探析海藻酸钙微胶珠培养神经干细胞

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1、大连理工大学硕士学位论文海藻酸钙微胶珠培养神经干细胞姓名：姚立松申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：崔占峰;刘天庆20050620大连理工大学硕士学位论文摘要神经干细胞(Neuralstemcells，NSCs)作为一种具各自我更新及多向分化潜能的细胞，将在治疗神经系统疾病以及神经损伤的修复中起到重要作用，但是神经干细胞的来源受限及数量不足是临床应用的最大障碍。为了解决神经干细胞临床需求数量不足的问题，采用三维动态培养以实现大规模扩增是一种有效的解决办法。但是，在动态搅拌条件下，剪切力对细胞的损害

2、是非常大的，尤其对神经干细胞这种对剪切力极为敏感的干细胞更是如此。考虑到海藻酸钙微胶珠在细胞培养领域的应用，如果把胶珠培养与动态培养结合起来，将会是一个非常值得期待的神经干细胞培养方式。为了实现动态胶珠大规模扩增神经干细胞，本文在静态条件下，采用海藻酸钙微胶珠(Calciumalginatemicrobeads，简记为Ca-AlgMBs)作为神经干细胞的3D培养手段，对海藻酸钙微胶珠的成胶珠工艺、生物相容性、细胞培养以及细胞收获方法进行了探索。首先对成胶珠工艺参数进行了优化选择，以海藻酸钙微胶珠为研究对

3、象，建立了微胶珠内部的扩散传质模型，研究成胶珠参数对其扩散系数(DAB)的影响。制作不同工艺的微胶珠进行葡萄糖扩散实验，得到各种工艺条件下微胶珠内部的扩散数据，再通过传质模型，结合相应工艺的扩散数据进行计算，从而得出不同制各工艺下微胶珠的内部扩散系数。根据细胞培养对胶珠的强度要求，对胶珠进行强度检测，综合扩散系数与强度检测结果，选出适于神经干细胞培养的最佳成胶珠工艺条件为：1．5％(讲％)的海藻酸钠，3．5％(w慌)的CaCl2，成胶珠时间10min以及2m／ii的直径。其次，通过胶珠与神经干细胞的共培

4、养，并对培养后的细胞进行分析鉴定，确认了海藻酸钙微胶珠对神经干细胞具备良好的生物相容性。再次，采用上述确定工艺，对小鼠神经干细胞进行了胶珠培养，同时对不同包囊密度进行对比，得到包囊神经干细胞的最佳密度为8x104cells·ml一。并对海藻酸钙微胶珠培养的神经干细胞进行了nestin等特异性蛋白的免疫荧光化学染色，结果为阳性，表明所培养的细胞具备神经干细胞的特性，属于神经干细胞。最后，在细胞收获工艺的选择过程中，先后对成骨细胞，神经干细胞进行了细胞收获率的实验，发现采用55mmol·L1柠檬酸钠作用10

5、min，1500rpm离心的工艺，细胞收获率可达到90％左右。本文的研究结果表明，适宜工艺制备的海藻酸钙微胶珠是培养神经干细胞的有效手段，同时也为动态微胶珠培养神经干细胞打下了良好基础。关键词：神经千细胞；海藻酸钙：微胶珠；扩散系数海藻酸钙微胶珠培养神经干细胞CultureofNeuralStemCellsinCalciumAlginateMicrobeadsAbstractNeuralstemcellsmSCs)withthecapacityofself_renewalanddifferentiati

6、onintoneuronsandglialcells,havegottenmoreandmoreworldwideattention，Thefinding．researchandapplicationofNSCswillplayanimportantroleinthenervediseasetreatmentandnerveinjuryreparation．TheshortageofthesourceandthenumberofNsCs．however,isthemainchajlengeforitsc

7、linicapplication．Large—scalethree-dimensionalcultureofNSCsinvitroprovidesafeasibleanswerforthisproblem．Buttheshearstressinbioreactorscarlcauseseriouscelldamageespeciallyfor也eshearsensitivecellslikeNSCs．Toavoidtheshearstress．encapsulationofNSCsandthencult

8、ivationinbioreactorsisthusworthinvestigating．Therefore，weexploredthemethodofculturingNSCsincalciumalginatemicrobeads(Ca-AlgMgs)．ToprovidetheoptimumgrowthconditiomforNSCsinCa-AlgMBs．negelationparameters,suchaSthediameter，re