罗非鱼源无乳链球菌rovs转录调节因子缺失突变株的构建及其功能分析

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1、分类号：Q786密级：公开UDC：575学号：2111201128硕士学位论文罗非鱼源无乳链球菌RovS转录调节因子缺失突变株的构建及其功能分析熊海燕M..、、、指导教师：简纪常教授串请学位类别：农学硕士专业名称：水产养殖研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制学院名称：水产学院中国•湛江2015年6月学位论文答辩委员会组成主席：委员：导师：时间：2015年5月31日学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本

2、文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名:愈、魏MM年6月J曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在_____年解密后适用本授权书。2、不保密0。(请在以上相应方框内打“V”）Mi-年((月？曰W年6月f

3、B罗非鱼源无乳链球菌RovS转录调节因子缺失突变株的构建及其功能分析摘要无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）是唯一拥有B群特异性抗原的链球菌，也是一种人畜共患、传染性极强的的病原菌。近年来，由无乳链球菌感染罗非鱼引起的链球菌病，由于其发病快，死亡率高，且疾病一旦爆发很难控制，使其严重危害罗非鱼养殖业的健康发展，并给全球罗非鱼的养殖业带来了巨大的经济损失。RovS转录调节因子属于Rgg家族，是无乳链球菌中一个重要的调节因子，能够在转录上调控细菌基因组中多个基因的表达，同时还能够与细菌中其他调控系统协同作用，调控细菌的生长、繁殖及

4、代谢等生命活动。本研究以罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910RovS转录调节因子为研究对象，通过构建rovS基因缺失突变株，比较野生株和突变株的生物学性状，研究其致病力及相关毒力因子的表达情况，为进一步探讨罗非鱼源无乳链球菌的分子致病机理奠定了理论基础。利用PCR技术扩增rovS基因上下游同源片段rovS-F、rovS-R，以及红霉素抗性基因Erm，然后利用温度敏感型自杀载体pSET4s构建重组质粒pSET4s-rF-Erm-rR，通过电转化的方法将重组质粒转入野生株S.agalactiaeZQ0910中，通过抗生素（Spc+，100μg·mL-1。Erm

5、+，50μg·mL-1）及温度双重标记筛选rovS基因缺失突变株，并将其命名为ΔrovS。在相同的培养条件下，通过细菌的传代培养，对野生株S.agalactiae和突变株ΔrovS的遗传稳定进行分析，结果显示，突变株ΔrovS能够稳定的生长。通过测定OD600绘制的野生株和突变株的生长曲线发现，突变株ΔrovS比野生株S.agalactiae的生长略为缓慢。革兰氏染色结果显示，rovS基因的缺失并未对细菌的革兰氏染色产生影响。通过观察血琼脂平板上野生株和突变株的生长形态发现，突变株ΔrovS菌落周围不产生β-溶血环，说明rovS基因的缺失改变了细菌的

6、溶血性。半致死量LD6750测定结果显示，突变株ΔrovS的LD50（3.16×10cfu）是野生株LD50（2.0×10cfu）的6倍，说明rovS基因的缺失使无乳链球菌对罗非鱼的致病性减弱。利用实时荧光定量PCR技术，研究无乳链球菌毒力相关因子mRNA表达量的差异，结果显示无乳链球中rovS基因的缺失，使得fbsA和sip基因的表达水平上调，gluC、gyrA、hlyA、pyrR及sodA基因的表达水平下调，ccpA、cpsC和scpB基因的表达水平并无明显变化。关键词：无乳链球菌RovS转录调节因子基因敲除功能分析IContructionand

7、FunctionAnalysisoftheRovSTranscriptionRegulatorofDeletedMutantStrainofStreptococcusagalactiaeIsolatedfromTilapiaAbstractGroupBStreptococcus(GBS),alsoknownasStreptococcusagalactiae,isacommonpathogen,whichcancauseaclinicaldiseasesofhumanbeingandanimals.Recently,break-outofstrepto

8、coccicosisofculturedtilapiafish,causedbyStreptococcusa