绿素含量变化........................................................................355.1.5接种前后抗性马尾松脯氨酸含量与保护性酶活性变化............................................355.2结论.............................................................................................................................................35参考文献............................................................................................................................................37致谢..............................................................................................................................................41作者简介............................................................................................................................................42IX 插图和附表清单表1环境因子日变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19Table1Diurnalvariationsofenvironmentalfactors表2净光合速率与其影响因子的相关关系矩阵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20Table2Correlationmatrixofthenetphotosyntheticrateanditsinfluencingfactors表3净光合速率与其影响因子的通径系数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20Table3Pathcoefficientsbetweennetphotosyntheticrateanditsinfluencingfactors表4种前后不同抗性马尾松不同月份光响应的拟合模型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23Table4RegressionmodelsforthelightresponsecurvesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation表5接种前后不同抗性马尾松不同月份光响应曲线的特征参数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23Table5CharacteristicparametersofthelightresponsecurvesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation表6接种前后不同抗性强度马尾松针叶内脯氨酸含量变化的方差分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯30Table6VarianceanalysisresultforfreeprolinecontentinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation表7接种前后不同抗性强度马尾松针叶内脯氨酸含量变化的多重比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯30Table7MultiplecomparisonforfreeprolinecontentinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation表8接种前后不同抗性强度马尾松针叶内保护酶活性变化的方差分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯31Table8VarianceanalysisresultoftheprotectiveenzymeactivityinneedlesofdifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation图1不同抗性马尾松不同月份净光合速率日变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15Fig.1DiurnalvariationsinphotosyntheticrateofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths图2不同抗性马尾松不同月份气孔导度日变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16Fig.2DiurnalvariationsinstomatalconductanceofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths图3不同抗性马尾松不同月份蒸腾速率日变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17Fig.3DiurnalvariationsintranspirationrateofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths图4不同抗性马尾松不同月份胞间CO2浓度日变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18Fig.4DiurnalvariationsinintercellularCO2concentrationofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths图5接种前后不同抗性马尾松不同月份光响应曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22Fig.5LightresponsecurvesforthedifferentPWD-resistentMasoonpinesindifferentmonthsX 图6接种前后不同抗性强度马尾松针叶F0、Fm、Fv的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25Fig.6ChangesofFo,FmandFvofneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation图7接种前后不同抗性强度马尾松针叶Fv/Fm、Fv/F0、Fv′/Fm′的变化⋯⋯⋯⋯⋯26Fig.7ChangesofFv/Fm,Fv/FoandFv'/Fm'ofneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation图8接种前后不同抗性强度马尾松针叶qP、qN、ETR的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27Fig.8ChangesofqP,qNandETRofneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation图9接种前后不同抗性强度马尾松叶绿素含量的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28Fig.9ChangesofchlorophyllcontentsinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation图10接种前后不同抗性强度马尾松针叶内脯氨酸的含量变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29Fig.10ChenagesoffreeprolineconcentrationsinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation图11接种前后不同抗性强度马尾松针叶内保护酶的活性变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31Fig.11ChangesofprotectiveenzymeactivityinneedlesofdifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculationXI 主要符号表PWD松材线虫病Pn净光合速率Cond气孔导度Ci胞间CO2浓度Tr蒸腾速率Vpdl叶面水汽亏缺压Tair空气温度Tleaf叶片温度CO2R空气CO2浓度RHr空气相对湿度PARi叶片表面光合有效辐射PARo环境光合有效辐射WUE水分利用效率Lcp光补偿点Lsp光饱和点Pmax最大净光合速率AQY光合量子效率Fo原初荧光Fm最大荧光Fv可变荧光PSⅡ光系统ⅡFv/FmPSⅡ最大光化学效率Fv/F0PSⅡ潜在活性‘’Fv/FmPSⅡ有效光化学量子产量qP光化学猝灭系数qN非光化学猝灭系数ETR电子传递速率Pro脯氨酸SOD超氧化物歧化酶CAT过氧化氢酶POD过氧化物酶XII 1文献综述1.1马尾松松材线虫病研究进展：目前针对马尾松（Pinusmassoniana）松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）病的研究内容比较多，主要有以下几个方面。1.1.1不同树龄马尾松的抗病性差异已有研究表明，在非人工条件下，不同年龄段的马尾松对松材线虫病的抗性强弱[1]存在不同。杨宝君等在国内首先发布了不同松树对松材线虫的抗性变异，认为马尾[2][3][4]松是抗性树种，具有高抗性的马尾松一般为3年生幼苗，以后，杨宝君、王企明等报道了22个种源的10年生马尾松接种后没有一株感病，因此具有高抗性。Kihachiro[5][6]等研究也认为马尾松为高抗性，并把高抗性马尾松与高感病性的黑松（Pinusthunbargii）进行杂交，得到了抗性比较强的杂交树种“和华松”。在随后的研究中，[7]徐福元等人分别对40个种源中的7年生和10年生的马尾松采用“截枝套管法”进行人工接种试验，结果发现它们的抗病指数均为100，没有感病的症状，因此徐福元认为不同种源的马尾松均是具有高抗性的树种。但还有些研究认为，马尾松抗松材线虫病额抗性与树龄长势也有很大的关系。周[8]国梁等研究认为，马尾松对松材线虫的抗性随树龄的变化而变化，高感的马尾松一般为1∼2年生幼苗，中感的一般为25年生以上苗木，10年生左右的有高抗性，而徐[9][10]福元等1994年用从松褐天牛成虫活体上分离并用PDA平板灰葡萄孢（Botrytiscinerea）培养的松材线虫对不同生长势和不同龄级的马尾松的进行接种试验，结果显示：生长势旺盛的14年生以下的马尾松幼树抗松材线虫病；长势弱16年生以上的马尾松中龄成熟林和过熟林对松材线虫病的抗性较弱，并且随着长势的减弱和树龄的增[11]加抗病能力逐渐减弱。黄山市林科所抗性育种课题组的科研人员认为，不同种源和家系2～3年生马尾松幼树对松材线虫病的抗性表现出的差异较大，接种10个种源，4个敏感，6个没有感病，未感病种源比例占60％；接种20个家系，其中14个敏感，[12]6个没有感病，未感病家系比例占30％。谈家金对马尾松4～6年生苗木的致病力进行研究中发现，4～6年生的马尾松特别容易感染松材线虫病。1.1.2马尾松不同种源的抗病差异[13]根据徐福元、葛明宏等1995年40个14年生的马尾松种源对松材线虫的感病1 抗性测定结果显示，我国表现为抗松材线虫病的种源有5个，主要是我国广东、广西和贵州种源，它们分布在广东英德、广东信宜、广西恭城、广西宁咀和贵州都匀，但是在过去几年广东地区马尾松大面积爆发松材线虫病，由此推测松材线虫的致病力也[14]可能在增强。汪企明、徐福元等对39个13年生的马尾松种源以及6种其他松树接种了松材线虫，每株接种线虫约5000投（线虫提取自当地死于松材线虫病的马尾松）。试验结果表明，不同种源的马尾松和不同松树对松材线虫的抗性以及感病进程变异差别很大。5个强抗性种源（广西忻城、湖北远安和广东高州、英德、信宜）的马尾松抗性显著高于其他种源，也高于晚松（P.serotina）和黑松，但低于高抗性的短叶松（P.echinata）、湿地松（P.elliottii）、火炬松（P.taeda）和刚松（P.rigida）。另外，马尾松种源对松材线虫抗性变异有着明显的地理趋势，它与经度无关，与纬度呈显著负相关，是单一的由南向北的变异，同时它与温度因子显著，与降水因子极显著正相关，随着产地从南方的湿热条件至北方的干冷气候变化，其抗性不断减弱。40个种源经模糊聚类分析，按抗病指数以及立地指标被分为南带、中带和北带，南带主要分[7]布着抗性强的种源。其后徐福元等人连续4a对来自中国南方的40个马尾松种源进行了抗性研究，通过对供试的不同种源马尾松进行人工接种松材线虫，结果发现广东5号3个种源和广西2、3号抗松材线虫病，它们在连续4a的接种过程中均没有任何感病表现，具有很高的稳定性和可靠性，而其他种源则均表现出不同程度的感病症状。1.1.3与种源抗病性有关的主要成分（1）萜类化合物萜类化合物在植物界中广泛存在，是以异戊二烯为单位的聚合物，尤其在松节油和很多挥发油中萜类化合物的含量很高，它们一般有奇特的芳香气味，不少萜类化合物有毒，可以防止昆虫的啃噬。目前已检出马尾松松脂的单萜类有7个组分，倍半萜[15]有13个组分，双萜类有20个组分。因此许多学者开始研究松科植物中的萜类化合物[16]与抗性的关系。据报道，植物对病虫害的抗性可能与它们所含的萜类化合物相关。[11]徐福元等曾研究了几种松树的树龄、萜类化合物和感病性之间的相互关系，认为马尾松体内的几种内含物与松材线虫的繁殖和生存关系密切：α-（王古）（王巴）烯、去氢枞酸和长叶烯的含量越高则越有利于松材虫的繁殖和生存。随着马尾松树龄的增长，α-（王古）（王巴）烯、去氢枞酸和长叶烯的含量增高，但其抗性降低，马尾松[17]的抗性与单萜、α-蒎烯、和枞酸型树脂酸含量呈正相关。赵振东等从江苏省林业科学研究院马尾松种源基因库中选出有代表性的3个种源：高抗种源中抗种源四川2号、广西2号、敏感种源陕西1号为对象来研究，进行了不同抗性马尾松种源的中性萜类化合物组成以及含量差异的研究，结果表明：高抗种源、中抗种源和敏感种源中的中有2 着相似的性萜类化合物组成，但含量有着明显的不同；高抗性种源中含有更多的长叶烯，有的高达324％、雪松烯、长叶蒎烯、α-松油醇和山达海松二烯，但β-蒎烯、α-蒎烯、反式石竹烯、β-水芹烯、山达海松醛和β-芹子烯等的含量较少；马尾松不同种源的抗性与雪松烯、长叶烯、、α-松油醇、金合欢烯、山达海松二烯以及2个未鉴定的组分呈明显的正相关，而与β-蒎烯、α-蒎烯、反式石竹烯、β-水芹烯、、β-芹子烯和二萜中性物等的含量呈负相关：高抗性马尾松种源比中抗和敏感种源含有更多的长叶烯，单萜类和二萜类中性化合物的含量较少，因此长叶烯与马尾松种源的抗性直接相关。马尾松不同种源的抗性可以用反石竹烯和长叶烯之间的关系来表征，即长叶烯含量越高，反石竹烯的含量差别越大，其抗病性能力越强；反之，马尾松种源的抗病性就越差。（2）氨基酸植物抗病虫害性与体内氨基酸的含量有关，如谷氨酸、天门冬氨酸、丙谷氨酸、[15]丝氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和蔗糖都具有刺激害虫吸食的作用。徐福元等[18]在以前实验结果的基础上，选择有代表性的高抗种源广西2号、中抗种源四川3号、敏感种源陕西1号以及敏感黑松种源（对照），分别研究了接种松材线虫前后的固态氨基酸含量、营养成分游离氨基酸与感病指数的相互关系，研究结果表明：固态氨基酸含量与感病指数呈正相关关系，抗病种源的固态氨基酸含量较高，相关趋势较明显的有天门冬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、、酪氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸等11种固态氨基酸。固态氨基酸含量与感病性呈负相关关系的仅有胱氨酸1种，且有较明显的相关趋势。松树抗松材线虫病的原因是固态氨基酸含量高使得生长势旺盛，产生丰富的次生代谢产物，对松材线虫的繁殖有抑制作用。在接种松材线虫后，抗病种源均比敏感和轻感种源含有较低的苏氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酸和精氨酸等10种游离氨基酸，它们的含量与其感病指数都呈正相关关系，这表明抗松材线虫病的马尾松种源的游离氨基酸含量低。同时，试验结果还表明：10种游离氨基酸在不同抗病性的马尾松种源中有降低的趋势，这说明用游离氨基酸的含量这一生化指标来[19]鉴定抗病种源或抗病松种是具有可能性的。（3）针叶矿质营养元素因有关微量元素是树木中酶的组成部分，故这些元素的含量将会影响到酶的活[17]性，进而对树木的新陈代谢活动也产生影响，最终会影响到树木对病虫害的抗性。[20]邹永梅等用ICP仪对10个有代表性马尾松种源针叶的矿质元素进行了测定，同时把松松材线虫接种到这10个种源上，试验结果表明：不同时期的马尾松矿质元素含量与马尾松对松材线虫的抗性关系不同，其中休眠期针叶内的Mn、Co、Fe含量与抗病性呈正相关关系，而Ni含量则与抗病性呈负相关关系。3 （4）松树泌脂速度通常把松树泌脂状况看做是松材线虫病的主要症状之一，过去一直被作为一个较为成熟的该病早期诊断的方法，即根据钻孔后松脂的流到孔口的时间长短或有没有来[21]确定病害是否发生或病害正处于哪个阶段。束庆龙等通过对不同树龄、不同松种和不同树势的泌脂实验发现马尾松的泌脂速度比黑松的要大，但比火炬松的小，与其它的报道中所认为的：在马尾松、黑松、火炬松3种松树中，黑松最容易感病，马尾松次之，火炬松最高的结果相同，并认为无论是树龄、树种、或树势等哪种因素，泌脂速度都与植株的抗病性呈明显的负相关关系，因此，泌脂速度也可作为松树对松材线虫病的抗性指标之一。1.1.4马尾松的诱导抗性诱导抗性是植物在受到外来生物危害后体内发生了异常的的生理变化，组织内产生了各种化学反应，生成次生代谢物质来抵抗病虫害的发生。通过外界因素的诱导产生植物的防病抗虫性，就是诱导抗性，其植物能够通过诱导产生被称为植[22]物抗病激活剂的抗病性化学物质。目前把诱导性看做是对松材线虫病进行生物防治的一种有效方法。把松材线虫传播到健康的马尾松体内后，线虫开始在树体内大面积的移动，在虫体扩散的过程中，树木产生了异常的生理变化。诱导抗病性是树木的一种主动抗性，在接种弱致病力的松材线虫后，感病松树可获得对强致病力株系的高[23]度抗性。葛明宏等试验表明，乙烯、吲哚丁酸和铵可诱导马尾松产生较高的抗病性，其可达到60％～100％诱抗效果。此外，松树产生诱导抗性的另一有效方法是利用无毒松材线虫，使松树接种无毒松材线虫产生诱导抗性。1.1.5马尾松抗性育种以前使用过各种各样的方法来防治松材线虫病，包括砍伐受害木、火烧、扒皮、防治媒介昆虫、熏蒸喷施杀线剂、提高林木的活力、改善林地卫生状况等，但近些年来，由于抗性育种技术的发展，培育出的具有松材线虫抗性的马尾松品种越来越多的得到应用。日本于1973年开始进行研究抗松材线虫育种，并对国内外松树对松材线虫的抗性、抗性检测方法、松树造林材料的遗传改良以及抗性育种的可行性等方面进[24][25]行了许多的研究。徐六一等的研究表明为了选拔马尾松松材线虫抗性候补木，安徽省松材线虫抗性育种中心于2003∼2005年间开展了1次及2次接种检定。2003、2004年对抗性候补木选拨母群体中培育的324个家系、约44000株苗木进行了1次检定，平均生存率为20.8%、18.6%、；2004、2005年对1次检定合格的298个家系、8035株苗木进行了2次检定，平均生存率为57.0%、92.6%。应用2次检定合格的家系生存率来评价抗性强弱，区别出23个抗性强的家系，在抗性苗木生产之前，可以4 使用23个家系的原母树。1.2马尾松生理特性研究进展1.2.1马尾松光合生理特性光合作用是绿色植物利用叶绿素等光合色素，在可见光的照射下，把CO2和水转化为储存能量的有机物，并释放氧气的生化过程，同时也有将光能转变为有机物中[26]化学能的能量转化过程。目前对马尾松光合生理特性的研究比较普遍，张如华等研究了不同家系的马尾松光合特性，表明马尾松净光合速率的日变化为一双峰曲线，第一峰值比第二峰值高；光照、温度、湿度、CO2等环境因子在一天内不同时期对光合的影响和作用不同，每个时期只有1～2个因子对光合活动起主导作用；优良家系具有高叶绿素含量、小的气孔密度、低叶绿素a/b值和较大的孔径以及高的光合速率[27]等光合特征。杨雨华等研究了不同生长势的马尾松光合日变化也表明马尾松净光合日变化曲线也呈双峰型，株高、地径与净光合速率呈现极显著正相关；高生长势的无性系马尾松净光合速率大，呼吸消耗相对较小。自然条件下，环境因子随时间和空间发生变化，只有在一定的环境因子变化范围内植物才有最大的生长与光合速率，当环境因子超过一定的度时就会表现出对生长发育的抑制，就构成了环境的胁迫。环境胁迫从多方面影响植物，尽管植物生长和形态等方面对环境胁迫的反应较为直观，但往往滞后于生理反应，一旦已经造成胁迫伤害，就难以恢复。因此，探讨逆境植物生理生态响应已经成为人们研究植物光合生理生态[28]特征的重要方法和研究手段。张向峰等研究了水分胁迫对马尾松光合特性的影响，结果表明：在正常和轻度的水分胁迫下，马尾松净光合速率日变化曲线呈明显的双峰型，在中度和重度水分胁迫下光合蒸腾速率明显下降，尤其是重度水分胁迫下两者基本处于稳定状态且非常低；在正常、中度和轻度水分胁迫下，马尾松气孔导度和净光合速率变化基本一样，在重度水分胁迫下，气孔导读呈逐渐下降的趋势，但不明显。[29]杨书运等研究了高浓度CO2对马尾松光合速率的影响，认为提高环境温度可扩大适宜马尾松中幼林光合有效辐射强度（PAR）范围，有利于提高光能利用率，但也加快了大气CO2消耗，CO2浓度的增加和植物消耗之间可能会在一个较高的CO2浓度水平上达到动态平衡；另外高温也有利于提高马尾松中幼林的光合速率，但温度过高[30]则会对光合作用产生抑制。沈燕等则通过模拟酸雨研究了其对马尾松荧光特性的影响，结果表明在酸雨胁迫下，马尾松叶片的PSⅡ原初光能的转换效率、电子传递效率和激发能利用情况均受到一定的影响，从而不利于其进行光合作用及生长，故在酸雨严重的地区，不适宜大范围种植马尾松。5 1.2.2马尾松叶绿素含量叶绿素是植物生长过程中的一个重要因素，可作为农作物生长状况、植物病理诊[31]断等提供科学依据，杜华强等以马尾松针叶野外高光谱数据为基础，建立了马尾松针叶叶绿素含量与光谱反射率及9个特征参数之间的关系，为理解马尾松林生态系统[32]过程及马尾松松材线虫病的早期预测及治理对策提供了理论依据。徐柏森等对马尾松10个家系的叶绿素含量和气孔形态进行了测定、分析和比较得出闽北种源比闽西[33]种源叶绿素含量高，叶绿素a/b值低；气孔密度和孔径呈负相关。黄益江等探讨了叶绿素含量与马尾松产脂力间的相关关系，对高产脂优树的早期选择、鉴定与利用提供了一定的理论和实践依据。1.2.3马尾松保护酶系统植物代谢过程中产生氧自由基，细胞内氧自由基过多会引起膜脂过氧化从而产生氧化伤害。生物体内消除活性氧的主要保护机制是利用抗氧化酶系统，其特征之一就在于抗氧化酶的生物合成能力随着生物体内活性氧生成量增加而升高，因此抗氧化酶活性的改变间接反应了环境中有毒有害物质的存在，是分子水平上预报逆境胁迫对生[34]态系统危害的敏感生物标记物之一。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）都植物体内的一类保护酶，它们对逆境的反应非常敏感，SOD酶可以催化超氧化物离子自由基迅速发生歧化反应，产生H2O和H2O2，从而有效降低超氧化物离子自由基对膜系统的伤害；POD和CAT又是清除双氧水的主要酶类，它们通过将H2O2分解为H2O来防止造成细胞损伤，这三种酶在植物的抗性中起着重要的作用。总体上来说干旱胁迫下细胞内酶系统的变化趋势为合成酶类活性下降，水解酶类以及某些氧化还原酶类活性提高，水分胁迫下SOD、CAT和POD活性表现出上升和下降两种不同的趋势，在盐胁迫情况下则呈现先升高后降低的趋势。徐向华等[35]的研究还表明在低磷胁迫条件下，保护性酶活性增加。6 2引言松材线虫是我国危害较大的外来入侵物种之一，能够引起松材线虫病。1982年在南京中山陵首次发现，以后相继在江苏、安徽、广东和浙江等地成灾，几乎毁灭了在香港广泛分布的马尾松林。近距离传播主要靠媒介天牛，如松墨天牛，远距离主要靠人为调运带疫（带松材线虫的天牛）的苗木、松材、松木包装箱及松木制品等进行传播。危害寄主包括黑松、赤松（Pinusdensiflosa）和马尾松在内的数十种松属植物，[36]也危害少数非松属针叶树。它是世界上最具危险性的森林病害之一，使感病植株迅速枯死，且传播蔓延极快，一旦发病将造成极为严重的损失。目前，该病广泛分布于美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韩国、日本及中国等多个国家，其中日本、韩国、[37][38][39][40]中国受害最为严重，已有40多个国家将其列为检疫对象。马尾松是我国南方主要用材树种之一，因其具有适应性强、繁殖容易、生长迅速及用途广泛等特点，广泛分布于长江流域以南诸省，是重要的经济树种。近些年来由于松材线虫的入侵导致许多马尾松大面积的死亡，而且松材线虫病潜伏期长，发病快，使人们很难发现给予及时的防治；松材线虫病的危害是整株枯死，这与其他病虫害所引起的单株生长量减少有显著的区别。2001年10月，我国与日本合作“安徽省马尾松材线虫抗性育种”项目正式启动，计划用5a左右的时间，完成200个家系马尾松抗性候选木的选择工作。通过对马尾松1次接种测定，结果筛选出了25个抗性家系，并将它们所育成苗木作为暂定有抗性的苗木进行利用。2008年10月该项目结题后至今，安徽省林业科院研究院以此为基础继续进行抗性育种方面的研究。国内外对松材线虫病的研究大部分集中在松材线虫与拟松材线虫的种类鉴定，松材线虫的生活史、寄主，媒介昆虫，传播途径，致病机理，防治措施等方面，但到目前为止还没有什么很有效的方法来根治这种松树的“癌症”。本选题以安徽省林业科学研究院选育出的抗性无性系为材料，这些抗性无性系已经过3次人工线虫接种，已经具有较强的抗性，本研究计划再进行一次线虫的人工接种，以实验手段来探寻这些抗性品种在线虫接种前后光合生理的特性以及一些生化指标的变化情况，通过分析来确定其与马尾松抗性的相关性。以此来填补马尾松抗松材线虫病研究方面的一些空白，另一方面为抗性育种的进一步研究提供理论依据，并为寻找松材线虫病的防治措施和根治方法打下一些理论基础。7 3试验材料和方法3.1实验地概况及实验材料3.1.1实验地概况试验地设在合肥市庐阳区大杨镇国家林业高科技开发中心内抗松材线虫病马尾松无性系保存圃，地处江淮之间，117°03′44″～117°25′33″E，31°41′54″～31°57′59″N，为亚热带湿润季风气候，四季分明，气候温和，雨量适中，梅雨显著，夏雨丰沛，年均温度为15.7℃，极端最低气温-20.6℃，极端最高气温41.0℃，无霜期227d，年平均降水量在988.4mm。土壤为黄棕壤，质地粘重，呈微酸性。3.1.2实验材料试验材料为通过两次人工接种松材线虫测定选择出的9个抗松材线虫病马尾松[41]无性系（以下简称抗性马尾松），树龄均为5a。根据蔡卫兵等的抗性评价方法，把这9个抗性马尾松分成抗性强（H组,分别是广东2-5、广东54-1与和县4-3）、抗性中（M组，分别是和县14-3、和县15-1与滁州7-1）和抗性较低（L组，分别是滁州9-3、黄山2-3与休宁21-4）3组，每组3个重复。3.2研究方法3.2.1光合测定（1）光合日变化的测定测量仪器采用美国LI-COR公司生产的LI-6400光合测定系统，分别于线虫接种前的7月份和接种后的9月份、11月份的晴朗天气在野外进行活体测定，从7:00-18:00每隔一小时测定一次。采用自然光源，使用针叶叶室，叶室面积为2cm×6cm。主要-2-1-2-1测定指标为：净光合速率（Pn，μmol⋅m⋅s）、气孔导度（Cond，mol⋅m⋅s）、胞间-1-2-1CO2浓度（Ci，μmol⋅mol）、蒸腾速率（Trmmol，mmol⋅m⋅s）、叶面水汽亏缺压（Vpdl，-1Kpa）、空气温度（Tair，℃）、叶片温度（Tleaf，℃）、空气CO2浓度（CO2R，μmol⋅mol）、-2-1空气相对湿度（RHr，%）、叶片表面光合有效辐射（PARi，μmol⋅m⋅s）、环境光合-2-1有效辐射（PARo，μmol⋅m⋅s）。水分利用效率（WUE）的计算采用FischerandTurne-1的方法，即WUE=Pn⋅Tr。9个无性系分为3组，每组3个重复，每个重复测定树木中部向阳部位5～6根松针，记录3组稳定数据，最后的统计数据取平均值。8 （2）光响应曲线的测定分别于线虫接种前的7月份和接种后的9月份、11月份的晴朗天气在野外进行活体测定，采用LI-6400光合测定仪对9个抗性马尾松进行测定。将红蓝光源（LED）设定一系列光合通量密度：2000、1500、1200、1000、800、600、400、200、150、-2-1-1120、100、80、50、20、0μmol⋅m⋅s，CO2浓度选取大气CO2浓度（约400μmol⋅mol），测定时叶片温度（29±0.5）℃～（32±0.5）℃，改变光强后最小等待时间120s，最长等待时间200s。运用二项式回归的方法计算光补偿点（Lcp）、光饱和点（Lsp）、最大净光合速率（Pmax）等相关参数。根据低光照强度测得的光合速率值建立直线回[42]归方程，直线斜率即为光合量子效率（AQY）。（3）叶绿素荧光的测定分别于线虫接种前的7月份和接种后的9月份、11月份的晴朗天气采用LI-6400光合测定仪测定和计算叶绿素荧光参数：原初荧光（Fo），最大荧光（Fm），可变荧光（Fv），光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光化学效率（Fv/Fm）、潜在活性（Fv/F0）、有效光化学量子产量（Fv′/Fm′），光化学猝灭系数（qP）、非光化学猝灭系数（qN）和电子传递速率ETR。其中，Fv/Fm在测定前，叶片用铝箔包裹，进行了20min的暗适应。3.2.2叶绿素含量的测定分别于线虫接种前的7月份和接种后的9月份、11月份进行采样，采回后即进行实验操作。叶绿素含量的测定采用张宪政的混合液法。根据测定样品数等体积混合丙酮和无水乙醇备用。取5束左右松针，擦干净，剪成2～3mm长的小段，准确称重0.2g左右，放入三角瓶中，加入混合提取液20ml，用封口膜将瓶口封住，每个样品做三个重复。在常温下放置于黑暗处浸提至样品完全变白。采用北京普析T6系列紫外可见分光光度计进行测定。使用厚度为1cm的洁净比色皿，第一个位置放盛有混合液的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处，以混合液做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。按以下公式计算叶绿素含量：叶绿素a含量（mg/g）=（12.7D663-2.69D645）V/1000W叶绿素b含量（mg/g）=（22.9D645-4.68D663）V/1000W叶绿素总含量（mg/g）=（20.2D645+8.02D663）V/1000W式中D663、D645、D652分别为相应波长下的光密度值，V为提取液的体积，W为叶片鲜重。9 3.2.3游离脯氨酸（Pro）的测定（1）标准曲线的绘制在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中脯氨酸含量为100μg/ml。取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1、2、3、4、5及6μg/ml。取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，在沸水浴中加热30min，冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液，用移液枪轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。求出吸光度值（Y）依2脯氨酸浓度（X）而变的回归方程：Y=0.0566X-0.0686（R=0.9787），依此回归方程绘制标准曲线。（2）样品测定准确称取抗性马尾松针叶样本各0.5g，分别置大试管中，然后向各管中分别加入5ml3%的磺基水杨酸，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。用移液枪轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于1cm比色皿中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm处比色，求得吸光度值。（3）结果结算从标准曲线上查出2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后按如下公式计算样品中脯氨酸含量的百分数：X×VT单位鲜质量样品的脯氨酸含量（%）=×1006W×Vs×10式中X为从标准曲线查出的2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）；VT为提取液体积（ml）；Vs为测定时取用的样品体积（ml）；W为样品质量（g）。3.2.4植物保护酶的活性测定3.2.4.1超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定（氮蓝四唑光化还原法）（1）试剂的配制①0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）：10 A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液（Na2HPO4）228.75ml，B母液（NaH2PO4）21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。②14.5mM甲硫氨酸（Met）溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。③30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。④60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。⑤2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。酶液制备：取0.2g（可视情况调整）储存于4℃冰箱内的样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。（2）酶活性测定①反应混合液配制（以60个样为准）：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；②分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中③将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。④以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。⑤酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）11 SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30μl）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。3.2.4.2过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）粗酶液制备同SOD。（1）试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4)123ml和B母液(NaH2PO4)877ml混匀即为1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；（2）反应混合液配制（以60个样为准）：取200mlPBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40s）。（边加样边测定，测定前等待5s，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每分钟OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30μl）。3.2.4.3过氧化氢酶（CAT）的活性测定粗酶液制备同SOD。（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液（Na2HPO4）457.5ml和B母液（NaH2PO4）292.5ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。（2）反应液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每分钟OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。12 CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。3.3数据分析与处理本试验的数据统计分析与处理使用MicrosoftExcel、SPSS13.0软件完成。13 4结果与分析4.1接种前后抗性马尾松光合特性变化4.1.1接种前后抗性马尾松光合日变化（1）净光合速率净光合速率是植物生产过程中物质积累与生理代谢的基本过程，也是分析环境因[43][44][45]素影响植物生长和代谢的重要指标。植物的光合作用变化均有律可循，变化[46]曲线呈双峰型或单峰型，单峰型中午的光合速率最高，双峰型上、下午各有一高峰。从图1可以看出，不同抗性的马尾松在7月份净光合速率均呈现出明显的“双峰型”，具有光合“午休”现象，峰值都出现在10点和15点，但H组和M组的第二峰值均高于第一峰值，而L组马尾松的第二峰值低于第一峰值。进入秋季（9月份），H组的第一峰值出现在11点，M组和L组的峰值出现在10点，三组的第二峰值都出现在13点左右，虽然净光合速率的日变化曲线也呈现出“双峰型”，但是其峰值和谷值的差别不大，波动的幅度没有夏季那么明显。11月份，三组抗性马尾松的净光合速率日变化趋势基本呈“单峰型”，最高峰出现在11：00-13:00之间。14 图1不同抗性马尾松不同月份净光合速率日变化Fig.1DiurnalvariationsinphotosyntheticrateofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths（2）气孔导度气孔导度表示植物气孔的开张程度，它不但能反映植物蒸腾耗水的大小，而且是反映植物抗旱性能的重要指标，其大小受光照、温度、湿度、叶片水势、光合有效辐[47]射及体内水分等多种因素制约。7月份气孔导度的变化曲线同净光合速率的日变化一样呈“双峰型”，三组的第一峰值都出现在8：00，且第一峰值都明显高于第二峰值。夏季早晨7:00之前，光照较微弱，光合有效辐射小，随着光照的不断增强，气孔张开，气孔的导度开始增大，7:00以后，随着温度的升高而迅速增大，在8:00时达到了高峰。11:00以后，光照不断增强，蒸腾作用加剧，为维持体内水分平衡，气孔开始关闭，在12:00时进入“午休”状态。下午光强下降，气孔张开，在15:00左右出现第二峰值，但由于此时环境温度还比较高，气孔未完全张开，所以第二峰值要明显低于第一峰值，到18:00左右气孔关闭。秋冬季节（9月份、11月份），3组抗性马尾松的气孔导度日变化曲线基本呈“单峰型”，峰值出现在9:00-10:00，其波动幅度远远小于夏季（见图2）。15 图2不同抗性马尾松不同月份气孔导度日变化Fig.2DiurnalvariationsinstomatalconductanceofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths（3）蒸腾速率蒸腾作用是植物必不可少的生理过程，它的主要生理作用在于降低植物体温，增[47]加水分吸收和矿物质的运输，调节叶面温度等，与植物的净光合速率关系密切。从图3可以看出，3组抗性马尾松在夏季和秋冬季的蒸腾速率日变化明显不同。7月份，呈现明显的“双峰型”曲线，蒸腾作用强烈，从早晨开始就迅速升高，到10:00达到最高峰，到14:00点时蒸腾速率降到最低，经过“午休”之后，在15:00又达到一个高峰值，然后随着光强减弱，蒸腾速率不断降低。在9月份和11月份，蒸腾速率在一天中的变化幅度比7月份要小，在10:00中国达到一个峰值后，便缓慢降低，到16：00时蒸腾作用基本停止。16 图3不同抗性马尾松不同月份蒸腾速率日变化Fig.3DiurnalvariationsintranspirationrateofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths（4）胞间CO2浓度胞间二氧化碳浓度反映了叶片光合作用对二氧化碳的利用情况，在外界二氧化碳浓度不变的情况下，随着光强的增强，胞间二氧化碳浓度值会逐渐减小直至稳定。在最开始的时候减小较快，表明二氧化碳在光合作用开始的时候被固定的速度加快，光[48]强增加到一定程度时，胞间二氧化碳浓度趋于稳定，光合速率变化不大。从图4可以看出，不用月份3组抗性马尾松的胞间CO2浓度日变化曲线大致相同。夏季的17 上午，净光合速率随时间不断增大，与之负相关的胞间CO2浓度则不断减小，当“午休”开始时，胞间CO2浓度则回升，随着净光合速率的进行其又缓慢降低随着净光合速率的减弱又渐趋升高。9月份和11月份的胞间CO2浓度日变化曲线与7月份的大致相同，基本上也是呈先下降再平稳最后缓慢升高的趋势。图4不同抗性马尾松不同月份胞间CO2浓度日变化Fig.4DiurnalvariationsinintercellularCO2concentrationofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonths18 （5）环境因子日变化由表1可见，测定期间的大气温度变化范围在32.49～46.60℃，最高气温出现在中午12:00。空气中的CO2浓度在上午随着温度的升高而降低，在10:00以后稳定在-1390μmol⋅mol左右，而空气的相对湿度变化与温度的变化则相反。叶片表面光合有-2-1效辐射逐渐上升，在10：00达到了最高值，为1575.36μmol⋅m⋅s，随后逐渐降低，-2-1在15:00又升高至1335.49μmol⋅m⋅s，随后又开始下降。环境光合有效辐射从7:00-2-1开始上升11:00达到最大，为1356.44μmol⋅m⋅s，然后逐渐降低，在15:00又上升-2-1-2-1至1282.89μmol⋅m⋅s，到18:00又下降至72.18μmol⋅m⋅s。表1环境因子日变化Table1Diurnalvariationsofenvironmentalfactors时间叶面水气空气温度叶片温度空气CO2空气相对叶片表面光合环境光合有效辐-2-1压亏缺（℃）（℃）浓度湿度（%）有效辐射射（μmol⋅m⋅s）-2-1（Kpa）（μmol⋅m⋅s）7:001.0332.4931.89441.5768.13246.52260.768:001.4535.6935.32408.3157.32489.78450.719:002.2338.6938.48400.7649.71101.471029.1110:003.4642.7742.38393.2539.841575.361351.9111:004.4244.443.98381.7633.771516.231356.4412:005.5746.646.09387.129.781511.251304.4413:003.9143.5842.88390.2334.872588.15565.5314:002.8838.7439.03390.0546.13891.37902.2715:003.541.1241.02392.1839.291335.491282.8916:003.439.8939.57389.4938.15718.98755.3917:003.2738.5938.1391.0540.13309.69423.0418:002.6135.7535.19390.4746.4766.5172.18（4）光合日变化与影响因子的关系植物的光合作用是一个对生理生态因子敏感的复杂的生理过程,生态因子不仅直接影响光合作用,而且还通过影响植物的生理因子进而影响光合作用,各因子之间有着错综复杂的关系。通过相关分析（表2）显示，抗性马尾松净光合速率（Pn）与Ci、Tr、Tair、Tleaf、PARi、PARo的相关性达到了极显著的水平，与RHr呈显著正相关，与Cond、Vpdl、CO2R没有显著的相关性。从相关系数的大小来看，对Pn影响最大的因子是PARo，其次是PARi、Tr、Ci、Tleaf、Tair和RHr。19 表2净光合速率与其影响因子的相关关系矩阵Table2Correlationmatrixofthenetphotosyntheticrateanditsinfluencingfactors因子PnCondCiTrVpdlTairTleafCO2RRHrPARiPARoPn1Cond0.2251Ci0.883**0.1711Tr0.913**0.316-0.793**1Vpdl0.569-0.504-0.839**0.608*1Tair0.751**-0.225-0.890**0.831**0.942**1Tleaf0.783**-0.216-.0914**0.840**0.937**0.998**1CO2R0.5660.450.763**-0.47-0.772**-0.732**-0.746**1RHr0.600*0.4960.850**-0.606*-0.952**-0.914**-0.913**0.899**1PARi0.921**0.172-0.813**0.895**0.628*0.776**0.796**-0.439-0.5631PARo0.939**0.146-.0847**0.884**0.628*0.769**0.794**-0.463-0.579**0.992**1注：*为在0.05水平显著；**为在0.01水平显著为了进一步研究净光合速率（Pn）与影响因子的关系，又进行了通径分析，以进一步揭示各因子对Pn的相对重要性，结果见表3。从直接作用的绝对值大小看，对Pn影响最大的因子是Tair，影响较大的几个因子是Tr、Vpdl和Tleaf，但是与Pn的相关性却不显著，而影响因子RHr、PARi、PARo的直接作用绝对值虽然比较小，却与Pn有着显著的相关性。表3净光合速率与其影响因子的通径系数Table3Pathcoefficientsbetweennetphotosyntheticrateanditsinfluencingfactors间接通径系数影响直接通因子径系数CondCiTrVpdlTairTleafCO2RRHrPARiPARoCond-0.014-0.0450.1710.2651.2320.128-0.4790.225-0.150-1.110Ci-0.261-0.002-0.4310.4424.8680.217-0.821-1.0620.871-4.7034.319Tr0.543-0.0040.207-0.320-4.543-0.1330.5851.169-0.9094.818Vpdl-0.5270.0070.2190.330-5.153-0.2200.9190.819-0.6465.133Tair-5.4700.0030.2330.451-0.496-0.2080.8831.013-0.791Tleaf5.1440.0030.2390.456-0.493-5.459-0.2120.8811.040-0.816-3.837CO2R0.284-0.006-0.200-0.2550.4074.004-0.868-0.5730.477-4.695RHr-0.965*-0.007-0.222-0.3290.5015.0010.255-0.7350.5954.095PARi1.306*-0.0020.2130.486-0.331-4.244-0.1250.543-1.0204.083PARo-1.028*-0.0020.2210.480-0.331-4.207-0.1320.5591.296注：*为在0.05水平显著20 结合表2和表3分析：（1）PARo和PARi与Pn的相关系数最大，且达到了极显著的水平，直接通径系数也达到了显著的水平，这说明光合有效辐射通过其他因子的间接效应较小，也说明了夏季影响抗性马尾松光合速率日变化的最主要因子是光照强度，其次的影响因子是空气的相对湿度（RHr）（2）Ci、Tr、Tair和Tleaf虽然与Pn的相关关系极显著，但直接通径系数却不显著，说明这几个因子通过其他因子对Pn产生影响的间接效应较大，表2中这几个因子与其他因子均呈现极显著的相关关系也可以说明这一点；（3）Cond、Vpdl、CO2R与Pn的相关性比较弱，直接通径系数也不高，且未达到显著水平，说明不管是这几个因子本身，还是通过间接效应对Pn的影响都不大。4.1.2接种前后抗性马尾松光响应曲线拟合植物光合作用的光响应曲线描述的是光量子通量密度与植物净光合速率之间的[49]关系。光响应曲线对于研究植物光合作用十分有用，通过光响应曲线可以得到最大[50][51][52]净光合速率、光补偿点、暗呼吸速率、表观量子效率等光合生理参数。3组抗性马尾松不同月份光响应曲线见图5。由图5可知，在光照强度极弱时，不同抗性强度的马尾松在不同月份的叶片光合速率都低于呼吸速率，Pn为负值；当光合速率等于呼吸速率时，这时的光照强度称为光补偿点，之后随着PAR的增强，光合速率也随之变快，达到一定光强后就趋于平缓。在7月份，三种不同抗性强度的马尾松在光-2-1合诱导期，即PAR在0～400μmol⋅m⋅s时，Pn几乎成线性增长，随着光照强度的进一步增强，Pn的增长变缓，这一趋势抗性强的马尾松表现的更为明显，而抗性中和抗性弱的马尾松增长的比较缓慢，而且它们的光补偿点均比抗性强的马尾松光补偿点要高。在9月份和11月份，3种抗性马尾松的Pn随PAR的增强增加的幅度都比较缓慢，H组的光补偿点在不同月份基本一致，而M组和L组的都比7月份时低。21 图5接种前后不同抗性马尾松不同月份光响应曲线Fig.5LightresponsecurvesforthedifferentPWD-resistentMasoonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation将所测得的Pn与PAR的成对值进行二项式回归分析，再将PAR在200-2-1μmol⋅m⋅s以下的Pn和PAR的成对值进行直线回归分析，所得的二项式回归方程和直线回归方程见表4（y表示Pn，x表示PAR）。当PAR=0时得出暗呼吸速率（Rd），Pn=0的PAR值为光补偿点（LCP），Pn=Pmax时的PAR值为光饱和点（LSP），直线回归方程的斜率极为表观量子效率（AQY），通过计算得出的光合特征参数LCP、LSP、Pmax、Rd、AQY值见表5。22 表4接种前后不同抗性马尾松不同月份光响应的拟合模型Table4RegressionmodelsforthelightresponsecurvesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation不同抗性时间二项式回归方程直线回归方程2227月y=-9E-07x+0.0025x+3.2747(R=0.9233)y=0.0322x-2.9957(R=0.983)222H组9月y=-1E-07x+0.0012x+0.4125(R=0.9537)y=0.0072x-0.6163(R=0.9089)22211月y=-4E-07x+0.0015x-0.0925(R=0.9905)y=0.0036x-0.42(R=0.8285)2227月y=-5E-07x+0.0027x+1.1716(R=0.948)y=0.028x-3.8613(R=0.9738)222M组9月y=-5E-07x+0.0024x+0.1127(R=0.9963)y=0.0079x-0.6783(R=0.8639)22211月y=-5E-07x+0.002x-0.1237(R=0.9485)y=0.0096x-1.2699(R=0.9659)2227月y=-5E-07x+0.0019x+2.2345(R=0.8639)y=0.0335x-4.4557(R=0.9881)222L组9月y=-4E-07x+0.0017x+0.2446(R=0.996)y=0.0074x-0.7039(R=0.9433)22211月y=-3E-07x+0.0013x+0.0991(R=0.99)y=0.0085x-1.0544(R=0.8965)表5接种前后不同抗性马尾松不同月份光响应曲线的特征参数Table5CharacteristicparametersofthelightresponsecurvesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculationAQY/LSP/LCP/Rd/Pmax/不同抗性时间22222μmolCO2/(m⋅s)μmol/(m⋅s)μmol/(m⋅s)μmolCO2/(m⋅s)μmol/(m⋅s)7月0.0322138993.033.27475.019月0.0072250085.590.41254.01H组11月0.00361875116.67-0.09251.317月0.0282700137.901.17164.829月0.0079240085.860.11272.99M组11月0.00962000132.28-0.12371.887月0.03351900133.012.23454.04L组9月0.0074212595.120.24462.0511月0.00852167124.040.09911.51表观量子效率反映叶片在低光合有效辐射下进行光合作用的光化学效率，可以表明植物利用弱光能力的强弱。表5中的AQY值显示7月份利用弱光的能力都强于9月和11月，但总体上利用弱光的能力都比较弱，而且在同一时间，不同抗性的马尾松在利用弱光的能力上没有显著差异。光补偿点的数据均较高，也说明了不同抗性的马尾松利用弱光的能力较差。不同抗性的马尾松，7月份和11月份的LCP值均高于23 9月份的，而在7月份，H组的马尾松LCP值明显比M组和L组的要低，在9月份和11月份，三组的LCP值则差异不显著。光饱和点LSP的值以M组7月份的最高，-2-1-2-1达到了2700μmol⋅m⋅s，最低值出现在H组7月份时，为1389μmol⋅m⋅s。不同抗性的马尾松光补偿点和光饱和点均较高，表明它们对高光强有很高的适应性，是明[53][54]显的阳生植物。暗呼吸速率主要受植物生长状态和温度影响，不同抗性的马尾松均在7月份Rd值最高，9月份次之，11月份最低。Pmax反应的抗性马尾松具有的最大光合潜力，不同抗性马尾松的Pmax均以7月份值最高，进入9月份、11月份依次降低，而在同一时间，不同抗性马尾松的Pmax值差异不显著。4.1.3接种前后抗性马尾松叶绿素荧光特性变化叶绿素荧光分析技术是一种以光合作用理论为基础、利用体内叶绿素作为天然探针，研究和探测植物光合生理状态及各种外界因子对其细微影响的新型植物活体测定和诊断技术。其在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具[55]有反映“内在性”特点。叶绿素荧光动力学方法可以快速、灵敏、无损伤探测逆境胁迫对植物光合作用的影响。（1）抗性马尾松接种前后针叶F0、Fm、Fv等参数的变化从图6可以看出，在暗适应和光适应下，不同抗性的马尾松在接种松材线虫前后F0、Fm、Fv表现出基本一致的变化规律，即在接种前后值均先下降再升高。F0为初始荧光产量，是光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心处于完全开放时的荧光产量，代表不参与PSⅡ光合反应的光能辐射部分，与叶绿素的浓度有关，由叶绿素a发射，它反映类囊体膜结构的变化，可以用来表示逆境对植物叶片PSⅡ的永久性伤害。接种后F0下降可能与马尾松苗木感病后为了保护反应中心受光氧化破坏而增加了热耗散有关，表明针叶类囊体膜遭到了破坏，11月份F0又上升，表明PSⅡ反应中心出现了不可逆破坏或可逆失活。Fm为叶片经过完全暗适应后测得的最大荧光产量，是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，反映了PSⅡ的电子传递情况，它的大小与PSⅡ原初电子受体QA的氧化还原状态有关。在接种后Fm下降说明感病后不同抗性马尾松的光合反应中心均有不同程度的破坏，11月份又有所上升说明光合作用中心开始修复。Fv=Fm-F0,为可变荧光，表示可参与PSⅡ光合化学反应的光能部分，反映了QA的还原情况，可以作为PSⅡ光化学反应中心活性大小的相对指标。接种后Fv先下降后升高表明PSⅡ光化学反应中心活性在受到抑制之后又开始逐渐恢复。通过方差分析发现，同一时间测定的不同抗性马尾松之间的F0、Fm、Fv差异均不显著，说明马尾松抗性的强弱对F0、Fm、Fv的影响不明显。不同抗性马尾松的F0、Fm、Fv在接种前后的差异性不完全相同。H组马尾松的F0在接种前后表现出极显著24 差异，7月份极显著高于9月份和11月份，9月份和11月份差异不显著；M组马尾松的F0在接种前的7月份极显著高于接种后的9月份，与11份的差异不显著，L组的F0表现与M组相同，这说明线虫的接种对马尾松的光合生理产生了显著的影响，H组和M组的Fm、Fv值在接种前后均差异不显著，而L组的这两个值则表现出极显著的差异。图6接种前后不同抗性强度马尾松针叶F0、Fm、Fv的变化Fig.6ChangesofFo,FmandFvofneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation注：小写字母相同表示在p<0.01水平上不同抗性强度的马尾松在接种前后差异不显著，不同为差异极显著。‘’（2）抗性马尾松接种前后针叶Fv/Fm、Fv/F0、Fv/Fm等参数的变化Fv/Fm是PSⅡ最大光化学量子产量，与光合作用过程中光反应电子传递有关，反映PSⅡ反应中心最大的光能转换效率和利用率；Fv/F0表示PSⅡ的潜在活性，光抑制‘’时这一参数变化明显，它是表示光抑制程度的良好指标和探针；Fv/Fm为PSⅡ有效光化学量子产量，它反映开放的PSⅡ反应中心原初光能捕获效率。从图7可以看出，H组和M组马尾松在接种松材线虫后Fv/Fm值都有所升高，但幅度并不大，差异性不显著（P>0.05）,这说明接种后H组和M组的PSⅡ原初光能转换效率并没有受到大的影响。L组的Fv/Fm有所下降，且差异性极显著（P<0.01）,说明抗性弱的马尾松在接种线虫后PSⅡ活性中心收到了伤害，光合原初反应过程受到了抑制，光合电子由PSⅡ反应中心向QA、QB及PQ库传递过程受到影响，不利于激发天线色素蛋白复合体向PSⅡ传递。三组的Fv/F0和Fv′/Fm′在接种后表现出一致的变化，均先升高后降低。H组和M组的Fv/F0值升高幅度不大，接种前后的差异不显著（P>0.05），说明线虫的接种对抗性较强的马尾松PSⅡ的潜在活性影响不大。L组9月份的Fv/F0值与7月份、11月份的差异不显著（P>0.05），11月份与7月份却有极显著差异（P<0.01），说明抗性弱的马尾松在接种前期PSⅡ的潜在活性没有受到影响，随着感病程度的加深，PSⅡ的潜在活性中心出现了受损，抑制了光合作用的原25 ‘’初反应，光合电子传递过程受到影响。H组9月份的Fv/Fm值与7月份的差异极显著（P<0.01），与11月份的差异不显著（P>0.05），7月份与11月份的差异也不显著（P>0.05），M组9月份与7月份差异不显著（P>0.05），与11月份差异极显著（P<0.01），7月份与11月份差异也极显著（P<0.01），L组的9月份与7月份、11月份差异显著（P<0.05），7月份和11月份差异不显著（P>0.05），由此可知不同抗性强度的马尾松在接种线虫后PSⅡ反应中心原初光能捕获效率都受到了影响。图7接种前后不同抗性强度马尾松针叶Fv/Fm、Fv/F0、Fv′/Fm′的变化Fig.7ChangesofFv/Fm,Fv/FoandFv'/Fm'ofneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation注：小写字母相同表示在p<0.01水平上不同抗性强度的马尾松在接种前后差异不显著，不同为差异极显著。大写字母表示在p<0.05水平上不同抗性强度的马尾松在接种前后差异不显著，不同为差异显著。（3）抗性马尾松接种前后针叶qP、qN、ETR等参数的变化qP是光化学猝灭系数，反映的是PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学传递的份－额，在一定程度上反应了PSⅡ的开放程度，qP愈大，QＡ重新氧化形成ＱＡ的量愈大，即PSⅡ的电子传递活性越大；qN表示非光化学猝灭，反映的是PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分；ETR表示电子传递速率。26 图8接种前后不同抗性强度马尾松针叶qP、qN、ETR的变化Fig.8ChangesofqP,qNandETRofneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesindifferentmonthsbeforeandaftertheinoculation注：小写字母相同表示在p<0.01水平上不同抗性强度的马尾松在接种前后差异不显著，不同为差异极显著。大写字母表示在p<0.05水平上不同抗性强度的马尾松在接种前后差异不显著，不同为差异显著。从图8可以看出，H组的qP值在接种后出现了下降，9月份与7月份的差异显著（P<0.05），与11月份的差异不显著（P>0.05），11月份与7月份差异也不显著（P>0.05）；M组的qP值在接种后也出现了下降，9月份、11月份与7月份的差异极显著（P<0.01），9月份与11月份差异不显著（P>0.05）；L组的qP值在接种后略有上升，但接种前后的差异均不显著，由此得出，接种线虫会对抗性较强的马尾松的PSⅡ的活性反应中心造成一定的损伤，PSⅡ开放的反应中心比例和参与CO2固定的电子减少，这种比例的减弱必然会使光合电子传递能力减弱，叶片暗反应受阻，光合效能下降，对抗性较弱的马尾松来说接种线虫对PSⅡ的电子传递活性影响不大。接种线虫后，三组马尾松的qN值均下降，但差异性都不显著（P>0.05），这说明接种线虫对马尾松针叶叶片非光化学猝灭和热耗散方式的耗散作用没有影响。H组和M组9月份的ETR值与7月份的有极显著差异（P<0.01），与11份差异不显著（P>0.05），11月份与7月份差异也不显著（P>0.05），L组9月份与7月份差异显著（P<0.05），与11月份差异不显著（P>0.05），11月份与7月份差异也不显著（P>0.05），由此可知，接种线虫对不同抗性马尾松的电子传递速率均有影响。27 4.2接种前后抗性马尾松的叶绿素含量变化叶绿素是绿色植物进行光合作用的核心物质。从图9中可以看出，接种前后不同抗性马尾松的叶绿素含量是有变化的，且抗性中的叶绿素含量高于抗性强和抗性弱的，抗性弱的次之，但不存在明显的差异性。在接种前的7月份和接种后的9月份、11月份，不同抗性强度叶绿素a的含量变化不明显（图9A），但方差分析表明不同的抗性强度对叶绿素a含量的变化影响显著（F=4.102，P<0.05），抗性强与抗性中的马尾松叶绿素a含量差异显著，抗性强与抗性弱以及抗性中与抗性弱的差异均不显著。对于叶绿素b的含量来说，接种前后，不同抗性马尾松的叶绿素b含量变化不大（图9B），方差分析也表明接种前后不同抗性强度的马尾松对其的影响均不显著。图9接种前后不同抗性强度马尾松叶绿素含量的变化Fig.9ChangesofchlorophyllcontentsinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation接种前后都是抗性中的马尾松叶绿素a+b的含量最高，抗性弱的次之，抗性强的最低（图9C），且接种前后的变化不明显，但通过方差分析，不同的抗性对马尾松叶绿素a+b含量的影响是显著的（F=3.404,P<0.05），抗性强的与抗性中的差异显著，抗性强与抗性弱以及抗性中与抗性弱的差异不显著。接种前的7月份，叶绿素a/b的含量抗性强的最高，抗性中的次之，抗性弱的最低，接种后的抗性中的最高，抗性强的次之，抗性弱的最低（图9D），方差分析表明，不同抗性的马尾松对叶绿素a/b的含量的影响是显著的（F=5.581,P<0.05），抗性中与抗性弱的差异显著，抗性中与抗性强及抗性弱与抗性强的差异均不显著。通过以上分析得出，接种松材线虫对叶绿素含量的影响不明显，但是不同的抗性28 强度对马尾松叶绿素a、a+b、a/b的含量的影响显著，对叶绿素b的影响不显著。4.3接种前后抗性马尾松的脯氨酸含量变化脯氨酸是植物蛋白质组成之一，以游离状态广泛存在于植物体内。脯氨酸是植物体内一种渗透调节物质，逆境条件下其含量会发生很明显的变化，这种变化被认为是植物对环境的一种适应，通过其含量的增加可维持细胞的膨压，同时保护酶和膜系统免受伤害，从而增强植物的抗逆性。本研究测定接种前后不同抗性的马尾松针叶内游离脯氨酸含量的变化情况见图10。图10接种前后不同抗性强度马尾松针叶内脯氨酸的含量变化Fig.10ChenagesoffreeprolineconcentrationsinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation从图10可以看出：在接种松材线虫后，不同抗性强度的马尾松针叶内脯氨酸的含量都具有明显的增长趋势，而且变幅较大，9月份抗性强的较接种前平均增幅为134.67%，抗性中的平均增幅为158.86%，抗性弱的平均增幅为75.7%；11月份，抗性强的平均增幅降至66.91%，抗性中的降至72.38%，抗性弱的降至55.02%。这可以看出，脯氨酸作为植物正常生长代谢的产物也是不断积累的，但在胁迫环境下表现活跃，但这种积累随着时间的推移出现下降，这可能是由于接种线虫较长时间后树体产生一定的适应性使得胁迫减弱造成的。从方差分析可以看出（表6），不同抗性强度、不同月份之间脯氨酸含量差异达到极显著。多重比较（表7）结果表明，不同抗性强度的马尾松针叶内脯氨酸的含量差异达到显著水平，但并没有呈现正相关和负相关，而是抗性中等的含量最高，抗性强的次之，抗性弱的最低；不同月份，接种前脯氨酸的含量最低，接种后2个月最高，接种后4个月又降低，但仍高于接种前，而且这三者间存在着显著的差异，这说明抗29 性马尾松针叶内脯氨酸含量与松材线虫接种与否有着显著的相关性。表6接种前后不同抗性强度马尾松针叶内脯氨酸含量变化的方差分析Table6VarianceanalysisresultforfreeprolinecontentinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation变异来源自由度df平方和SS均方MSF值P值抗性强度20.0260.013610.658**0.000不同月份20.3350.1677989.436**0.000抗性强度×不同月份40.0300.008363.524**0.000误差180.0002.09E-005总变异273.898注：*，p<0.05;**,p<0.01表7接种前后不同抗性强度马尾松针叶内脯氨酸含量变化的多重比较Table7MultiplecomparisonforfreeprolinecontentinneedlesofthedifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation不同抗性强度平均值不同月份平均值H组0.3708B7月份0.2214CM组0.3917A9月份0.4939AL组0.3186C11月份0.3659B注：不同字母表示不同抗性强度、不同月份脯氨酸含量在0.05水平上存在显著差异30 4.4接种前后抗性马尾松保护性酶的含量变化植物在逆境条件下保护酶系统的变化已广泛应用于植物对逆境的反应机理的研[56]究。SOD、POD和CAT等酶类是细胞抵御活性氧伤害的重要保护酶系统，它们在清除超氧自由基、过氧化物和过氧化氢以及阻止或减少羟基自由基形成等方面起着重要作用。从图11中可以看出接种前不同抗性的马尾松之间SOD活性差别不大，接种后随着松材线虫病的侵染，三组马尾松的酶活都升高，但H组的升高幅度高于M组和L组；三组POD的活性在接种前是M组高于H组和L组，接种后都有所升高，但升高幅度都不大，不同抗性之间也没有明显的差异。接种前，H组马尾松的CAT活性最高，L组的次之，M组最低，接种后，H组的活性升高幅度很小下降的幅度却最大，L组的升高幅度最大下降的幅度却最小。总体上看，三种保护性酶的活性在接种后都表现出先上升后下降的趋势，这说明松材线虫的侵入诱导了酶活性的提高，由于马尾松的抗性病害由发病盛期进入发病休止期，三种保护性酶的活性也随之减缓而降低。图11接种前后不同抗性强度马尾松针叶内保护酶的活性变化Fig.11ChangesofprotectiveenzymeactivityinneedlesofdifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation对SOD、POD和CAT三种保护酶活性变化值进行方差分析（见表8），得出：SOD酶活性在不同的月份差异极显著（p<0.01），不同抗性马尾松之间同一测定时间SOD酶活性差异不大；POD酶活性在不同的抗性马尾松之间、不同的测定月份差异都极显著，而CAT酶活性则只是在不同的抗性马尾松之间差异显著（P<0.05）。31 表8接种前后不同抗性强度马尾松针叶内保护酶活性变化的方差分析Table8VarianceanalysisresultoftheprotectiveenzymeactivityinneedlesofdifferentPWD-resistentMassonpinesbeforeandaftertheinoculation项目变异来源自由度df平方和SS均方MSF值P值不同抗性211295.5625647.7811.7830.197**SOD不同月份2101784.19950892.10016.0630.000酶活性不同抗性*不同月份44866.5551216.6390.3840.817误差1857030.5723168.365总计275359803.114**POD不同抗性262293.7431146.86816.8740.000**酶活性不同月份235308.2517654.1269.5640.001不同抗性*不同月份41333.77333.4420.1810.945误差1833224.621845.812总计274062113.97*CAT不同抗性21756170.89878085.4443.9150.039酶活性不同月份295509.5647754.7780.2130.810不同抗性*不同月份4112032.8928008.2220.2150.972误差184037068.67224281.593总计2723094089.00注：*，p<0.05;**,p<0.015讨论与结论5.1讨论5.1.1接种前后抗性马尾松光合日变化光合作用是绿色植物一个及极其复杂的生物物理和生物化学反应，受到许多环境[57]因素的制约。植物的自身因素如叶绿素含量、叶片厚度、成熟程度等与叶片光合效率密切相关,同时又受外界因子如光照强度、气温、空气相对湿度、土壤含水量等的[58]影响。植物光合作用日变化是各种生理生态因子综合效应的最终反映，其结果可作[59]为分析产量限制因素的重要依据。抗性马尾松阳面针叶在空气温度高，相对湿度小而阳光充足的夏季晴天，其光合速率日变化呈现一条双峰曲线，上、下午各有一个高[60]峰，中午有一个谷底，出现了明显的光合“午休”现象。许大全提出，气孔的部分关闭引起的气孔限制和叶肉细胞自身活性下降引起的非气孔限制是造成植物叶片光合速率午间降低的两类自身因素，前者降低了胞间CO2浓度，而后者则使胞间CO2浓度增高，当这两种因素同时存在时，胞间CO2浓度变化的方向取决于占优势的那个因素。抗性马尾松阳面针叶净光合速率午间降低，胞间CO2浓度升高，表明净光合速率午间降低不是由于气孔阻力的增大而引起叶肉细胞间CO2亏缺造成的，而是32 [61]非气孔限制起着主要作用。这一结果与张如华的研究相似，说明通过人工接种松材线虫测定选择出的高抗性马尾松无性系，其基本的生理功能与普通马尾松并没有明显的区别，没有因为接种了线虫而发生明显的改变。通过对相关系数和通径分析表明，在夏季直接决定抗性马尾松净光合速率日变化的主要因子是光合有效辐射和空气相对湿度。光对光合作用主要有三个方面的作用[62]：提供同化力形成所需要的能量；活化光合作用的关键酶和促使气孔开放；调节光合机构的发育。当光照不足时，不仅会因同化力的短缺而限制光合碳同化，而且还会由于光合作用关键酶没有充分活化而限制光合作用的运转。光能不足可以成为光合作用的限制因素，光能过剩也会对光合作用产生不利的影响。光合有效辐射是植物光合作用能量的最终来源，也是影响光合作用生态生理因子的最根本因素。尽管抗性马尾松的光合“午休”降低了净光合速率与光合有效辐射的相关性，但光合有效辐射仍然是净光合速率的主要影响因子。5.1.2接种前后抗性马尾松光响应曲线拟合光是影响植物生长发育和生存的最重要环境因子之一，也是影响光合作用生理生[63]态因子的最根本因素。目前高光效育种领域已成为育种学家共同关注的研究对象[64][65][66]。前人研究植物光合作用的光响应曲线，认为有些植物光合速率随光强增加而增高，达到最高点之后，若继续增大光强，光合效率反而下降；另有一些植物光合速率随光强增加而增高，达到最高点之后，光强继续加大，光合速率虽不再提高而是[67]在较大的光强范围内保持平稳。本试验通过对不同抗性的马尾松无性系在接种松材线虫前后的光响应曲线进行对比发现，在7月份，三种不同抗性强度的马尾松在光合诱导期，Pn几乎成线性增长，随着光照强度的进一步增强，Pn的增长变缓，这一趋势抗性强的马尾松表现的更为明显，而抗性中和抗性弱的马尾松增长的比较缓慢，而且它们的光补偿点均比抗性强的马尾松光补偿点要高。在9月份和11月份，3种抗性马尾松的Pn随PAR的增强增加的幅度都比较缓慢，H组的光补偿点在不同月份基本一致，而M组和L组的都比7月份时低，这可能是在光照不充分的环境下出现植物为了更好的利用光能而出现的一种适应性。表观量子效率（AQY）是显示植物利用[68]弱光能力的一项重要指标，其值越大表明植物利用弱光的能力越强。不同抗性的马尾松在7月份利用弱光的能力都比较差，而且在同一时间，不同抗性的马尾松在利用弱光的能力上没有显著差异，光补偿点较高也说明了这一点。不同抗性的马尾松光补偿点和光饱和点均较高，表明它们对高光强有很强的适应能力，是明显的阳生植物。5.1.3接种前后抗性马尾松叶绿素荧光特性变化光合作用是在叶绿体中进行的，叶绿素是叶绿体内的一种光合色素，直接参与光33 合作用中光能的吸收、传递、分配和转化等过程。逆境胁迫对植物光合作用产生多方面的影响，不仅直接损伤植物的光合器官，同时也阻碍挥发性化合物的合成。因为光合作用中各种反应与植物体内叶绿素a荧光密切相关，所以各种逆境因子可以通过体内叶绿素a荧光诱导动力学曲线以及其导出的测定参数来反映对植物光合作用的影[69]响。目前国内许多学者在利用叶绿素荧光动力学技术评价作物的耐光、耐高低温，耐干旱水湿，耐盐碱等逆境胁迫下的特性方面取得了初步的成功，但对于病虫害对植[70]物造成的影响研究较少。梁海永等的研究认为NaCl胁迫降低了欧洲黑杨组培植株叶片的Fv/F0，Fv/Fm值，降低了光化学猝灭系数qP，提高了非光化学猝灭系数qN，[71]从而影响了植物的生长和有机物质的合成。陈建明研究了不同品种遭受褐飞虱危害后叶片的叶绿素荧光动力学，认为得到的各种参数值可以作为评价植物耐虫性的指[72]标。李晓莺等认为抗蚜虫基因对枸杞植株的光和生理变化没有相关性，仅有一株叶片叶绿素含量发生了变化。植株的光合性能在受到病原物的入侵危害可以发生明显的[73][74]改变。本试验结果表明：马尾松抗性的强弱对F0、Fm、Fv的影响不明显，不同抗性马尾松的F0、Fm、Fv在接种前后的差异性不完全相同。H组马尾松的F0在接种前后表现出极显著差异，7月份极显著高于9月份和11月份，9月份和11月份差异不显著；M组马尾松的F0在接种前的7月份极显著高于接种后的9月份，与11份的差异不显著，L组的F0表现与M组相同，这说明线虫的接种对马尾松的光合生理产生了显著的影响，9月份测得的F0值可能是评价马尾松是否感染松材线虫的一个理想生理指标。H组和M组的Fm、Fv值在接种前后均差异不显著，而L组的这两个值则表现出极显著的差异，这说明抗性弱的马尾松可能对于接种松材线虫的反应更敏感；H组和M组马尾松在接种松材线虫后Fv/Fm值变化幅度不大，这说明接种后H组和M组的PSⅡ原初光能转换效率并没有受到大的影响。L组的Fv/Fm则下降极显著,说明抗性弱的马尾松在接种线虫后PSⅡ活性中心受到了伤害，光合原初反应过程被抑制，影响了光合电子由PSⅡ反应中心向QA、QB及PQ库的传递过程，阻碍了激发天线色素蛋白复合体向PSⅡ的传递。H组和M组的Fv/F0值升高幅度不大说明线虫的接种对抗性较强的马尾松PSⅡ的潜在活性影响不大。L组7月份的Fv/F0值与11月份的差异显著，说明抗性弱的马尾松在接种前期PSⅡ的潜在活性没有受到影响，随着感病程度的加深，损害了PSⅡ的潜在活性中心，使光合作用的原初反应受到了抑制，‘’影响了光合电子传递过程。三组的Fv/Fm值的变化则表明不同抗性强度的马尾松在接种线虫后PSⅡ反应中心原初光能捕获效率都受到了影响；通过对三组qP值分析得出，接种线虫会对抗性较强的马尾松的PSⅡ的活性反应中心造成一定的损伤，PSⅡ开放的反应中心比例和参与CO2固定的电子减少必然会使光合电子传递能力减弱，阻碍了叶片的暗反应过程，使得光合效能下降，对抗性较弱的马尾松来说接种线虫对34 PSⅡ的电子传递活性影响不大。三组马尾松的qN值均下降程度均不显著，这说明接种线虫对马尾松针叶叶片非光化学猝灭和热耗散方式的耗散作用没有影响。而三组ETR值的显著变化则表明接种线虫对不同抗性马尾松的电子传递速率均有影响。5.1.4接种前后抗性马尾松叶绿素含量变化绿色植物是通过叶绿素对光能进行吸收的，因此叶绿素的含量对光合能力的大小有着直接的影响。本试验表明接种松材线虫对叶绿素含量的影响不明显，但不同抗性之间的马尾松叶绿素a、a+b、a/b的含量差异显著，叶绿素b的含量差异不显著。5.1.5接种前后抗性马尾松脯氨酸含量与保护性酶活性变化脯氨酸是水溶性最大的一种氨基酸，许多植物在受到逆境胁迫时都表现出高水平的脯氨酸积累，植物的脯氨酸合成、累积及代谢是一种受细胞内脯氨酸浓度调控的生[75]理生化过程，因此脯氨酸累积可能是植物受到某种胁迫的一种信号。本试验表明不同抗性强度的马尾松针叶内脯氨酸的含量差异达到显著水平，但并没有呈现正相关和负相关，而是抗性中等的含量最高，抗性强的次之，抗性弱的最低；不同月份，接种前脯氨酸的含量最低，接种后2个月最高，接种后4个月又降低，但仍高于接种前，而且这三者间存在着显著的差异，这说明抗性马尾松针叶内脯氨酸含量与松材线虫接种与否有着显著的相关性。正常状态下，自由基在生物体内的产生和清除处于平衡状态。生物体内保持低浓[76]度的自由基不但不会对生物体引起损伤，而且还能显示独特的生理作用。但是在逆境胁迫的情况下，生物体内会积累大量的自由基，致使膜脂过氧化水平高，增加了膜的透性，膜结构及功能受到破坏，最终引起生物体伤害，而活性氧系统3个主要酶SOD、POD和CAT能有效抑制活性氧自由基对机体的伤害，使细胞内保持正常水平的自由基，降低自由基对生物体造成的毒害，提高了生物抗逆能力。本试验表明三种保护性酶的活性在接种后都表现出先上升后下降的趋势，这说明松材线虫的侵入诱导了酶活性的提高，由于马尾松的抗性病害由发病盛期进入发病休止期，三种保护性酶的活性也随之减缓而降低。接种松材线虫对SOD和POD酶的活性产生了显著的影响，对CAT酶活性的影响不显著，但不同抗性强度之间的CAT酶活性差异显著。5.2结论本试验通过对抗性马尾松接种松材线虫前后的一些生理生化指标进行测定分析，得出以下结论：（1）不同抗性的马尾松在接种前的7月份，净光合速率（Pn）、气孔导度（Cond）、和蒸腾速率（Tr）呈现明显的双峰型，具有明显的“午休”现象，决定Pn日变化的35 主要因子是光合有效辐射和空气相对湿度。接种后的9月份，11月份，Pn的双峰型不明显，Cond和Tr则为单峰型。胞间CO2浓度在接种前后总体上都是呈现先下降后升高的趋势。（2）不同抗性马尾松的光饱和点（LSP）与光补偿点（LCP）在接种前后都较高，说明它们对高光强有很强的适应性，是明显的阳生植物，在夏季具有最大的光合潜力。（3）不同抗性的马尾松在接种前后，叶绿素荧光参数的变化不同：抗性强、抗‘’性中和抗性弱的马尾松，其F0、Fv/Fm和ETR值都有显著差异，说明接种松材线虫对初始荧光、有效光化学量子产量和电子传递速率有影响，这三个值可能是评价马尾松是否感染松材线虫的理想生理指标。（4）接种松材线虫对叶绿素含量的影响不明显，但不同抗性之间的马尾松叶绿素a、a+b、a/b的含量差异显著，叶绿素b的含量差异不显著。（5）不同抗性强度的马尾松针叶内脯氨酸的含量差异达到显著水平，但并没有呈现正相关和负相关，而是抗性中等的含量最高，抗性强的次之，抗性弱的最低；接种前后不同抗性马尾松的脯氨酸含量差异显著，接种松材线虫对脯氨酸含量有显著影响。（6）不同抗性的马尾松之间SOD和POD酶活性差异不显著，CAT酶活性差异显著；接种松材线虫对SOD和POD酶的活性产生了显著的影响，对CAT酶活性的影响不显著。36 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致谢行文至此，心情非常激动，我的论文终于写完了。感谢我的导师徐小牛先生。徐老师素来以知识渊博、治学严谨著称，能投徐老师门下是我此生的荣幸。读研期间，虽然由于在职不能经常与徐老师经常接触，但他实事求是的工作作风、诲人不倦的高尚师德、平易朴实的人格魅力还是深深影响了我。由于种种原因，我延迟了毕业，徐老师给予我的始终是理解、宽容和鼓励，对此我非常感动。走出校门我不是徐老师最骄傲的学生，但不管走到哪里我都会骄傲的说我是徐小牛老师的学生。感谢我的另一位导师徐六一先生。进入安徽省林科院工作，最大的幸运就是认识了徐六一所长，他不仅是我的领导更是我的人生导师。他雷厉风行的工作作风、精益求精的工作态度、爽朗直接的性格让我懂得工作要踏踏实实、学习要认认真真、做人要勤勤恳恳。特别在读研期间，有了徐所长的支持，我才能平衡好工作和学习的关系，对此我深表感激。感谢我的同学崔珺、张萌新、张弛等在学校给予我的帮助，感谢我的同事郝焰平、姜春武等在工作上给予我的支持。感谢我的老公童洋先生在生活上对我的照顾、学习上对我的帮助、工作上对我支持，还要谢谢我的儿子童卿宇小朋友，是他让我的生活洒满阳光，让我充满力量不断前进。最后祝愿自己顺利毕业！41 作者简介陈雪莲，女，1984年6月出生于安徽省凤台县。2006年7月毕业于淮南师范学院化学生物系。2007年11月份至今工作于安徽省林业科学研究院，2011年9月-2013年7月期间于安徽农业大学林学与园林学院攻读林业硕士。42
