和雌激素受体相互作用蛋白fhl2功能的研究

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2、特授权呈壹匡堂盘堂瞳可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以呆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。(保密学位论文在解密后适用本授权书)论文作者签字：指导教师签字：签字日期：签字曰期：竺!年—二月二三日盘!12年』工月-三三日鳖摘要雌激素受体(estrogenreceptor，ER)是核受体超级家族成员之一，它包括两种亚型：a和B。两种亚型在结构上基本相似，均分为4个功能结构域，即转录激活区AFl和AF2，DNA结合结构域(DBD)及位于D区的铰链区。

3、AFl具有配体(雌激素)不依赖的转录激活功能，AF2具有配体依赖的转录激活功能。AFl和AF2的有效转录激活均依赖于与其它蛋白质的相互作用，ER通过AFl和AF2相互协同作用调控雌激素应答的基因表达。ER在乳腺癌的发生发展中起重要作用，乳腺癌内分泌的治疗主要是通过降低ER转录活性而实现。因此调节ER转录活性的蛋白因子的发现和相应的功能研究对于探讨乳腺癌的发病机制、预防乳腺癌的发生、有效开发治疗与雌激素相关疾病的药物具有重大意义。我们以ERflAFI(I一145aa)为诱饵，用酵母双杂交技术从人乳腺eDNA文库中分离到了未曾报道的与ERr相

4、互作用的蛋白质FHL2。FHL2是FHL家族蛋白成员，含4个半LIM结构域，LIM结构域的双锌指结构广泛地介导了蛋白一蛋白问的相互作用。为进一步确认FHL2与ER之间存在特异性的蛋白质问相互作用，我们进行了GST沉降和免疫共沉淀实验，结果表明，FI-IL2和ERa、ERa在体外和体内都存在相互作用，获得了与酵母双杂交结果相一致的实验结果。通过FHL2和ER不同功能域缺失的系列突变体，揭示了FHL2和ER发生相互作用的结合区域，FHL2N端的半个LIM结构域就能与ER结合，FHL2与ERr的AFl区结合，与ERa的AF2区结合。FHL2同一

5、家族的另外2个成员FHLl、FHL3也能与ER相互作用。在转染含雌激素应答元件的ERE荧光素酶报告基因实验中，FHL2能以剂量依赖的方式抑制ER介导的ERE荧光素酶报告基因的转录。通过活性实验，进一步发现FHL2抑制雌激素应答元件的报告基因转录活性的功能依赖于ER的存在，而且不是通过影响ER的表达水平而实现的。为了深入研究FHL2基因的功能，我们制备了抗FHL2的鼠多克隆抗体，并利用该抗体检测了FHL2在大鼠不同组织及其乳腺癌细胞株中的表达。随后我们构建了有效的FHL2siRNA真核表达载体，将RNAi实验与活性实验相结合，发现抑制FHL

6、2的表达后，FHL2抑制雌激素应答元件的报告基因转录活性的功能也受到抑制。同时在乳腺癌细胞株T47D中构建了FHL2过表达和低表达的稳定转染细胞株，再次从正2摘要反两方面验证了FHL2能抑制ER报告基因的转录，由此推测FHL2是ER的共抑制子。本实验室已证明FHL2与Smad4也存在相互作用，另有文献表明Smad4能抑制ER下游基因的转录活性。我们利用转录活性实验证明FHL2与Smad4能协同促进ER口调节报告基因的转录；同时免疫共沉淀实验也表明FHL2、Smad4与ERB共存在于同一复合物中。这些研究结果表明，FHL2可能是雌激素信号通

7、路的一个新型调控因子，通过与ER相互作用参与信号通路的调控，进一步的深入研究将有助于了解新型雌激素受体ER口信号通路的调控机制，为阐明乳腺癌的发生机制开辟一个新的思路。关键词：FHL；ER：蛋白质相互作用；乳腺癌；ABSTRACTEs仃ogenreceptor(ER)isoneofthemembersofthenuclearreceptorsuperfamily．MammalianERisencodedbytwogenes：Ⅱand13．BothER镬aria．ERl3Canbesubdividedintosixregions(A·F)，

8、whichcontaintwotransactivationfunctionregions，calledAFlandAF2．respectively．AFlhasligand-independ