胶原包埋神经干细胞低温保存技术的研究

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1、大连理工大学硕士学位论文胶原包埋神经干细胞低温保存技术的研究姓名：高志新申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：马学虎20080609大连理工大学硕士学位论文摘要神经于细胞的低温保存对临床医学的细胞移植以及建立干细胞库有着极为重要的意义。本课题是在选用传统慢速冻存方法的同时将细胞包埋入鼠尾I型胶原中，建立新型的冷冻体系。实验中采用单一的DMSO溶液作为冷冻保护剂并考察了不同浓度的DMSO导入过程中体系外部溶液主体浓度的变化，从而推算出胶原一细胞体系内部的DMSO平均浓度，进而确定最优的冷冻保护剂浓度以及胶原浓度。实验中选取的胶原浓度分别为0．5mg／ml，1．0mg／

2、ml和1．5mg／ml，DMSO浓度分别为15％(v／v)，20％(v／v)和25％(v／v)。根据体系外部冷冻保护剂的浓度变化确定保护剂的平衡时间，并通过物质守恒方程推算出体系内部冷冻保护剂平均浓度在8％'-"15％(v／v)之间的实验组进行慢冻保存。本文同时考察了降温速率对细胞复苏状态的影响。文中选取了1℃／rnin、3．4℃／min和18．6℃／min三个降温速率对神经干细胞进行低温保存，并进行冷冻复苏后0h和24h的细胞活率比较、流式细胞凋亡检测和ATPase活力检测以及复苏细胞的诱导分化和免疫组化(Nestin，13mbulinIII，GFAP及RIP)检测。

3、实验结果表明神经干细胞在胶原层中状态良好，通过物质守恒方程筛选胶原系统内部冷冻保护剂浓度适宜神经干细胞低温保存的实验条件。胶原体系冷冻保护剂平衡时间要远大于细胞悬液的平衡时间，起到了缓渗的作用。对6组实验条件进行慢速冷冻保存，用胶原包埋的神经干细胞复苏后活率明显高于其他单纯的细胞悬液的冷冻保存，l"C／min和3．4℃／min的降温速率均可以达到较高的细胞复苏率。其中1．5medrIll胶原+20％DMSO条件下冻存复苏后可得到88．5％的活率。从复苏后细胞的凋亡状态来看，采用胶原包埋的方法冷冻复苏后健康细胞在78．5％"-'86．7％，有5％左右的细胞进入早期和晚期凋

4、亡。传统的方法健康细胞仅为38．5％，而且大多数细胞进入凋亡期。胶原包埋方法复苏细胞的ATP酶活性高于传统冷冻方法。经过免疫组化的检测，复苏后的细胞为Nestin阳性细胞，保持了良好的干细胞性能，其可分化为神经元(13tubulinlII阳性)，星形胶质细胞(GFAP阳性)，少突胶质细胞(尉P阳性)细胞。关键词：神经干细胞；低温保存；I型胶原；胶囊包埋胶原包埋神经干细胞低温保存技术的研究CryopreservationofneuralstemcellsencapsulatedinrattailcollagentypeIAbstract髓ecryopreservation

5、ofneuralstemcells(NSCs)forcljnicalmedicinetransplantationandtheestablishmentofstemcellbankareofimportantsignificance．Thisstudyfollowedtheslow-coolingmethod、析ththeNSCsencapsulatedinrattailcollagentypeItodevelopanewcryopreservationprotoc01．DMSOiSusedasthecryoprotectants．Theconcentrationofr

6、attailcollagentypeIisO．5mg／ml，1．Omg／ml和1．5mg／mlrespectively，andtheconcentrationofDMSOiSlO％(v／v)，15％(v／v)，20％(v／v)and25％(v／D．FromthevariationoftheconcentrationofDMS0attheexternalsystemafter10ading．theaverageconcentrationofDMSOsolutionwithinthecollagensystemcallbeestimated．Andthentheaverag

7、einternalconcentrations0f8％tol5％wereselectedforthecryopreservationexperimentsandtheeffectofcoolingrateonNSCssurvivalrateatthesametime．nesurvivalrateofNSCsatOh．24hafterfreeze-thawingWasassayed，andNSCswereassayedbyflowcytometryfortheapoptosisandtheATPenzymeactivityafterfree