骨髓间充质干细胞移植对脑出血大鼠血肿周围凋亡及p75ntr、trka表达的影响

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEffectofBoneMarrow-DerivedMesenchymalStemCellsTransplantationontheApoptosisandExpressionofP75NTR，TrkAinPerihematomaTissueinRatswithIntracerebralHemorrhageByYingkeYangSupervisor：Prof．HongcanZhuNeuro

2、logytheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：苍◇缸吟日期：b‘>年}月vSEt学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识

3、产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：伞面呦日期：～7弓年f月≥兮日摘要脑出血(intracerebralhemorrhage，ICH

4、)是发病率、致残率和病死率均较高的一类严重的脑血管病。脑出血后血肿周围神经细胞的凋亡是导致患者神经功能缺损的主要原因之一，P75NTR(p75neurotrophinreceptor)与TrkA(tyrosinekinaseAreceptor)均为神经营养因子受体，两者在神经营养因子介导的神经细胞保护中起拮抗作用。最近BAOG等在脑出血病人脑中发现，P75NTR表达上调，TrkA表达不明显变化，提示两者可能参与脑出血中的继发性细胞凋亡。大量研究表明干细胞移植可以改善脑出血的神经功能缺损症状。尚无研究报道

5、P75NTR与TrkA在BMSCs改善神经功能缺损中的作用。骨髓间充质干细胞(Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)可从成体骨髓中获取，无免疫排斥反应可自体移植，不涉及伦理，具有多向分化潜能、多种作用机制，易采集制备及保存，不易恶性转化，具有广阔的临床应用前景。移植的BMSCs可改善神经功能，但是其是否通过调节P75NTR与TrkA的表达起到拮抗血肿周围组织中神经元凋亡发挥作用尚不确定。本研究采用胶原酶诱导法建立脑出血大鼠模型，立体定向将BMSCs注射

6、入模型大鼠纹状体内，比较假手术组、模型组和BMSCs组神经功能评分，细胞凋亡程度，血肿周围P75NTR、TrkA的蛋白表达，来探讨BMSCs移植是否可通过改变血肿周围P75NTR、TrkA表达起到拮抗细胞凋亡的作用。本研究进一步完善BMSCs治疗脑出血的机制，使BMSCs更好的进入临床应用。目的：研究骨髓问充质干细胞移植对大鼠脑出血模型神经功能恢复的影响，探讨BMSCs移植是否可通过改变血肿周围P75NTR、TrkA表达起到拮抗细胞凋亡的作用。方法：清洁级的雄性SD大鼠，体重250．3009，60只，随

7、机分入假手术组、模型摘要组及BMSCs组。各组均采用牙科钻进行立体定位穿刺，假手术组不注射胶原酶。立体定位穿刺并向纹状体注入胶原酶制作大鼠ICH模型。全骨髓反复贴壁法分离、纯化BMSCs，再用携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescenceprotein，GFP)基因的慢病毒对其进行转染。手术后24h将2x105的转寒好的BMSCs悬液立体定位向注射入BMSCs组大鼠血肿周围。对各组于术后ld、3d、7d、14d各个时间点进行神经功能评分(采用mNSS和MLPT量表)，14d处死大鼠后取脑固定、包埋

8、、切片，观察BMSCs迁移及存活情况，免疫组织化学法及免疫蛋白印迹法(Western—blotting)检测血肿周围P75NTR、TrkA的表达情况，DNA断裂原位末端标记(terminaldeoxynucleotidyltransferase．mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)法检测血肿周围组织中细胞的凋亡情况。结果：1．原代培养的BMSCs在光镜下呈梭形，第二代后形态均一呈漩涡状。流式细胞术鉴定BMSC