脐血干细胞玻璃化保存过程的研究

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1、大连理工大学硕士学位论文脐血干细胞玻璃化保存过程的研究姓名：李一鸣申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：马学虎20080609大连理工大学硕士学位论文摘要脐血中含有丰富的造血干细胞，可以治疗白血病、恶性肿瘤、重型地中海贫血等多种疾病。脐带血中造血干细胞占有的比例甚至超过成人骨髓，是继骨髓和外周血之后新近发现的造血干细胞的又一来源。目前，脐血造血干细胞的低温保存主要采用的是慢速冻存方法，但是这种方法的冻存效果以及冻存技术还有需要提高和完善的地方。玻璃化法作为一种新型的、简便的低温保存方法可以有效地克服慢速冻存的缺点，但是玻璃化法需要

2、高浓度的保护剂才能实现，这会给细胞带来很大的渗透损伤和毒性损伤。本文对联合玻璃化保护剂的特性，联合玻璃化保护剂的导入、洗脱程序以及脐血造血干细胞玻璃化低温保存过程及其后期培养等方面的问题进行了系统的研究。首先对联合玻璃化保护剂的特性进行了研究。本实验所采用的联合玻璃化保护剂的组成为：25％DMS0、17％甲酰胺、10％1，2．丙二醇和6％聚乙二醇(w／v)。通过稀释的方法测定了不同浓度的联合玻璃化保护剂的渗透压值。通过冷台观察发现当降温速率低于30℃／rain时，保护剂不能实现玻璃化。提高复温速率能够有效地缩短反玻璃化时间。其次对脐血

3、造血干细胞联合玻璃化保护剂的连续导入及分步洗脱过程进行了研究。通过采用分别在室温(20℃)与低温(1．5℃)下，不同导入时间的方法连续导入保护剂，并采用分五步，每步之间平衡60s的方法对保护剂进行洗脱。实验结果表明，在低温下，导入后细胞的活率高于室温导入，而最佳的导入时间为60s。洗脱后，细胞活率的分布情况与导入后基本一致，并且洗脱过程所造成的细胞损失相对较小。最后对脐血造血干细胞玻璃化低温保存过程及其后期培养进行了研究。实验研究了降复温操作方法对细胞活率的影响，并与导入、洗脱过程进行比较。通过对洗脱保护剂后的细胞进行4天培养，全面观

4、察了玻璃化保存过程后细胞的生长情况。结果表明，当前采用的玻璃化低温保存程序是一套简单有效的方法，可以满足实验要求。通过对细胞的后期培养，进一步证明60s为保护剂连续导入最佳时间。并且，导入温度对细胞的后期培养并无影响。关键词：脐血；造血干细胞；玻璃化；冷冻保护剂；连续导入玻璃化法低温保存脐血造血干细胞的研究VitrificationProcessofHSCsderivedfromumbilicalcordbloodAbstractHumanumbilicalcordbloodCoca)hasplentyofhematopoietics

5、temcells(HSCs)andCanbeusedinthecureofleukaemia,malignancyandthalassemiamajor．IthasbeenshowntocontainasimilarorhigherproportionofHSCsthanadultbonemarrowandhasproventobeafeasiblealternativesourceofHSCsfrombonemarrowandperipheralblood．Atpresent．slowcoolingiStheadoptedmetho

6、dforlong-termstorageforHSCsbutasaconventionalmethod，ithasmanydisadvantages．Vitrificationisapromisingnovelandsimpleprocedurethatrequireslesstimeandislikelytobecomesaferandmoreeffectivethanslowcooling．however,vitrificationneedacombinationofhighconcentrationsofcryoprotecta

7、ntagent(CPA)whichhasveryhiglltoxicandosmoticinjurywhentheCPAiSloadedandremoved．T11iSthesisfocusesonthecharacteristicofCPA，theloadingandremovingprocessofCPAandthevitrificationandcultureofHSCs．Firstly，thecharacteristicofCPAiSresearched．ThecomposingofCPAis：25％DMSO，17％forma

8、mide，10％propane一1．2-dioland6％PEG(w／v)．Withthemethodofdilution，theosmolalityofCPAofdifferentconcentrationiSmeas