视网膜感光细胞对仿生电场刺激的非矢量应答

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1、温州医科大学硕士学位论文分类号：R77单位代码：10343学号：1102020046硕士学位论文论文题目:视网膜感光细胞对仿生电场刺激的非矢量应答研究生姓名：杨极学科专业：眼科学类型：专业型指导教师：金子兵二O一八年五月温州医科大学硕士学位论文论文题目:视网膜感光细胞对仿生电场刺激的非矢量应答答辩委员会主席：刘春巧教授（中山大学）答辩委员会成员：池在龙教授（温州医科大学）侯方研究员（温州医科大学）论文答辩日期：2018年5月21日温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要………..………………………………………………………………………………1英文摘要……………………………

2、…………………………………………………………3前言……………………………………………………………………………………………6材料与方法…………………………………………………………………………………8结果…………………………………………………………………………………22分析与讨论…………………………………………………………………………………35小结……………………………………………………………………………………………38参考文献………………………………………………………………………………39附录……………………………………………………………………………………………43致

3、谢……………………………………………………………………………………………44综述及参考文献……………………………………………………………………………47独创性声明…………………………………………………………………………………60温州医科大学硕士学位论文摘要视网膜感光细胞对仿生电场刺激的非矢量应答目的：眼睛作为光感受器官，同时也具有许多不同类型的电生理特性，正常状态下眼组织的细胞暴露于生物体内生电场中，故电场可以调控眼组织细胞各种各样的生物学应答模式。因为电场是个矢量，具有大小和方向，故细胞对电场信号的应答可分为两个方面，一方面是细胞对电场矢量的方向性的应答；另一方面

4、电场也可以直接对细胞的起作用，激活细胞内的信号转导，改变细胞的生长状态，我们称之为非矢量应答。其中，矢量性应答包括：迁移、定向、延长等，而非矢量性的应答包括：增殖、凋亡等。细胞对于电场矢量的应答是最常见的应答现象，所以很多研究都集中于探究矢量性应答的机制。同时，细胞外的电场也能引起细胞内的信号转导，但是其机制知之甚少，所以对细胞非矢量性应答的机制也了解甚少。关于感光细胞对电场刺激非矢量性应答的分子机制的了解完全处于空白阶段，故本研究着重于探究感光细胞对于电场刺激的非矢量性应答的机制。方法：为了探究内生电场调控细胞行为的分子机制，我们需要在体外模型模拟内生电信号，以探

5、究细胞对电场信号的应答过程及机制。我们原创性地发明了一款电刺激仪，此仪器稳定、高效，能对离体细胞进行稳定的电刺激。此电刺激仪的刺激电极由铂金丝和改构的六孔板培养皿盖子组成，属于直接电刺激仪范畴。本研究选择了永生化的视锥细胞系，即661W细胞作为我们的细胞模型。同时我们运用血球细胞计数板定量细胞的数量，运用CCK-8试剂盒测量细胞的活性。我们制备细胞爬片，共聚焦荧光显微镜拍摄EdU试剂盒染色的细胞爬片。为了进一步验证EdU染色的结果，我们运用流式细胞仪对细胞进行计数，计算阳性细胞比例。制作基因表达谱，利用生物信息学的相关技术和方法来找寻电刺激的应答通路。用逆转录PCR

6、制作cDNA文库，进一步运用定量PCR来检测mRNA的表达量，用蛋白印记法（WesternBlotting）来定量相关蛋白表达量，用Ca2+离子通道阻滞剂西尼地平来进一步确定细胞对电场刺激应答的机制。结果：1温州医科大学硕士学位论文我们利用自主研发的体外电刺激装置进行实验，此研究中我们选择了单向矩形波输出模式，强度为：60mV/mm、90mV/mm、120mV/mm。施加电场24小时后，我们发现60mV/mm组和90mV/mm组中细胞呈聚集样生长，而120mV/mm组可以看到细胞变圆，细胞稀疏。用CCK-8试剂盒测量细胞活性，结果显示相比于对照组，60mV/mm组（

7、P<0.001）和90mV/mm组（P<0.001）细胞活性上升，其中90mV/mm组细胞活性升高更明显。细胞计数结果显示60mV/mm组（P<0.05）和90mV/mm组（P<0.01）细胞数量相比与对照组有所增加。EdU染色结果显示相比于对照组，60mV/mm组（P<0.01）和90mV/mm组(P<0.01)中新增殖细胞比例增加。利用流式细胞仪进一步对EdU阳性的细胞进行计数，其结果与共聚焦显微镜照片结果一致。制作基因表达谱，结果显示60mV/mm电场刺激24小时后，661W细胞中351个基因表达上调2倍，426个基因表达下调2倍。利用生物信息学手段对基因