西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究

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THEEFFICIENCYBYWESTERNFLOWERTHRIPS，删ⅣK[2=7＼砸Z乙4DCC理M孙门么L胳TRANSMITINGTOMATOSPOTTEDWIIJVIRUS0NDIFFEI己ENTHOSTPLANTSByZhangYuxiuTheDissertationSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeMasterofScienceSupen，isedbyProfessorLuYaobinDepartmentofEntomologyNanjingAgriculturalUniversityNanjing，210095，P．R．ChinaMay，2013 本研究由国家公益性行业科研专项(项目编号：201103026，201303028)国家科技支撑计划课题(项目编号：2012BADl9806)联合资助本研究工作在浙江省农科院“浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地’’完成 原创性l声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：孤玉秀加I声箩月≥1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口，在——年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密西(请在以上方框内打“√")学位论文作者(需亲笔)签名：佩玉秀冽多年箩月≯／日导师(需亲笔)签名：山哆年兮月I／日 目录摘昙暮⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．I文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．第一章西花蓟马研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1一、西花蓟马的分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1二、西花蓟马的生物学特性及危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4三、西花蓟马的防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53．1植物检疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53．2物理防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53．3化学防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．4生物防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6四、展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8第二章番茄斑萎病毒研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9一、病毒的分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9二、寄主及危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9三、结构与检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9四、传播媒介与防治措施⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10五、展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10第三章EPG技术在昆虫研究中的概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯_⋯⋯⋯．．12一、EPG技术的发明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12二、EPG技术的适用范围⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12三、EPG波形的生物学意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12四、EPG技术展望与前景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．第一章西花蓟马传毒效率的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．14l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．1供试昆虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．2供试病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．3供试植株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．4西花蓟马获毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．5西花蓟马传毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．6ELISA检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．151．7数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17第二章EPG分析非感毒西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．201．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯211．1供试材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．211．2刺吸电位波形(electricalpenetrationgraph，EPG)记录方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究1．3取食实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．211．4数据统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1西花蓟马的刺探特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．2西花蓟马的取食行为⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．j寸论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．1西花蓟马取食行为与寄主适宜性的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．2西花蓟马取食行为与病毒传播的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．313．3西花蓟马EPG实验中的改进问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31第三章EPG分析感毒(TSWV)西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．331．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯331．1供试材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．331．2刺吸电位波形(electricalpenetrationgraph，EPG)记录方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．331．3取食实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．331．4数据统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．332．结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．1西花蓟马的刺探特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．2西花蓟马的取食行为⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．{对{沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯413．1感毒西花蓟马取食行为与病毒传播的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．413．2西花蓟马取食行为与寄主适宜性的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．423．3EPG实验的改进问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42第四章感毒(TSWV)西花蓟马RNA的提取与检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯431．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．431．1供试昆虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．431．2TSWV的N．gene特异性引物设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯431．3主要试剂和药品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．432．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯442．1单头蓟马RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．442．2一步法RT-PCR扩增eDNA合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．442．3凝胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．442．4测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．443．结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯444．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45第五章全文总结与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．461．全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．461．1西花蓟马传毒能力的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．461．2EPG分析非感毒西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．461．3EPG分析感毒西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．461．4感毒西花蓟马RNA的提取与检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462．主要创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯463．研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．46 目录参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．581．接种缓冲液⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯582．试剂盒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．58．3．仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．其他⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58攻读硕士学位期间发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60致j射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62 摘要西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)是一种重要的农作物害虫，并且是番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvires，TSWV)最有效的传播介体，每年可造成农作物巨大的损失。本研究采用叶碟实验法．观察西花蓟马在四种寄主植物(番茄、辣椒、曼陀罗、矮牵牛)上传播番茄斑萎病毒的效率：采用直流刺吸电位(directcurrentelectricalpenetrationgraph,DC．EPG)技术记录分析了非感毒西花蓟马和感染番茄斑萎病毒的西花蓟马在四种寄主植物(番茄、辣椒、曼陀罗、矮牵牛)上的取食行为，并利用RT-PCR法检测单头西花蓟马体内是否携带有番茄斑萎病毒；结果如下：1．可能有10％～30％左右的西花蓟马可成功获取番茄斑萎病毒(TSWV)并传播使寄主植物发病。而西花蓟马在四种不同寄主植物上传播番茄斑萎病毒的效率不存在显著差异，说明感毒后的西花蓟马在不同适宜性的寄主植物上传播该病毒的效率是相似的。所以，西花蓟马传播番茄斑萎病毒的效率不会因为寄主植物种类的不同而有所差别。2．非感毒西花蓟马在四种寄主上取食行为的结果：’(1)不同寄主之间的比较：西花蓟马在辣椒上产生的非取食刺探显著少于在其它寄主植物上的非取食刺探。雌虫在辣椒、番茄、曼陀罗和矮牵牛上的非取食刺探分别为231．1次、328．9次、361．0次和304．4次，雄虫在辣椒、番茄、曼陀罗和矮牵牛上的非取食刺探分别为152．7次、277．2次、221．4次和196．8次。西花蓟马在矮牵牛上的短取食刺探显著高于番茄，雌虫在番茄和矮牵牛上的短取食分别为68．8次和144．4次，雄虫在番茄和矮牵牛上的短取食分别为15．9次和80．9次。西花蓟马在矮牵牛上产生的长取食刺探少于在其它寄主植物上的长取食刺探。(2)雌雄虫之间的比较：雌虫比雄虫产生更多的非取食刺探和短取食刺探，雄虫的长取食刺探显著高于雌虫。在矮牵牛上，雌虫的非取食刺探次数和非取食刺探总时间为雄虫的1．5倍。在番茄上，雌虫的短取食次数和短取食总时间分别为雄虫的4倍和2倍：雄虫的长取食次数和长取食总时间分别为雌虫的2倍和7倍。由此可知，西花蓟马的取食行为与寄主适宜性之间无显著的相关性。3．感染番茄斑萎病毒的西花蓟马在四种寄主上的取食行为结果：(1)不同寄主之间的比较：西花蓟马在矮牵牛上和曼陀罗上的短取食显著高于其他寄主。雌虫在番茄、辣椒、曼陀罗和矮牵牛上的短取食次数分别为73．7次，66．7次．137．3次和197．9次。西花蓟马在矮牵牛上的长取食显著低于其他寄主。西花蓟马雌虫在番茄、辣椒、曼陀罗和矮牵牛上的长取食次数分别为1．3次，1．5次，0．7次和0．6次。(2)不同性别之间的比 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究较：雌虫比雄虫产生更多的短取食刺探，雄虫的长取食刺探显著高于雌虫。雌虫在番茄、曼陀罗和矮牵牛上的短取食次数均为雄虫的3倍。在矮牵牛上的短取食总时间为雄虫的2倍多。雄虫在曼陀罗和矮牵牛上的长取食刺探次数均为雌虫的2倍，在番茄和矮牵牛上的长取食总时间是雌虫的2倍和3倍。由此，从取食行为方面解释了感毒的雄性西花蓟马比雌性西花蓟马的传毒效率高，且感毒后的西花蓟马的取食行为与寄主适宜性之问无显著相关性。关键词：西花蓟马：番茄斑萎病毒：直流刺吸电位技术：寄主植物：取食行为 ABSTRACTTHEEFFICIENCYBYWESTERNFLOWERTHRIPS，FRANKLINIELLAoCCIDENr】HLIS飞RKNS旧臌GTOM讼T0SPOTTEDWIIJVIRUSONDIFFERENTHOSTPLANTSABSTRACT：Westernflowerthrips，Frankliniellaoccidentalisaretheimportantinsectsinthecrops，andtheyarethemostefficienttransmittersfortomatospottedwiltvirusandcausehugelossesoncropseveryyear．Transmissionefficienciesfortomatospottedwiltviruswerecomparativelystudiedusingleafdisksoffourhostplants，whichweretomato，pepper，petuniaandstramonium．Inthisstudy,thefeedingbehaviorsforhealthyandinfectedwesternflowerthripsontomato，pepper,stramoniumandpetuniawererecordedusingthedirectcurrentelectricalpenetrationgragh(DC-EPG)．TodetermineifitcarriedTSWVornot，theindividualinfectedwesternflowerthripswastestedbyRT-PCR．Allresultsarefollows：1．Onlybetween10percentand蛳percentwesternflowerthripscarlacquireTSWVandtransmitittoplantssuccessfully．TheresultshowedthatthetransmissionefficiencybywesternflowerthripsofTSⅥⅣonfourdifferenthostplantswerenosignificantdifference．Itmeansthatthetransmissionefficiencesbyinfectedwesternflowerthripsaresimilarondifferentsuitablehostplants．TheefficiencybyinfectedwesternflowerthripstransmitingTSWVwillnotbecamesignificantdifferencebecauseofthechangeofthespeciesofhostplants．2．Theresultsoffeedingbehaviouroftminfectedwesternflowerthripsonfourhostplants：(1)Thecomparisonamongdifferenthostplants：ThenoningestionprobesforWFTonpepperweresignificantlylessthanthatonotherhostplants．Thenumberofnoningestionprobesforfemalesonpepper,tomato，stramoniumandpetuniaWas231．1，328．9，361．0and304．4，respectively．Thenumberofnoningestionprobesformalesonpepper,tomato，stramoniumandpetuniaWas152．7，277．2，221．4and196．8，respectively．Comparedwithtomato，theshort—ingestionprobesforⅥ，FTWassignificantlygreateronpetunia．Thenumberofshort—ingestionprobesforfemalesontomatoandpetuniaWas68．8and144．4，respectively．Thenumberofshort—ingestionprobesformalesontomatoandpetuniawas15．9and80．9，however．Thelong-ingestionprobesonpetuniawerelessthanthatonotherhostplants．(2)Pairwisecomparisonforfemaleandmalethrips．Thenoningestionprobesandshort—ingestion probesforfemalesweremorethanthoseformales，however,thelong。ingestionprobeformaleswasmorethanthatfemales．Thenumberandthedurationofnoningestionforfemalesonpetuniawere1．5timesofthatformales．Comparedwithfemales．thenumberanddurationofshort-ingestionformaleswas4timesand2timesofthoseforfemalesontomato．respectively．Thenumberandthedurationoflong—ingestionformaleswas2timesand7timesofthatforfemalesontomato，respectively．Fromtheseresults，weconcludedthatthefeedingbehaviorofwesternflowerthripsonhostplantsdoesn’thavecloserelationtothesuitabilityofhostplants．3．TheresultsoffeedingbehaviorforW丌whichinfectedwithTSWVonfourhostplants：(1)Thecomparisonamongdifferenthostplants：Theshort-ingestionforWFTonpetuniaandstramoniumWassignificantlyhigherthanotherhostplants．Thenumberofshort-ingestionforfemalesontomato，pepper,stramoniumandpetuniaWas73．7，66．7，137．3and197．9，respectively．Thelong—ingestionforWFTonpetuniawassignificantlylessthanotherhostplants．Thenumberoflong—ingestionforfemalesontomato，pepper,stramoniumandpetuniaWas1．3，1．5，0．7and0．6，respectively．(2)Thecomparisonbetweenfemalesandmales：Theshort．ingestionforfemalesWasmorethanthoseformales，however,thelong—ingestionformalesWasmorethanthatfemales．Thenumberofshort—ingestionforfemalesOlltomato．slramoniumandpetuniawerea113timesofthatformales．Thetotaldurationofshort．ingestionforfemaleswasonpetuniawas2timesofthatformalesComparedwithfemales，thenumberoflong-ingestionformaleswereboth2timesofthoseforfemalesonstramoniumandpetunia，respectively．Thetotaldurationoflong-ingestionformalesontomatoandpetuniaWas2timesand3timesofthatforfemales，respectively．Fromtheseresults，wecanexplainwhymaleswithTSⅥrVhavebeenmoreemcientvectorsofTSⅥⅣthanfemalesonfeedingbehavior．AndwecanalsoconcludethatthefeedingbehaviorofwesternflowerthripswithTSWVonhostplantsdoesn’thavecloserelationtothesuitabilityofhostplants．KEYWORDS：FranMiniellaoccidentalis；Tomatospottedwiltvirus；directcurrentelectricalpenetrationgraph；hostplant；feedingbehaviorIV lI．--I■___--___一Z型午C：了斥用文献综述 上篇文献综述第一章西花蓟马研究概况一、西花蓟马的分布蓟马属于缨翅目(Thysanoptera)昆虫，分属锥尾亚目(Terebrantia)和管尾亚目(Tubulifera)及8个科，世界上己知记录的种类大约有6000种(Ananthakrishnan，1979)，而其中有1％的蓟马种类会对农作物造成严重危害(Morse&Hoddle，2006)。目前在我国已有记录的蓟马有124属336种之多(张维球和童晓立，1993)。大多数蓟马是植食性的，锉吸植物的汁液；另一部分是以真菌为食，喜食孢子和菌丝；极少部分是捕食性的，以捕食其他种类蓟马、螨虫、烟粉虱及介壳虫为食(Ananthakrishnan，1979)。随着商业贸易运输的发达，蓟马通过活体植株、干草、木材及船舶航行带来的泥土碎石运输而广泛扩散传播(Mound，1983)。西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)，又名苜蓿蓟马，其英文名为westernflowerthrips(WFT)，属于缨翅目(Thysanoptera)中锥尾亚目(Terebrantia)蓟马科(Thripidae)花蓟马属(Frankliniella)(Hood，1914：张生芳和赖凡，2003)。西花蓟马最早于1895年在美国西部发现并报道(Pergande，1895)，并于1955年在夏威夷岛爆发危害(Besher，1983)，其后扩散至新西兰(Mound&Walker，1982)、墨西哥(Guerra．sobrevila，1989)。伴随着花卉、蔬菜的国际运输，西花蓟马入侵荷兰、法国、意大利、比利时等欧洲国家(Rampinini，1987；Del&Gargani，1989；Heungenseta1．，1989)。1990年，在日本发现西花蓟马(Hayase&Fukuda，1991)；1994年，扩散至韩国(Chungeta1．，2001)。现在西花蓟马已经扩散至全球大部分国家和地区，并成为一种世界性害虫在世界各地造成危害(Robert&David，1995；Shipp&Zhang，1999)。如今，西花蓟马的分布地区包括中国、韩国、日本、美国、加拿大、墨西哥、危地马拉、哥斯达黎加、多米尼加共和国、委内瑞拉、哥伦比亚、秘鲁、巴西、智利、阿根廷、厄瓜多尔、圭亚那、乌拉圭、挪威、瑞典、芬兰、爱沙尼亚、波兰、德国、法国、英国、西班牙、意大利、匈牙利、土耳其、立陶宛、希腊、爱尔兰、俄罗斯、阿尔巴尼亚、马其顿、保加利亚、罗马尼亚、比利时、荷兰、丹麦、波兰、斯洛伐克、斯洛文尼亚、克罗地亚、以色列、奥地利、瑞士、捷克、塞浦路斯、科威特、肯尼亚、津巴布韦、南非、斯威士兰、澳大利亚、新西兰。欧洲及地中海地区的植物保护组织(EPPO)己将西花蓟马定为AZ级的检疫对象(EPPO，1997)。1996年，西花蓟马已经在中国大陆地区被列入植物检疫性害虫名单中，在2000年中国昆明国际花卉节上的缅甸盆景上检出(蒋小龙等，2001)。2000年，在我国台湾地区首次在马来西亚切花上发现入侵害虫西花蓟马，并将其列入检疫性害虫(吕荣章等，2000)。2003年，西花蓟马在我国北京地区的温室大棚中首次发现并造成严重危害(张友军等，2003)。从此，西花蓟马在我国北京、云南、山东、贵州、河南、江苏、浙江等东部沿海花卉贸易地区扩散，而在浙江省多在花卉市场中发现(张友军等，2005；郑长英，2007；李景柱等，2007；吕要斌等，2011)。戴霖等(2004)首次通过 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究利用地理信息系统ArcViewGIS分析评估了西花蓟马在中国的潜在适生分布范围，其适宜定殖在16．53oN～30．770N，97．85oE～121．9oE范围内的华南、西南等地区，潜在适宜定殖在25．430N～48．770N，75．230E～132．960E的我国西南、西北、华东、华中、华南及华北等绝大多数地区的28个省(自治区、直辖市)。周卫川(2006)的研究显示，我国的85．97％的地区为西花蓟马适生范围，其中77．62％的部分为潜在危险区和高度危险区。由此可见，我国的大多数地区均是西花蓟马的适宜分布区，因此，西花蓟马在我国很可能发生大规模扩散，这样必定会对我国的农林经济生产造成严重的威胁。图1西花蓟马在全球的分布(中国蓟马网)Fig．1Thewesternflowerthripsinglobaldistribution(http：Hwww．thrips．tom．cn)红色区域表示西花蓟马的分布地区．Theredareasrepresentthedistributionareasofthewesternflowerthrips 上篇文献综述第一章西花蓟马研究概况∥2“I，2tNJ6：Lxl72(U82tKD9图2我国西花蓟马的发生分布情况(中国蓟马网)Fig．2ThedistributionareasofFrankliniellaoccidentalis(Pergande)inChina(http：／／www．thrips．corn．cn)地图来源：底图下载于国家基础地理信息系统(http：／／nfgis．nsdi．gov．cn)提供的1：4000000地图数据。Basemapisdownloadedfromhttp：／／nfgis．nsdi．gov．cn／withthescaleofl：4000000．Fl羽lgl。Thesanleforthefollowingfigures．图3西花蓟马在我国的潜在适生区预测(中国蓟马网)Fig．3ThepotentialdistributionareasofFrankliniellaoccidentalis(Pergande)inChina(http：／／www．thrips．com．cn)3 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究二、西花蓟马的生物学特性及危害西花蓟马属于过渐变态类，需经过卵、一龄若虫、二龄若虫、三龄前蛹期、四龄伪蛹期、成虫六个发育阶段。西花蓟马的卵通常为半透明、肾形，长550gm左右，宽2509m左右。西花蓟马雌虫的产卵器呈锯状，在植物组织上形成切口将卵产入其中，通常肉眼不可见。一龄若虫孵化后为半透明或白色，之后逐步转变为黄色、橙色、紫色和深红色。虫体包括头、胸、腹，胸节有3节，腹节有11节，胸部长有3对足。二龄若虫为淡黄色，在其将要进入蛹期时通常会钻入寄主植物叶下或者土缝等遮蔽物中。西花蓟马的三龄前蛹期和四龄伪蛹期为停止取食期，此时胸足已经发育完全。前蛹的触角仍发育不完全，且具有翅芽。伪蛹经过前蛹蜕皮发育完成，此时已经具有发育完全的触角、伸长的胸足及扩展的翅芽，虫体与成虫大小相似。西花蓟马的成虫虫体较纤细，腹面平滑，具有两对翅，且在翅的前缘和后缘长有缨毛。通常雌虫的虫体比雄虫大，而且有三种色型(灰色、黑色、褐色)，而雄虫只有灰色。西花蓟马触角为8节，单眼间具有2根单眼鬃，每个复眼后具有1根眼后鬃，且单眼鬃与眼后鬃的长度相似，前胸背板具有前角鬃和侧缘鬃且两者长度相等，腹部第8节背部具有梳状后缘栉毛，末节端部雄性呈圆形，雌性呈圆锥形(朱秀娟，2011)。一头雌虫一生中可产卵130～230粒左右(Robb，1989)，取食花粉可以大大地提高其产卵量(Trichilo&Leigh，1986)。西花蓟马可以孤雌生殖，未交配的雌虫产卵孵化出的子代为单倍体的雄虫，交配后的雌虫产卵孵化出的子代为二倍体雌虫。西花蓟马的食性杂，寄主范围极其广泛，其寄主植物多达70个科500多种(农作物及花卉)，主要有茄科、豆科、十字花科、菊科、葫芦科等(Yudineta1．，1986)，比如花生、豌豆、芹菜、胡椒、生菜、甘蓝、甜椒、辣椒、黄瓜、番茄等蔬菜作物；苹果、葡萄、菠萝等水果：菊花、玫瑰、凤仙花、天竺葵、矮牵牛、大岩桐、兰花、大丽花、樱草、大丁草、非洲紫罗兰、马蹄莲、仙客来、秋海棠、金鱼草、唐菖蒲等花卉。西花蓟马存在寄主谱扩张现象，随着其向外扩散，寄主范围也在不断增加(Yudineta1．，1986)。因此，可以说，一般的蔬菜花卉作物均可作为西花蓟马的食物来源并经过适应成为其寄主。西花蓟马是锉吸式口器，通过口针刺破植物表皮细胞，吸食植物汁液，导致细胞的大量死亡。西花蓟马可以取食植物的叶、叶芽、花、花蕾、果等组织部位的汁液(Childers&Achor，1995)。西花蓟马刺吸取食可以造成嫩叶的畸形萎缩、发育迟缓，甚至会干枯凋零，随着植物的生长，自下而上危害叶片，被取食过后的叶片上呈现白色斑点状伤痕，叶片银化，甚至可见西花蓟马的黑色排泄物，严重时致使叶片皱缩，萎蔫，影响植物正常的光合作用及生长发育。西花蓟马对花粉的取食具有偏好性，危害花蕾可导致花瓣畸形卷皱，花蕊不能正常生长，严重时致使花朵不能正常开放；危害已经开放的鲜花后，会致使花瓣斑驳，花冠畸形，子房发育受阻，果实的产量和质量严重下降。西花蓟马取食果实汁液时，会使果实褪色、黄化甚至变色，表面形成疮疤，发生畸变，生长受阻，4 上篇文献综述第一章西花蓟马研究概况致使果实中所含有的营养和水分流失，从而降低果实的产量和质量，甚至有可能致使幼果脱落(Brodsgaard，1994；Lim&VanDriesche，2004；赵成银等，2011)。西花蓟马不仅可以通过取食、产卵对寄主造成直接危害，还能传播多种植物病毒造成间接危害(Tommasini&Maini，1995：Kirk，2002)。西花蓟马可以传播多种植物病毒，造成农作物的减产和经济损失；其中主要包括番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiensnecroticspotvirus，INSV)和番茄褪绿病毒(Tomatochloriticspotvirus，TCSV)等多种番茄斑萎病毒属Tospoviruses的植物病毒(Lewis，1997；W11itfieldeta1．，2005；Ohnishieta1．，2006：Reitz，2009)。西花蓟马是番茄斑萎病毒最有效的传播介体，随着西花蓟马的全球扩散传播，该病毒的发生和传播尤其严重。一般可以导致农作物严重减产损失30％．70％，甚至有可能绝收(Lim&VanDriesche，2004)。番茄斑萎病毒在世界各地受到广泛关注，属于世界十大农业病害之一，每年可造成全球$1000000的经济损失(Loebensteineta1．，2003)。由此可见，西花蓟马传播病毒造成的危害远远大于直接危害。三、西花蓟马的防治3．1植物检疫西花蓟马是一种外来入侵检疫性害虫，是通过大量的花卉蔬菜等活体植物寄主的运输调运而扩散传播的。所以，应该强化检疫，严格执行检疫制度，切断西花蓟马的来源，控制其传播范围，严格防止西花蓟马在我国的进一步的扩散。对于被检疫出的西花蓟马虫源应予以高温或火烧进行彻底销毁。3．2物理防治3．2．1利用颜色诱杀西花蓟马对蓝色、黄色和粉色均具有一定的趋向性，尤其对于蓝色趋性最强。利用这一点，我们可以制作并悬挂蓝色(波长422．7～539．8nm)粘虫板来诱杀和测报西花蓟马，减少成虫基数和产卵量，控制成虫的扩散(龚佑辉等，2010；张友军等，2005)。也有研究表明，林茂牌黄色捕虫板与蓝色粘虫板(波长437．5nm)的诱虫量亦最为接近(任洁等，2008)。在西花蓟马成虫盛期，这两种粘虫板在西花蓟马的控制中均能取得良好的效果。3．2．2利用植物诱虫诱虫植物其实是该害虫最为偏好性的寄主，利用这一特点，可以将害虫吸引至诱虫植物上，从而远离其他受保护植物。这种防治方法环保、简便、易于就地取材，而且效果非常明显高效。一般这种方法多用在一些园艺害虫的防治上(Hokkanen，1991；Javaid&Joshi，1995：Shelton&Badenes，2006)。有研究表明，开放的花朵对于西花蓟马具有较强的吸引力。所以利用开放的黄色德兰士瓦雏菊或菊花(Dendranthenagrandiflora 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究Tzvelev)可以大大吸引西花蓟马成虫去取食(Buitenhuisetal．，2007)。3．2．3其他有研究表明，西花蓟马的适温范围19～28℃内，最适湿度为70％左右(李景柱等，2007；李景柱等，2011)。过高的温度和湿度会使得西花蓟马的活动受到极大的抑制，甚至会导致死亡(宁钦广和王鹏，2012)。因此，可以采用高温(45．55℃，4-5h)高湿对蔬菜定植之前的大棚进行闷棚消毒防控西花蓟马(李景柱等，2007：陈志杰等，2008)。对于西花蓟马的物理防治还应该应注意田间清洁与打扫，对于种植的农作物加以覆盖地膜，不仅可以对作物进行防冻保温，还可以防止西花蓟马化蛹进入土壤和和植物碎屑中越冬。其次，加盖防虫网亦可以控制西花蓟马随风传播，从而有效地防控西花蓟马。3．3化学防治化学防治一直是害虫防治中效率较高、使用最多的防治方法。研究表明，经过多重筛选，确定48％乐斯本(EC)、20％啶虫脒、70％艾美乐(WP)、10％除尽(SC)、2．5％菜喜(SC)、2．5％多杀菌素(SC)、1％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(EC)、1．8％阿维菌素(EC)、0．3％印楝素(EC)可以作为有效防治西花蓟马的田间用药(Lewis，1997；肖长坤等，2006：吕要斌等，2011；张安盛等，2012)。其中由微生物代谢物质制成的2．5％菜喜(SC)，新型高效低毒生物杀虫剂0．3％印楝素(EC)，1％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(EC)以及1．8％阿维菌素(EC)不仅对西花蓟马的防治效果强，而且对环境不会产生危害。尤其是2．5％菜喜(SC)这类药剂高效安全，安全采收期只有2h，特别适用于无公害蔬菜的生产(肖长坤等，2006)。但是，由于西花蓟马发育历期短，种群增长迅速，隐蔽性强，易产生抗药性，化学防治的效果不是很理想。为了防止西花蓟马的抗药性的产生，各种药剂应交替轮换使用(沈宝明等，2012)。3．4生物防治化学防治虽然效果明显迅速，但是容易导致农药残留、环境污染、西花蓟马的抗药性及伤害天敌等问题。所以，在化学防治中，配合使用生物防治显得十分必要。西花蓟马的天敌种类较多，约有60种，常见的有螨类、蝽类、寄生蜂类、病原线虫及寄生性真菌等(潘志萍等，2007)。3．4．1捕食性螨类捕食西花蓟马的螨类主要属于钝绥螨类。目前应用广泛、研究较多的有木槿真绥螨Amblyseius．Hibisci、钝绥螨A．degenerans和黄瓜钝绥螨(黄瓜新小绥螨)A．cucumeris。在不同的环境情况下，可以利用不同种类螨防治西花蓟马。对于1~2龄的西花蓟马，可以采用黄瓜钝绥螨A．cucumeris、巴氏钝绥螨A．barkeri和高山小盲绥螨Thphlodromipsmontdorensis进行防治(Steinereta1．，2003；张金平等，2008；赵成银等，2011)。对于钻入土壤进入化蛹期的西花蓟马，可以采用土栖型的捕食性螨尖狭下盾螨Hypoaspisaculeifer和兵下盾螨Hmiles进行防治(Berndteta1．，2004)。木槿真绥螨A．hibisci、钝绥螨A．degenerans、瑞氏小盲螨Zswirskii、草地小盲绥螨Zlimonicus在短日照的情况 上篇文献综述第一章西花蓟马研究概况下完全非滞育，可以用于秋冬季温室种植中防治西花蓟马(VanHouteneta1．，1995；VanHouten，1996；VanHouteneta1．，2005)。其中草地小盲绥螨Zlimonicus对低湿环境较为敏感，所以对于西花蓟马的防治效果会随着季节的变更而有所波动(VanHoutenetal．，1995；Messelinketal．，2006)。另外，对西花蓟马具有较好的捕食效果的螨类还有加州钝绥螨A．californicus、安德森钝绥螨彳：andersoni、Zontdorensis、沃氏钝绥螨A．womersleyi、卵圆真绥螨Euseiusovalis、草茎真绥螨Es咖ulatus、橘真绥螨Ecitri、智利小植绥螨PytoseiuluspersimiliS、芬兰真绥螨E．finlandicus等(Blaeser&Sengonca，2001；Steineretal．，2002；方小瑞等，2008)。3．4．2捕食性蝽类捕食西花蓟马的蝽类有许多，主要有淡翅小花蝽Oriustantillus、南方小花蝽D．strigicollis、微小花蝽0．minutus、东亚小花蝽0．sauteri、肩毛小花蝽0．niger、狡小花蝽0．insidiosus、刺突小花蝽0．armatus、异样小花蝽D．heterorioides、无毛小花蝽D．Laevigtus、大臀小花蝽0．majuscules、浅白翅小花蝽D．albidipennis、暗小花蝽D．tristicolor、盲蝽Dicyphustamaninii、姬蝽Nabisspp．、暗黑长脊盲蝽Macrolophuscaliginosus、小林原花蝽Anthocorisnemorum(张嫡等，2010)。国外对花蝽类的研究较为成熟，已经将多种小花蝽应用于西花蓟马的防治。在我国东亚小花蝽0．sauteri的分布广泛，数量较多，国内对其的研究也相对较多。已有研究表明，东亚小花蝽D．sauteri的若虫和成虫对西花蓟马的成虫均具有较高的捕食潜能，对可有效控制西花蓟马(张安盛等，200To：张安盛等，200％)。然而，这种捕食性的昆虫成虫之间的存在竞争现象。在西花蓟马成虫密度相同的情况下，随着东亚小花蝽O．sauteri的数量的增加，其捕食量和捕食率会随之减少和降低(张安盛等，2007d)。利用东亚小花蝽0．sauteri的捕食特性，在田间释放适当数量的东亚小花蝽Dsauteri可以将西花蓟马有效地控制在经济阈值以内。我们可以将捕食性螨和花蝽结合起来，在田间同时释放这两类天敌，对西花蓟马的防治会达到较为理想的效果。3．4．3寄生蜂类西花蓟马的寄生蜂天敌有多种，大多属于小蜂总科(潘志萍等，2007)。寄生蜂大多通过产卵寄生在西花蓟马的卵或若虫的体内，利用西花蓟马的营养养育子代。现今我们发现的西花蓟马天敌寄生蜂类包括葱蓟马姬小蜂Ceranisusmenes、美洲蓟马姬小蜂Camericensis、鳞斑蓟马姬小蜂Clepidoms、淡红蓟马姬小蜂Crusselli、卢曼蓟马姬小蜂Cloonansi、莎氏戈姬小蜂Goetheanashakespearei、疑戈姬小蜂Gincerta、印度足栖姬小蜂Podibiusindicus、缨翅赤眼蜂Megaphragmaspp．等(Loomanseta1．，1992：Loomans&Lenteren，l996)。3．4．4寄生性真菌类寄生性真菌是通过接触虫体体壁，从而使其感染病变来控制害虫。这类天敌对西花 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究蓟马的防治效果明显，主要是由于其靶标专一、选择性较强。已知的西花蓟马寄生性真菌有绿僵菌Metariziumanisopliae、球孢白僵菌Beauveriabassiana、蜡蚧轮枝菌VerticilliumlecaniiZimm、小孢新接合霉Neozyhitesparvispora、多毛孢属HirsutellaPatouillard、玫瑰色拟青霉Paecilomycesfumosoroseus、土壤放线菌等(Hall，1992；Svetlanaetal．，2008)。这些真菌类制成的生物农药既安全环保，防治效果又好。其中，以金龟子绿僵菌制成的生物制剂可以有效的防治各个虫态的西花蓟马(Manianiaeta1．，2002)。球孢白僵菌在西花蓟马的生物防治中的应用也较多。分别由轮枝菌和土壤放线菌有氧发酵产物衍生制成的两种生物杀虫剂，选择性高，对西花蓟马的防治效果可以达到90％(Schoonejartseta1．，2001)。3．4．5病原线虫类．病原线虫一般都是栖息于土壤中，因此，其主要是防治蛹期在土壤中栖息的西花蓟马。常用的防治西花蓟马的为尼氏蓟马线虫Thripinemanicklewoodi和嗜菌异小杆线虫Heterorhabdit&bacteriophora(aergh＆Blance，l997；Arthurs&Heinz，2003)。这种防治方法在国外已经有所使用，但是在我国虽然也有大量生产线虫防治害虫，但是将病原线虫用于防治西花蓟马仍处于研究技术方法阶段，并未得到生产应用。3．4．6其他天敌类西花蓟马的除了以上的天敌外，还存在其他的天敌种类，比如中华草蛉的幼虫、捕虱管蓟马Aleurodothripsfasciapennis、塔六点蓟马ScolothripstakahashiiPriesner、蚁形隐翅甲Athetacoriaria等(Teulon，1993；Cameyeta1．，2002；张安盛等，2007a)。将这些不同的天敌联合应用于防治西花蓟马，既安全有效，又可以确保西花蓟马不会产生抗药性。四、展望西花蓟马从被发现有报道以来已经有100多年的历史，国外对西花蓟马的研究成熟而深入。从西花蓟马入侵我国10年间，我国科学家对西花蓟马的研究也仅仅处于起步阶段。虽然西花蓟马个体小，隐蔽性强，未在全国扩散开来，但是，我国大部分地区均属于西花蓟马的适生区，其直接危害和传播病毒会给农业生产带来严重的危害。因此，我们应该对西花蓟马提高警惕，加强检疫并积极研究开发其防治措施。 上篇文献综述第二章番茄斑萎病毒研宄概况第二章番茄斑萎病毒研究概况一、病毒的分类番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus，属于布尼亚病毒科Bnuyaviridae番茄斑萎病毒属Tospovims。布尼亚病毒科共有5个属，其中有4个属为动物病毒，而番茄斑萎病毒属是该科唯一一个侵染植物的病毒属(洪健等，2001)。番茄斑萎病毒属共发现20个种，其中确定种为16个，暂定种为4个(Campbelleta1．，2009)。由于番茄斑萎病毒是番茄斑萎病毒属中第一个发现的病毒种，所以以此来命名该属(Franckieta1．，1992)。二、寄主及危害番茄斑萎病毒自1915年在澳大利亚首次发现以来，己在世界范围内广泛分布，主要分布在热带、亚热带和温带地区，给世界农业生产造成了严重的经济损失(Brittlebank，1919)。鉴于其危害严重，已经被列入世界十大危害最大的植物病毒(Kirk，2001)。该病毒的寄主范围广泛，可侵染82个科，1090多种植物，包括烟草、花卉、蔬菜等园艺观赏植物和大多数农作物(Whitfieldeta1．，2005)。感染番茄斑萎病毒的植株的叶片会出现镶脉、叶脉坏死、死斑、同心环纹斑、叶片畸形、叶面皱缩，植株整体异常矮化等典型症状。不仅叶片上症状明显，花器上也会出现死斑，产生畸形花，茎秆和根部会出现坏死现象(刘雅婷等，2009)。严重时会导致整株死亡，造成严重的经济损失。1944年，在我国成都的番茄上发现番茄斑萎病，1984年，在调查南方的花生病害时又发现TSwV引起的新的病害(许泽永等，1989)。随后在四川的番茄和烟草上，内蒙古的甜菜上均有发现(季良，1991；姚革，1992)。2000年，番茄斑萎病毒在云南烟区已经广泛的分布并造成严重危害，局部地区的损失达到60％以上(张仲凯等，2000)。三、结构与检测1965年，人们首次成功将TSwV从大丽菊中分离出，对TSWV的研究也随之更加深入。番茄斑萎病毒是一种RNA病毒，由SRNA(2916nt)，MRNA(4821nt)和LRNA(8897nt)3条单链组成。病毒粒子结构为直径80～110nin的球形，外层覆膜包裹。SRNA和MRNA为双义RNA。其中MRNA包含有2个开放式阅读框(openreading鱼dlTles，ORFs)，一个编码非结构蛋白，一个编码前体糖蛋白G1和G2(Kormelinketa1．，1992)。SRNA亦包含有2个开放式阅读框(openreadingframes，ORFs)，一个编码非结构蛋白，一个编码核壳体蛋白(nucleocapsidprotein)(DeHaaneta1．，1990)。LRNA为负义RNA，含有一个大的开放式阅读框(openreadingflames，ORFs)，主要是编码RNA依赖性聚合酶蛋白(L蛋白)(DeHaaneta1．，1991)。对于番茄斑萎病毒的检测，国内外已经研究了多种方法。上世纪80年代初，国外已经制备了TSWV的多抗血清，因此发展了检测该病毒的一系列方法。之后，Sherwood等在此基础上又制备出了其单克隆抗体和酶联免疫反应的检测方法(Sherwoodeta1．，1989)。此后，随着分子生物学的发展，RT-PCR、实时荧光定量PCR(RealtimePCR)被 硕士学位论文硒花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究用于检测TSWv，这些方法简单且灵敏度较高(Mumfordeta1．，1994：Robe,seta1．，2000)。电镜也是检测TSWV的一种可靠方法。S片段2916nt3’5’■————■—■■—■——■—■————iTSWVM片段482IntL片段8897m3‘5。3’5嘿警t蕊蠼霉瞄黔34kD8图4番茄斑萎病毒基因组及其产物(洪键等，2001)Fig．4GenomeofTSWVanditsproducts四、传播媒介与防治措施番茄斑萎病毒的危害遍布世界各地，是重要的世界经济作物的病毒群之一。番茄斑萎病毒的传播介体是蓟马，目前已有报道的有西花蓟马Frankliniellaoccidentalis、花蓟马Fintonsa、棉芽蓟马Fschaltzei、褐花蓟马Ffusca、佛罗里达花蓟马Fbispinosa、首花蓟马Fcephalica、禾花蓟马Ftenucicornis、烟蓟马Thripstabaci、棕黄蓟马Zpalmi、豆蓟马Zsetosus、茶黄蓟马Scirtothripsdorsalia及Zmoultoni共12种蓟马，前8种蓟马己经进过证实和认可，其中，西花蓟马是其最主要且有效的传播媒介昆虫(Wijkampet口正，1995：Ullmaneta1．，1997；Webbeta1．，1998；Whitfieldeta1．，2005：Pappueta1．，2009)。随着西花蓟马的传播危害，番茄斑萎病毒也随之危害加剧。目前，对于番茄斑萎病毒的防治没有直接有效的方法，通过切断病毒媒介这一途径是最根本的方法。防治西花蓟马等传播媒介即可防治该病毒的传播和扩散。有研究表明，西花蓟马的一龄若虫取食带病植株即可获毒，病毒随着植物汁液进入虫体中肠进行复制，获毒能力随着西花蓟马年龄的增加而降低，蛹期和成虫期不能获毒(Ullmaneta1．，1992；Wijkampeta1．，1993)，二龄若虫和成虫可以传播病毒(Kritzman∥a1．，2002)。在成虫传毒过程中，TSWV从中肠上表皮组织进入中肠肌肉细胞和韧带，再进入唾液腺体，通过口针取食释放的唾液使病毒侵入寄主植物的细胞中(Nagataeta1．，2002)。Kritzman等(2002)认为西花蓟马进行传播TSwV的必要条件是病毒必须到达唾液腺体中。而若虫最初的获毒量、中肠中的复制量以及病毒在蓟马体内的循环受阻情况决定西花蓟马传播TSWV的能力(Nagataetal．，2004)。五、展望目前，对于番茄斑萎病毒没有有效的防治手段，仍然主要依靠对其传播媒介的防治来达到对该病的防治效果。西花蓟马是TSWV最有效的传播者。西花蓟马在我国的北京、云南等地已经建立稳定种群，而且经过预测我国的大部分地区都是西花蓟马的潜在适生区，所以，对于西花蓟马的扩散而带来的番茄萎病毒病需要给予足够的重视。通过10 上篇文献综述第二章番茄斑萎病毒研究概况研究西花蓟马的生活和取食习性，传毒机制，传毒效率，生理机制等方面，为番茄斑萎病毒的防治提供理论依据和参考。 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究第三章EPG技术在昆虫研究中的概况一、EPG技术的发明刺吸电位(electricalpenetrationgraph，EPG)技术是一种较为新型的技术。对于大型咀嚼式口器的昆虫的取食，我们易于通过观察植物的受损情况来间接判断昆虫的取食量，以及对植物的喜好度。而对于小型刺吸式昆虫取食过程则无从观察判断。1964年，美国加州大学昆虫学家Mclean和Kinsey设计制作了世界上第一台监测取食行为的电生理仪器，用于观察刺吸式昆虫(蚜虫)在植物组织中的取食刺探行为(Mclean&Kinsey，1964)。但是由于仪器设计方面存在的缺陷和技术的缺乏，这种技术方法未能发展推广。经过20多年，许多研究者的努力研究和改进，Tjallingii的工作终于取得了巨大的成功(Schaefers，1966：Brown&Holbrook，1976)。他所设计的直流刺吸电位仪(directcurrentelectricalpenetrationgraph，DC．EPG)采用直流回路系统和109Q输入电阻，使之输出的波谱更加精准、细致，且重复性很高(Tjallingii，1978)。二、EPG技术的适用范围理论上来说，EPG技术适用于所有刺吸式昆虫的研究，包括吸血昆(或蜱螨)等与动物(或人)的关系的研究。但是，由于技术和操作上的局限性，目前，这项技术仅应用于刺吸式昆虫与植物的关系方面的研究，如同翅目和半翅目昆虫、植食性螨类、锉吸式口器昆虫(蓟马)。EPG技术目前应用于刺吸式昆虫研究的三个方面。第一，用于观察刺吸式昆虫的取食行为。用这种方法可以准确得知昆虫在记录阶段何时刺探，何时吸食食物，吸食持续时间，刺探次数，以及开始和结束的时间等方面的信息。这些信息可以直观的反映出西花蓟马的取食行为。而且，蔗糖或水等人工饲料也可以代替寄主植物用来进行昆虫EPG记录(Kindtetal．，2003)。第二，用于研究刺吸式昆虫的传播病毒的机制。有研究表明，昆虫的某些取食波形情况的改变可以反映出其自身带毒情况及寄主植物的染毒程度(MartinetaL，1997)。Stafford(2011)等的研究表明，感毒的西花蓟马雄虫的取食频率是健康西花蓟马雄虫的3倍，这也增加了其传毒机率。第三，可以研究植物的诱导防御反应机理和植物对刺吸式昆虫抗性机制。通过EPG记录的波形数据，得出昆虫在取食时各波形的顺序，持续时间，取食次数等信息。利用这些信息，我们可以推断出昆虫进食的时间段，对寄主的适应性及喜好程度等相关信息。从而可以从植物组织水平上说明其抗性或诱食方面的机制反应(Eeninketa1．，1984；Willeta1．，2009：Yineta1．，2010，汤清波等，2011)。三、EPG波形的生物学意义植食性刺吸式昆虫根据取食植物部位的不同可以分为3类：①吸食韧皮部：胸喙亚目昆虫，如蚜虫、粉虱、介壳虫、蝽类等；②吸食木质部：头喙亚目昆虫，如蝉、叶蝉等：③吸食叶肉：缨翅目蓟马类，部分叶蝉类(汤清波等，2011)。 上篇文献综述第三章EPG技术在昆虫研究中的概况以蚜虫取食为例，各波形的生物学意义如下(雷宏和徐汝梅，1996)。np波：指口针未刺入植物时的电压状态A波：口针接触刺探植物组织表面，频率不稳，幅度较大，一般为5～15Hz。此时伴随有水溶性唾液分泌(Tjallingii，1988)。B波：紧随A波，口针位于表皮或叶肉组织，频率较慢。此时伴随有凝胶型唾液的分泌，可以形成保护口针的唾液鞘(Tjallingii，1988)。C波：是所有波形中最为复杂的波形。蚜虫刺探食物，口针启动，位于叶肉细胞间隙或韧皮部筛分子外部，是一种口针通道活动。pd波：反映了口针刺破细胞膜时所测的膜内外电势落差，是口针刺入叶肉细胞，吸食细胞内含物。F波：频率为11～16Hz，指口针遇到机械阻力，是口针在细胞膜外的运动。E1波：频率稳定，口针刺入韧皮部筛管，并将水溶性唾液注入筛管中。E2波：口针从韧皮部筛管中被动吸取汁液。G波：频率为4～6Hz，是一种胞外水平的波形，口针到达木质部，并且在木质部中主动吸取汁液。其中A波、B波、C波、pd波和F波属于刺探路径阶段，El和E2属于韧皮部阶段，G波属于木质部阶段。除了以上典型的几种波形外，一些刺吸式昆虫还存在其他波形。如温室白粉虱存在H波和L波，而锉吸式口器的蓟马则存在P波，S波，Q波、R波及x波(胡想顺等，2006)。P波指刺探开始，S波指头部重复性点头振动，Q波指上颚口针的插入，分泌唾液，细胞受损，R波指摄取汁液，X波至今仍无具体的生物学解释(Kindteta1．，2003：Harrewijnetal．，1996)。四、EPG技术展望与前景刺吸式昆虫的一些基本波形对应的行为虽然已经建立，但是，仍然存在一些波形的生物学意义不明的现象，有待于我们进一步的研究与完善，如西花蓟马的X波(Kindteta1．，2003)。昆虫的取食行为是一种复杂的行为，在取食不同寄主时有可能会出现不同的波形(胡想顺等，2006)。EPG技术采用金属丝粘连昆虫，虽然这些金属丝线足够细而轻巧，但它限制昆虫大范围地自由活动，所以产生的波形不能正确反映自然状态下昆虫的取食活动(Caillaud，1999)。因此，需要加快研究和开发新技术新材料来取代这种金属线，这种技术的成功也会给大型昆虫的EPG应用带来希望。EPG技术已经应用于50多种昆虫的刺探取食研究(罗晨等，2005)，伴随着其他辅助研究及EPG技术的不断完善，对于植食性昆虫的获毒、传毒、抗药性，植物的耐早性、耐寒性、抗虫性以及防治策略等机制的研究将会更有成效。 下月嗲rE：】／丽研究’内容 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究第一章西花蓟马传毒效率的测定西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)和番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)是两种世界范围内危害较大的昆虫和病毒，严重影响农作物的产量、质量和观赏经济价值(Tommasini&Maini，1995；鼬rk，2002)。而且，西花蓟马作为番茄斑萎病毒最主要的传播媒介这一特点将两者紧密的联系在一起(Wijkampeta1．，1995)。所以，防治西花蓟马相当于防治番茄斑萎病毒。为明确西花蓟马传播番茄斑萎病毒的能力和效率。本实验采用叶碟法，观察西花蓟马在4种寄主植物(番茄、辣椒、曼陀罗和矮牵牛)上的传毒效率的差异，从而明确寄主植物的改变对西花蓟马传播TSwV有无显著的影响。这为西花蓟马的防治及番茄斑萎病毒的发生和传播提供理论依据及参考价值。1材料与方法1．1供试昆虫西花蓟马于2007年采自北京，以四季豆Phaseolus训和廊L．作为寄主饲养于人工气候箱建立实验种群(图1．1)。西花蓟马己在室内连续饲养120代以上。饲养条件：温度为27+1℃，相对湿度为75％士5％，光照周期为L：D=I6：8。1．2供试病毒番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus，TSWV)：从云南田间采集发病症状明显的辣椒果实，经过快速检测试剂盒检测之后，一部分置于．70。C冰箱保存，一部分通过摩擦接种在烟草枯斑寄主(三生烟)Nicotianatobacumvat．SamsunNN上分离病原，然后挑取单个枯斑转接于黄花烟NicotianalrusticaL．上繁殖病毒，再将病毒接到健康曼陀罗植株(3～5片真叶)上。1．3供试植株1．3．1健康植株的获得番茄LycopersiconesculentumM．品种为合作903(上海番茄研究所)，购于杭州市江干区杭丰蔬菜良种研究所；辣椒CapsicumannuumL．品种为杭州鸡爪x吉林早椒，购于杭州市江干区杭丰蔬菜良种研究所；曼陀罗DaturastramoniumL．，采于河南，自收种子；矮牵牛PetuniahybridaⅥ1111，+购于杭州市江干区杭丰蔬菜良种研究所。将上述植物种子分别播种于控温、控湿、无虫的玻璃温室中，温度27：t：1℃，相对湿度750／社5％，光照周期L：D=12：12，自然光且辅以反射型日光色镝灯光(JLZ400D／F，22V，400W)，培养健康植株，待长出5-6片(矮牵牛为8～10片)真叶时(约3-5周)供试。培养植株所用营养土为珍珠岩(直径2~4mm)、泥炭、有机肥(苜蓿+牛粪)、蛭石按照1：10：10：10(体积比)的比例混合而成的。14 下篇研究内容第一章西花蓟马传毒效率的测定1．3．2机械接毒植株的获得采用人工摩擦的方法接种番茄斑萎病毒(TSWV)。选取感毒症状明显的曼陀罗植株，剪取病毒叶片1g，加入10ml的接种缓冲液(0．01mNaPO。，PH7．0)，将叶片碾碎制成接种液。取健康曼陀罗植株(3～5片真叶)，在其顶端3片真叶上面洒上金刚砂粉末(约500目)，利用棉签沾取配好的接种液沿着叶脉伸展的方向轻轻地摩擦叶片，约过10min后再用清水冲洗叶片表面，在27+1℃左右的环境下，约2~3周即可观察到明显的发病症状。TSWV明显的发病症状：叶片出现明显色斑，萎黄色伦纹和萎黄色镶嵌，生长受阻，并出现畸形，经过快速检测试剂盒检测确认其为TSWv发病植株。1．4西花蓟马获毒将感染TSWV病毒症状明显的曼陀罗和1000头左右健康的西花蓟马成虫一起置于纱罩笼子中(图1．2)。让西花蓟马成虫取食感毒曼陀罗产卵2天后，将曼陀罗从笼子中取出，去除西花蓟马成虫，在温室中放置3天左右待卵孵化成一龄若虫。待一龄若虫在感染TSWV病毒的曼陀罗上取食2天获毒以后，将获毒后的若虫收集至玻璃缸，用健康豆角饲喂。待到蛹期时，将西花蓟马放入装有滤纸片的1．5ml离心管中单头饲养至成虫，用毛笔蘸水将滤纸片打湿，保持离心管中的环境湿润，使叶片保持新鲜。实验条件：温度为27士1℃，相对湿度为750／社5％，光照周期为L：D=16：8。1．5西花蓟马传毒待感毒西花蓟马羽化一天后，单独分别饲喂健康曼陀罗叶碟、辣椒叶碟、番茄叶碟、矮牵牛叶碟48h(图1．3)。一组处理为30头成虫，每组3次重复，共4组处理。圆形叶碟直径为131Ttm。将蓟马取食48h后的叶碟放入漂浮在装有灭菌水的24孔板中，每孔装有1IIll灭菌水，在27℃下漂浮3天(图1．4)。将传毒后的蓟马成虫收集存放于．700C冰箱中，以便之后用于检测。3天之后取出叶碟，用于ELISA检测。实验条件：温度为27土1℃，相对湿度为75％士5％，光照周期为L：D=16：8。1．6ELISA检测1．6．1双抗夹心法试剂和药品特异性抗体球蛋白，酶标记结合抗体，包被缓冲液，封闭液，洗涤缓冲液(PBST)，常规提取液，PNPP，均购自安德珍生物公司(AdgenPhytodiagnostics)。1．6．2双抗夹心法(1)包被缓冲液来稀释特异性抗体球蛋白即一抗，特异性抗体：包被液=l：1000，在96孔酶标板中每孔加入稀释后的一抗缓冲液70“l；(2)37℃温育4h；(3)利用PBST洗涤缓冲液在洗板机上洗板3次，每次洗涤时间间隔为lmin，最后将液体抽干；(4)将每片叶碟加入160山常规提取液磨碎，12000rpm离心10mini(5)取样品上清液，每孔加入70”l，重复2孔； 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究(6)4。C温育过夜(至少16h)：(7)重复步骤(3)；(8)用封闭液稀释酶标记结合抗体即二抗，酶标记结合抗体：封闭液=l：1000，每孔中加入稀释后的二抗缓冲液70“l；(9)37℃温育lh；(10)利用PBST洗涤缓冲液在洗板机上洗板4次，以确保完全将可移动的酶标记结合抗体洗涤干净，每次洗涤时间间隔为1min，最后将液体抽干；(11)配制显色液：底物缓冲液中加入PNPP，每ml底物缓冲液中加入1mgPNPP，每孔加入70nl显色液：(12)将96孔酶标板用锡箔纸包严，在黑暗环境中室温温育1h；(13)利用酶标仪读取405IⅡn下的吸光值若样品两孔的吸光值均大于阴性对照平均值+3木阴性对照标准差，则该样品为阳性，否则即为阴性(Wijkampetat，1995)。1．7数据分析每组处理30头，3次重复，共4组处理。记录每组中ELISA检测成阳性的数量，阳性数量与总数的百分比即可作为传毒的能力。利用DPS数据处理系统(唐启义，浙江大学昆虫研究所)进行数据的方差分析、多重比较(Tukey法，P<0．05)。数据统计分析过程中将阳性所占的百分比转换为反正弦平方根。2．结果与分析表l—l是西花蓟马在四种寄主植物上的传毒效率的比较。从表中可以看出，西花蓟马在4种寄主植物上的传毒能力不存在显著差异。西花蓟马的传毒能力均小于30％。 下篇研究内容第一章西花蓟马传毒效率的测定表1．1西花蓟马在四种寄主植物上的传毒效率Table1-1Transmissionefficiencyofwesternflowerthrips(Frankliniellaoccidentalis)onfourhostplants寄主植物重复数阳性个数总数传毒效率NumberofPositiveTotalTransmissionHostplant—replicationnumberefficiency均值士标准差Mean-4-SD番茄Tomato辣椒Pepper曼陀罗Stramonium矮牵牛Petunia同列不同字母表示差异显著(尺0．05，Tukey法)。Differentlettersincolumnmeansignificantdifferencesbetweentreatments(P<0．05，Tukey’Stest)．番茄、辣椒、曼陀罗和矮牵牛均属于茄科植物，是西花蓟马不同适宜性的寄主。Zhang等(2007)的研究表明，与辣椒相比，番茄为西花蓟马的较适宜寄主。那么，从表l一1可以看出，西花蓟马在不同适宜性的寄主植物上传播TSWV的效率是相似的。3讨论根据国外许多专家学者的研究发现，有12种蓟马可以传播番茄斑萎病毒(TSWV)，但经进过证实，西花蓟马是番茄斑萎病毒的主要传播载体(Wijkampetal．，1995；Ullmaneta1．，1997；Webbeta1．，1998；Whitfieldeta1．，2005)。本研究结果显示，可能只有10％～30％左右的西花蓟马在获取番茄斑萎病毒(TSWV)后可成功传播使寄主植物发病。即说明，能够成功获毒并且成功传毒的西花蓟马可能为10％～30％左右。而不同的寄主植物之间发病的概率显示并无显著性差异，表明西花蓟马在不同适宜性的寄主植物上传播该病毒的效率是相似的，并不会因为其对寄主植物的偏好性和适应性而有显著差别。所以，西花蓟马传播番茄斑萎病毒的效率可能不会因为寄主植物种类的不同而有显著差别。西花蓟马是一种寄主范围很广的昆虫，其寄主包括各类蔬菜、花卉、水果等，甚至似眠％慨％％似％似慨用a用小a一讲DJ9M强拍怕2"M，加拍M"如∞如如∞∞如如如如如勰 硕?i：学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究包括一些杂草。而本实验的四种寄主植物均属于茄科植物，并不能代表西花蓟马所有的寄主种类，因此存在一些缺陷。在今后的实验中可以增加更多西花蓟马的寄主植物种类，使结果更加全面完善，具有广泛的利用和参考价值，为蓟马的防治提供有力的依据。图1．1蓟马的饲养Fig．1—1Thripsrearing醚■l图1．2西花蓟马获毒Fig．1-2AcquisitionaccessofWFT图1-3西花蓟马传毒Fig．1-3InoculationaccessofWFT 下篇研究内容第一章西花蓟马传毒效率的测定图1．4叶片漂浮Fig．1—4Leaffloating19 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究第二章EPG分析非感毒西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为西花蓟马Frankliniellaoccidental括(Pergande)属于缨翅目(Thysanoptera)，蓟马科(Thripidae)，花蓟马属(Franlliniella)，最早于1895年在美国西部发现并报道(Pergande，1895)，2003年我国首次报道并在北京发生造成严重危害(张友军等，2003)。作为一种世界性害虫，西花蓟马的食性杂，寄主范围广，目前已知的寄主植物多达500余种(多为农作物及花卉)，而且其寄主植物种类还在持续增加(吕要斌等，2004)。西花蓟马的危害包括锉吸植物的茎、叶、花、果造成直接危害和传播番茄斑萎病毒属多种病毒造成间接危害(wijkampetal．，1995；朱秀娟等，2011)。西花蓟马虽然寄主植物广，但对不同寄主植物的偏好性和适应性不同。已有研究表明在豆科植物上，西花蓟马各虫态均偏好于四季豆(李景柱等，2010)；而在茄科植物上，各虫态的西花蓟马偏好性为茄子>番茄>辣椒(钟锋等，2010)。西花蓟马的发育历期在四季豆上显著短于辣椒，在黄瓜上显著短于茄子(裴昌莹和郑长英，2010)。西花蓟马雌虫对不同寄主的产卵选择性为茄子>黄瓜>辣椒>番茄，在不同寄主叶片上的产卵量也有差异，为甘蓝>莴苣>黄瓜>大蒜(裴昌莹和郑长英，2011；曹宇等，2012)。有些昆虫的取食行为与其对不同寄主植物的适应性是相关的，如研究表明B型烟粉虱BemisiatabaciB．biotype在甘蓝、西葫芦和辣椒上取食，从刺探开始到第一个E1波出现时，在三种寄主植物上的非取食刺探时间存在显著差异，为甘蓝<西葫芦<辣椒，表明B型烟粉虱在3种寄主上尝试性刺探时间存在差异；在甘蓝上第一次韧皮部持续吸食后的刺探次数显著低于在西葫芦上的刺探次数，表明B型烟粉虱对甘蓝的韧皮部适应度大于对西葫芦的韧皮部(岳梅等，2006)。这与B型烟粉虱在甘蓝、西葫芦和辣椒上的适合度为甘蓝>西葫芦>辣椒的结果是一致的。棉蚜在黄瓜和马铃薯上的寄主转换时取食行为也不同，黄瓜上的棉蚜转到马铃薯上时出现了30％左右的E波，但马铃薯上的棉蚜转到黄瓜上后，其取食E波仅占4．43％，而寻食和刺探(np波和C波)占89．88％(刘向东等，2002)。此外媒介昆虫的取食行为与其传毒能力具有明显的相关性，植物病毒明显改变媒介昆虫的取食行为，从而增加媒介昆虫传播、扩散植物病毒的能力(Staffordeta1．，2011；Lilleta1．，2013)。西花蓟马是一种锉吸式昆虫，那么其在不寄主植物上的取食行为是否也同其对不同寄主植物的适应性相关?西花蓟马在适宜寄主上的取食是否更多?西花蓟马在不同寄主上传播植物病毒的能力是否与取食行为相关?本研究通过直流刺吸电位仪分析西花蓟马在四种寄主植物(番茄、辣椒、曼陀罗、矮牵牛)上的取食行为，以期为深入理解西花蓟马对不同寄主植物的适应性和西花蓟马在不同寄主植物上传播植物病毒的能力提供理论依据。20 下篇研究内容第二章EPG分析健康西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为1．材料与方法1．1供试材料1．1．1供试昆虫详见第一章1．1供试昆虫。选取羽化后第2～3天的非感毒西花蓟马成虫供试。1．1．2寄主植物健康番茄、辣椒、曼陀罗和矮牵牛，详见第一章1．3．1，选取长出3~4片(矮牵牛为5～6片)真叶的健康植株供试。1．2刺吸电位波形(electricalpenetrationgraph，EPG)记录方法采用四通道面板控制的直流电型(DC．EPG型)昆虫刺吸电位仪(Giga一4，EPGSystems，Wageningen，theNetherlands)进行取食行为观察。将一根细金丝线(长约2～3cm，直径12．5pm)的一头用银胶固定在蓟马的背板上，另一端用银胶固定在一根细铜丝(长约2cm)的一端，铜丝的另一端用锡粘合在一根铜钉(长约2cm，直径lmm)上，最后将铜钉置于昆虫电极。实验时，先将西花蓟马置于冰袋上，便于用银胶将其背板粘合在金丝线上。超细的金丝线既可导电，又可以使蓟马在叶面上相对自由的移动。然后将粘合好的蓟马置于平面上自由移动30～40min，使其适应粘合的金线。随后，将长约10cm的铜质棒状植物电极插入植株盆栽土壤中，再将粘好蓟马的铜钉插在对应的插槽内，蓟马置于健康植株顶端第2片真叶的叶面上，使其可以相对自由地移动。实验条件为温度27士1℃，相对湿度75％土5％，采用约600lx灯光光照强度，整个实验置于80X70X80cm接地的法拉第金属笼中，以避免噪音干扰。采用PROBE3．4软件(theEntomologyLaboratory，WageningenUniversity，TheNetherlands)对蓟马取食行为进行实验记录。1．3取食实验实验蓟马为西花蓟马成虫(成虫2～3d)，实验植株为曼陀罗(3,-4片真叶)、番茄(3~4片真叶)、辣椒(30片真叶)、矮牵牛(5-6片真叶)4种不同植株。每种植株为一个处理。每处理30株，分别记录15头雌虫和15头雄虫。EPG实验时将蓟马置于植株顶端第2片真叶的叶片表面。每次实验记录为8h，每头蓟马、每棵植株只可用于一次实验记录。1。4数据统计分析采用ANA软件对昆虫取食行为的数据统计分析。将每次记录的8h分为前4h和后4h两个时间阶段，在第一阶段即前4h随机选取lh，第二阶段即后4h随机选取1h进行数据分析(Staffordeta1．，2011)。西花蓟马在刺吸寄主植物时产生的波形主要包括四种：未刺探波(虽PBL)，非取食刺探波(noningestionprobes)，短取食波(short．ingestionprobes)和长取食波(10ng．ingestionprobes)(Staffordeta1．，2011)。对每1h的数据主要统计非取食刺探波、短取食波和长取食波的次数和总持续时间。利用DPS数据处理系统(唐启义，浙江大学昆虫研究所)对相同寄主上雌虫和雄虫之间相应参数比较进行t检验 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究(P<0．05)，对同一性别不同寄主植物之间相应参数比较进行方差分析，利用LSD法进行多重比较分析(尸k多∽卜芎。暑一≥∞一日g拦逞娶≈山翟8Q蓬怠S过跫窭KQ专JoIA∞IIQDⅨ暑勺uD皿一心D—DB-_L厘莒鞲票冥糕Y，鞲票墨叫州雅嚣寸撑甚警唧韫挂陋精馋特_【文琳妖畜g讲崧靼半艚懊榭王毪摆朔靛叫霎靶州临匣悟挂回氟糕目仪袋掣扑书匿 u△．o∞n书qnhH日n．on婚卅N．n一口。亨。刊N．oD一．一刊∞．oD∞岔．一州一．一_Bo．一刊N．一日N．∞吼寸剞卜．一n寸DN．吼卜一州n．卜n一日■o_【_【书A．o∞D_I．hN州吼，=qB小．onN刊心．卜NN^in．o∞一州∞．峪A一对卜．∞寸n州”．寸n∞o矗o．n∞_【州t，．一NN砖一．卜n”刊∞．n卜AD卜．甙NH荆卜．Nn一时o．ooN刊N．卜卜N—o．nn母州N．nno一^IBN．NNN州乱．西卜N对”．coN=Fc．寸吼N盘c三Q厶廿斟燃gTl隹oE窭豸除筮酬．I。厶口∞山娶鬃。葛90工樱帮∞。ooJ厶【I。吾∞suI_暑co一-oEo甾B】t1口一峭_o卜一∞一厘营锄邻甾半∞oD2A己I。13so∞III．8【Io—ho矗DuITIZ籁≤邻甾半∞002A嚣oio∞IJI-七。莒ko口。一_BJ；口一时_0工一∞一垦留蹈邻备骐Sa02A￡。=∞蟑∞5．芑。乓奶ooJ9cI暑暑Z藕≤妊娶璎计QD2(IIIo嚣∞o∞II—aoIIhoIIo一葛Jn勺一go工一∞一星茁躜器暴邻釜带∞。D2Ac。I；sas#IUo口-oJaDg暑Z巅《鞲蒺缸苷特警一qoJ盆。暑=一璺。卜一∞一垦曾器票蹈的Doo‘盆-o．Io093II—go卜籁愍鞲诿蹈崔旦A苗o}iS靶州稚∞p磊一Q苗oIIJn0JIIo>≥∞h善。暑一参。育旨逵§≈山遵8Q≤盘点过跫毽怠．o专JogI^时莒o∞口IpoD函￡-N∞一(I脚卜厘茁驻暴冥糕Y，隧票g叫州俯熏寸燃雹措唧犒撑目精落替￡-N僻一_II—盎o■o∞．o∞N州n．∞∞∞n．．鬲”．n对N．o州H．_【^肖寸．婚NN制N．nn_【时n．卜卜寸州o．寸一No对寸。口nH卅o．∞寸一心．N刊￡．n时甘．o水一．一日寸。书N．一时c．o州_【．一廿世燃IIInI口。善扫∞弧筮啾矗譬厶疑鬃撮帮∞∞(12A譬o；∞D∞口一．∞。。一一对；口一>一它II一-oIIo口对_I=口o∞—w-I∞>《一∞一垦譬霹睁缸盛半∞uD2qc。08∞￡l_芑o‘∞一母j口一≯一勺譬一hoIIo一甍．I；勺∞M．I譬Q>《一∞一垦茁霹}铝警蝌∞002口IIoo∞∞凹IIHIIo￡一母暑口一>一勺c—ko嚣。州=|—'Jj日Q∞—，Jo>《一∞一厘茁蜉湃鞲暴邻备拌芑三A苗o}{器靶州椎∞_II硝一Q_们。二．1110Jgo>度r∽卜_；011名≈ro一∞gaJ兽、h≈≈舢—蕊uuQ≤匙譬遗心譬毽、^～o工_-o们Doo．I△_口o-I∞垃一屯-ogo一蔷．I；勺Q∞对．ID>母olIhN。No一(I_'工唇窖蜜牛窖龄烬锥爵匣睁譬叫州俯嚣寸蚶珥警商韫挂陋时餐特qN懈状妲钽甾gq霹靼州帮嚣日挂唧氟撑目送掣杂求9du褂r二蚨谗长妖匿瓣卜 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究表24非感毒西花蓟马雄虫在4种寄主上的不同取食波形平均时间Table2-4TheaveragedurationofdifferentprobesoftheFrankliniellaoccidentalismalewithoutTS、VVonfourhostplants2．2．1西花蓟马的非取食刺探行为西花蓟马雌虫在辣椒上的非取食刺探次数显著少于曼陀罗，西花蓟马雌虫在辣椒上的非取食刺探次数与番茄和矮牵牛上的非取食刺探次数相比差异虽然不明显，但远低于相应寄主上数值(表2．1)。西花蓟马于不同寄主植物上的非取食刺总时间和平均时间没有差异(表2—1、2．2)。雄虫在辣椒上的非取食刺探总次数和时间显著低于番茄(表2—3)，而在辣椒上非取食刺探平均时间显著高于番茄(表2-4)。西花蓟马在辣椒上的尝试性刺探显著要少于番茄和曼陀罗，说明辣椒与番茄和曼陀罗相比，可能不是西花蓟马适宜寄主。在曼陀罗和矮牵牛上取食时，雌虫产生的非取食刺探显著多于雄虫(图2-2B、图2-3B)，说明雌虫可能比雄虫更加活跃，寻找食物更加频繁。2．2．2西花蓟马的短取食刺探行为西花蓟马于不同寄主植物上的短取食行为明显不同(P<0．05)。西花蓟马雌虫在番茄上的短取食次数显著低于矮牵牛(表2．1)，而雄虫在番茄上的短取食次数和总时间都显著低于矮牵牛(表2．3)，跟番茄叶片相比，西花蓟马肯能更偏好取食矮牵牛叶片。同一种寄主植物上雌、雄虫之间的取食行为存在较大差异，雌虫在番茄上的短取食次数和短取食总时间显著高于雄虫，分别为雄虫的4倍和2倍(图2-2C、图2．3C)。雌虫在辣椒上的短取食次数显著高于雄虫，为雄虫的4倍(图2-2C)。说明在一些寄主植物上，雌虫比雄虫取食更多的汁液，相应破坏的寄主植物细胞更多，对寄主造成的直接损害可能更大。2．2．3西花蓟马的长取食刺探行为西花蓟马于不同寄主植物上的长取食行为明显不同(P<0．05)。西花蓟马雌26 下篇研究内容第二章EPG分析健康西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为虫在曼陀罗上的长取食次数和长取食总时间显著高于矮牵牛，而在辣椒上的长取食总时间和平均时间显著高于矮牵牛，都分别为矮牵牛上的3倍(表2—1、2．2)。西花蓟马雄虫在番茄上的长取食次数和总时间以及平均时间显著高于曼陀罗和矮牵牛(表2．3、2．4)。说明矮牵牛叶片可能并不适合西花蓟马的长取食刺探行为。雄虫在番茄上的长取食次数和长取食总时间以及平均时间均显著高于雌虫(图2．2D、图2．3D、图2．4D)。2．2．4西花蓟马的总取食行为西花蓟马在四种寄主植物上虽然总刺探时间差异不显著，但雌虫在矮牵牛上的总刺探次数显著高于辣椒(表2—1)，雄虫在番茄上的总刺探次数显著高于辣椒(表2．3)。说明相对于辣椒叶片，番茄和矮牵牛叶片的取食难度更大，可能需要刺探更多次数才能保证取食量。西花蓟马雌虫在辣椒、曼陀罗和矮牵牛上的总刺探次数显著高于雄虫(图2-2A)，总刺探时间则无显著差异(图2-3A)。而雌虫与雄虫在番茄上的总刺探次数无显著差异(图2-3A)，总刺探时间为雄虫显著高于雌虫(图2-2A)。说明雌虫可能依赖增加刺探次数来增加取食，而雄虫则可能是依赖增加平均每次刺探的时间来增加取食。 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究赧《趣警涮赧≤趣釜业ZC0350250羔150oA50Z-50D3．5羔2厶2番茄辣椒曼陀罗矮牵牛TomatoPepperStramoniumPetunia图2-2不同寄主植物上非感毒西花蓟马雌雄成虫不同类型波形取食次数的差异Fig．2—2DifferenceinnumberofprobesoffemaleandmaleadultswithoutTSWVondifferenthostplants图中宰表示差异显著；n,s．表示无显著差(P<0．05，t检验)。宰inthefigureindicatessignificantdifferences．n．S．inthefigureindicatesnosignificantdifferences．(尸_一屯最oo口oIllw_IrI口。爵．Iu>o如加如加mo加枷咖姗。姗协uoo_I厶c。=∞Q叫口一．芑。二∞∞uo。．1厶ll。召∞u∞一詹．∞暑。一《BIB=pIAI屯暑-o皇。翟毫；屯u警矗≯《CrB=pIAI口眉．，。口。一甍jn屯p譬Ja≯《 下篇研究内容第二章EPG分析健康西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为程度也要高于非适宜寄主(刘桂华和唐燕平，2002)。Zhang等(2007)的研究表明，与辣椒相比，番茄为西花蓟马的较适宜寄主。据此推测西花蓟马在番茄上的取食量应高于辣椒，但本研究结果表明西花蓟马在番茄和辣椒上的短取食和长取食并不存在显著差异(表1．4)，这意味着西花蓟马在番茄和辣椒上的食物摄入量是相似的，而番茄和辣椒中的营养物质组分及比例是有差异的(吴青君等，2007)，由此可以推断西花蓟马在这两种适宜及非适宜寄主植物上生长发育的差异与其取食行为无关，而与寄主植物的营养相关。在自然种群中，西花蓟马之所以在适宜寄主上造成的危害要高于非适宜寄主，主要是由于适宜寄主中的营养物质有利于其种群的增长，进而导致在适宜寄主上造成更为严重的危害。西花蓟马在番茄上的非取食刺探波显著多于辣椒(表2．1)，是由于番茄叶片表面的刚毛比辣椒多，增加了西花蓟马取食时的难度，进而增加了西花蓟马尝试性的非取食刺探行为。3．2西花蓟马取食行为与病毒传播的关系西花蓟马可以传播多种植物病毒，其中主要包括番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiensnecroticspotvirus，INSV)和番茄褪绿病毒(Tomatochloriticspotvirus，TCSV)等多种番茄斑萎病毒属Tospoviruses的植物病毒(Lewis，1997；Whitfieldeta1．，2005；Ohnishieta1．，2006；Reitz，2009)，而取食是病毒进行传播的先决条件。已有研究表明，病毒的传播完全依赖于病毒进入细胞，通过胞间连丝在细胞间进行扩散(Lewandowski&Adldns，2005)。西花蓟马取食时对寄主植物会造成不同程度的破坏。非取食刺探是蓟马口针插入叶片表皮，在此过程中会分泌唾液，但是寄主植物的大部分细胞不会被破坏，对寄主造成的危害较小；短取食刺探主要是将单个细胞内含物吸尽，造成细胞的严重破坏，对寄主造成的危害较大；长取食刺探是摄取未知物的更为复杂的取食行为(Staffordeta1．，2011)。而病毒的存活需要依赖活体细胞。因此，非取食刺探行为对蓟马传播病毒非常有利，而短取食刺探行为对蓟马传播病毒不利(Staffordeta1．，2011)。本研究结果表明西花蓟马在辣椒上的非取食刺探远低于其他寄主植物上的非取食刺探(表2一l、2-3)，因此我们可推测，西花蓟马在其他寄主植物上的传毒效率可能比在辣椒上高，实际结果有待进一步验证。3．3西花蓟马EPG实验中的改进问题本实验采用的是植物叶片来研究西花蓟马的取食行为，但是，在自然条件下，西花蓟马更喜欢取食花粉，而且花粉能够促进西花蓟马的生长发育和繁殖(Hulshofetal．，2003：Zhietal．，2005)。即使是同一种寄主的叶片，西花蓟马对不同部位的叶片的喜好也有区别(裴昌莹和郑长英，2011)，而本研究中均用 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究上端第二片叶，对此可能对西花蓟马取食也有一定的影响。因此，在今后的实验中，我们可以进一步研究西花蓟马对各寄主植物花粉及不同部位的取食行为，使得西花蓟马在不同寄主上的取食行为研究更加全面。32 下篇研究内容第三章EPG分析感毒(TSWV)西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为第三章EPG分析感毒(TSWV)西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus．TSWV)是世界十大病毒之一，每年可对世界各地的农业经济造成严重的损失。西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)是该病毒最主要的传播媒介。TswV可以在西花蓟马体内扩增繁殖，再通过西花蓟马成虫的取食来传播扩散(Kritzmanetal．，2002)。那么感毒(TSWV)西花蓟马的取食行为是如何，对寄主的适应性是否与取食行为相关?本研究通过直流刺吸电位(directcurrentelecmcalpenetrationgraph，DC．EPG)技术分析感毒西花蓟马在四种寄主植物(番茄、辣椒、曼陀罗、矮牵牛)上的取食行为，以期为深入理解其对寄主的适应性提供理论依据。1．材料与方法1．1供试材料1．1．1供试昆虫将感染TSWV病毒症状明显的曼陀罗和1000头左右健康的西花蓟马成虫一起置于纱罩笼子中(图1．2)。让西花蓟马成虫取食感毒曼陀罗产卵2天后，将曼陀罗从笼子中取出，去除西花蓟马成虫，在温室中放置3天左右待卵孵化成一龄若虫。待一龄若虫在感染TSWV病毒的曼陀罗上取食2天获毒以后，将获毒后的若虫收集至玻璃缸，用健康豆角饲喂。待到蛹期时，将西花蓟马放入装有滤纸片的1．5ml离心管中单头饲养至成虫，用毛笔蘸水将滤纸片打湿，保持离心管中的环境湿润，使叶片保持新鲜。取成虫2～3d的西花蓟马实验。实验条件：温度为27土1℃，相对湿度为750／硅5％，光照周期为L：D=16：8。1．1．2寄主植物健康番茄、辣椒、曼陀罗和矮牵牛，详见第一章1．3．1，选取长出3-4片(矮牵牛为5-6片)真叶的健康植株供试。1．2刺吸电位波形(electricalpenetrationgraph，EPG)记录方法详见第二章1．2。1．3取食实验详见第二章1．3。将EPG实验后的西花蓟马单独收集起来，置于．70。C冰箱中，便于以后用RT-PCR方法进行TSWV病毒的检测。检测方法详见第四章。1．4数据统计分析详见第二章1．4。 D苦-oJo昌Bs∞工卜。匣僻姆卜苍叠∞o_∞．Q∽厂1．价o．0v～，)∞甚。暑瓮。扫皇uo毫5DD∞ouaD．I疆Ip苔8uI皇嚣l∞岳矗唇口gnIou日口一g舟口D暑暑uIMo一一oJ∞矗蔷：￡o．I拦Ia。^蠼Q∞rI．S0．0vS郴吲昧堋厘刚文匣悟憔帐时仆匣佟罢『骧氟．(2=uv&l千1189aJg—ogD专II=瓮Q。一2=u一制樊蜷刊理嚣睁状冁瓤D寸．∞n寸巾∞．n婚一。小．o制口．o噶n．卜卜寸州_1．nA∞硝寸．N一一州A．卜西一母母．nn一剞一．N卜_【∞∞．nn一书n．∞吼一日一．∞nn州扒．onN_l噶卜．NNN。Fo．卜AnuDo．一书tocrBc．一州c．一oq寸卜N刊n．8nNu冀oo一刊■口心u寸．o一一电卜．n卜对寸．n一一州o．∞一_l一寸．卜N一州卜．∞N一日昏．h乱叫N．∞=时岔．N∞一刊寸．卜啦一D卜．寸∞寸州卜．o一夺Dn．ANN书卜．婚心N对昏．心寸一书口．一口_【盂一．西昏∞州气卜No—D寸．∞A一刊昏．△NNoN．卜一n刊寸．n一∞D卜．∞nN卅卜．nnN：}7料燃g；Iuo暑暑荡除避酬矗厶争厶纂爨。苗Eo工楼帮∞o丑2Aco薯u∞III-曲co—koco一芭Tl口一暑。工一∞一厘留邻苍半∞∞(12A二oIIso∞cI_sII。一-o矗DETlZ糕《邻盛半∞QD2厶lIo秀p∞暑I-芑。嚼ko最。一百罩口一时_o工一∞一基茁铝釜嫂∞aqoJAco=∞o∞写1．七。告-，o矗丑LuTlZ裁怒扭釜鼎∞u02厶口。焉∞∞cIu。=-oco一，EJn口鼍_o上一∞一厘营骚霉邻苍拌∞DDoJ厶口。iu∞篇Iuo=oo矗DE；Z糕《鞲诿姐吕特曲=Iq2厶ouJ=|B_o卜一∞一厘茁鞲蒺躜∞QD2A-o矗D昌11=一go上籁《鞲霰蹈_口Blalso}{S靶州枯∞_写一盆苗。工JnoJIIo>≥∽卜专一事。一时g盘逵曼≈山蕊8Q冬盘菩过式≈迂，D苦gIA矗工DoM眉勺DQk一-co一口盘厘苔醛熏票簌《醛暴晷叫州俯嚣寸搏雹誉田糯挂陋舯镱I．c懈熏蜡卜嗡翠寸n冥N-c懈．垦蕾赇靶躜冥粲怒醚买踊岛龄憨鞲诿霪n亡bI{。H．N褂¨涨武壮。厘曹举}窖漤餐迷诿H唧氟襟目伸餐譬叫S靶州始匣海忙蓬瞒翠c-n娶一-c琳状姑邻盛盆田樯牲陋N“．g套罂喇婚磐鞲买g唧氟樱般艏镱特岬唧蕊樱般S艚馋皑婆鞲票盆田墒挂陋忑辖求眯好式妖宣g褂餐靶华艚爆榭蜜楼帮靛qS覃}州惟匣佟撑胛氟挂圜钗袋迥扑二F巨 下篇研究内容第三章EPG分析感毒(TSWV)的西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为表3．2感毒西花蓟马雌虫在4种寄主上的不同取食波形的平均时间Table3-2TheaveragedurationofdifferentprobesoftheFrankliniellaoccidentalisfemalewithTSWVonfourhostplants非取食刺探平均时间(s)短取食平均时间(s)长取食平均时间(s)寄主植物HostplantAveragedurationofindividualnoningestionprobesAveragedurationofindividualshort—ingestionprobesAverageduration．ofindividuallong—ingestionprobes番茄Tomat0辣椒Pepper曼陀罗Stramonium1．0士0．2a0．8士0．2b0．9士o．3a4．7士3．1a6．0士4．0a4．4士2．0a257．7士508．2a351．8士689．4a279．6士501．4ab矮牵牛0．9±0．2ab4．呲．1a112一．2一士2⋯73．6一·b．9士0．．9士2．1．Petunia35 ∞刊t"q日小1寸4"1Ao昏西州廿·星斟皇蜒芒^肖寸．∞A甘剞N．nnnDn．西卜寸州寸．一Nn日tnn∞书N．o一小时卜．一卜寸州一．卜∞n—p时A．∞o制n．一n日qoA一州t—心一cl∞n．n”刊叶。寸DN．on卅I．nN砖_．寸A小乱．8I一日∞．寸。一州卜．oN一再N．nn一书昏．卜n—o西．卜。寸州n．崞寸卜时n．一心一州o．竹吼一日寸．∞口_刊N．一n一一_I．”∞喀_=o．Non一时寸．卜oN喇t，．nA_l一卜．寸△州n．卜。一日o．nn∞州一．∞no一一∞．A一一制一．Nn—EnI=oII≈皇∞弧篮酬．1u厶厶u山肇爨撰帮∞oD2厶=o召∞o∞cI．∞二。一ko=o=时．I=勺i_o卜一∞一垦窖邻墨半∞u声oJ厶二。秀u锄c蔷co一-o矗D暑；Z籁《缸苍半∞D02Ac。=∞o∞=I-lJoII∞ooco=_E’j；口一时_nI上一∞一垦莒钽釜嫂s9DoJ厶coIlso∞lII-lJo嚼koJ。DgjZ黎怒如甾裂sa024coIIso∞tIIuo暑-o=o召EJ；口i芑卜一∞一厘茁鞲蒺邻釜并∞∞02厶co一苗Q∞口若oc-oJaDg；Z巅《骚误邻醛粹∞c—024Q基11i_o工^∞v厦曾辎累躅∞D02Qoo矗。暑rI=i芑卜】；i；《鞲诿躜崔卫Q苗o}l器靶州棺∞_二爵一Q_∞o二．I=oJ口o>芝，∽卜二=^f、-D一对I．II童色～窭山蕊uuo逞忠≈，，≮譬毽，^‰o工_-o．Io一≯对IIDD比眉勺DD皿n．nQ—D—'工厘茁鞋暴冥蔌Y，蝼熏盆叫州惟熏寸蚶罚蜡唧氟挂陋肘馘n_c帐妖枣g褂餐姆$伸爆椭蜜楼帮靛■器覃}州椎匿k挂胛氟挂般仪袋掣扑_千器 下篇研究内容第三章EP6分析感毒(TSWV)的西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为表3．4感毒西花蓟马雄虫在4种寄主上的不同取食波形的平均时间Table3-4TheaveragedurationofdifferentprobesoftheFrankliniellaoccidentalismalewithTSWVonfourhostplants2．2．1西花蓟马的非取食刺探行为感毒西花蓟马雌虫在番茄和曼陀罗上的非取食刺探平均时间显著高于辣椒(表3．2)。但是无论雌虫还是雄虫，在四种寄主植物上的非取食刺探总次数和非取食刺探总时间均无显著差异(表3．1和3．3)。说明感毒的西花蓟马在四种不同寄主植物上的尝试性刺探取食相似，不受寄主植物改变的影响。在同种寄主植物上，西花蓟马雌虫和雄虫的非取食刺探差异并不明显。尽管在番茄和辣椒上，雄虫的非取食刺探平均时间显著高于雌虫(图3-3A)，但是其非取食刺探总次数和非取食刺探总时间并无显著差异(图3．1B、图3-2B)。说明感毒的西花蓟马雌虫与雄虫在同种寄主植物上的尝试性刺探取食相似。2．2．2西花蓟马的短取食刺探行为感毒西花蓟马于不同寄主植物上的短取食行为明显不同(P<0．05)。西花蓟马雌虫在番茄上和辣椒上的短取食次数显著低于曼陀罗和矮牵牛，而在矮牵牛上的短取食时间显著高于其他寄主植物(表3．1)。雄虫在番茄上的短取食次数显著低于曼陀罗(表3．3)。说明跟其他寄主植物叶片相比，感毒的西花蓟马更偏好取食矮牵牛叶片。同一种寄主植物上雌、雄虫之间的取食行为存在较大差异。西花蓟马雌虫在番茄和曼陀罗上的短取食次数均显著高于雄虫，均为雄虫的3倍左右(图3．1C)；雌虫在矮牵牛上的短取食次数和短取食总时间均显著高于雄虫，分别为雄虫的4倍和2倍(图3．1C、图3．2C)。而雄虫在番茄、辣椒和曼陀罗上的短取食平均时间均显著高于雌虫(图3．3B)。说明在一些寄主植物上，感毒的西花蓟马雌虫比雄虫取食更多的植物汁液，破坏的寄主植物细胞更多，对寄主植物造成的直接损害更大。37 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究2．2．3西花蓟马的长取食刺探行为感毒西花蓟马于不同寄主植物上的长取食行为明显不同(P<0．05)。西花蓟马雌虫在番茄和辣椒上的长取食次数、长取食总时间和长取食平均时间均显著高于矮牵牛，而在辣椒上的短取食次数显著高于曼陀罗(表3．1、表3．2)。西花蓟马雄虫在番茄和辣椒上的长取食总时间显著高于曼陀罗(表3．3)。说明番茄和辣椒叶片比曼陀罗和矮牵牛叶片更适合感毒的西花蓟马的长取食刺探行为。西花蓟马雄虫在曼陀罗和矮牵牛上的长取食次数显著高于雌虫，分别为雌虫的2倍和3倍(图3．1D)。西花蓟马雄虫在番茄和矮牵牛上的长取食总时间和长取食平均时间均显著高于雌虫。(图3-2D、图3-3C)。2．2．4西花蓟马的总取食行为感毒西花蓟马雌虫在矮牵牛上的总刺探次数和总刺探时间显著高于番茄、辣椒和曼陀罗(表3．1)，而雄虫在番茄、辣椒、矮牵牛上的总刺探时间显著高于曼陀罗(表3．3)。说明相对于其他寄主植物叶片，矮牵牛叶片的取食难度更大，需要刺探更多次数才能保证取食量，而曼陀罗叶片则比其他寄主植物叶片更容易取食。西花蓟马雌虫在番茄和矮牵牛上的总刺探次数显著高于雄虫(图2．1A)，总刺探时间则无显著差异(图2-2A)。而雌虫与雄虫在辣椒上的总刺探次数无显著差异(图2．1A)，总刺探时间为雄虫显著高于雌虫(图2-2A)。说明雌虫依赖增加刺探次数来增加取食，而雄虫则是依赖增加平均每次刺探的时间来增加取食。 下篇研究内容第三章EPG分析感毒(TSWV)的西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为籁题缸盛出A300200o＆1000．1003002001000．100432玺量10．1番茄Tomato辣椒曼陀罗矮牵牛PepperStramoniumPetunia图3．1不同寄主植物上感毒西花蓟马雌雄成虫不同类型波形取食次数的差异Fig．3—1DifferenceinnumberofprobesoffemaleandmaleadultswithTSWVondifferenthostplants图中}表示差异显著；n．s．表示无显著差(P<0．05，t检验)。木inthefigureindicatessignificantdifferences．n．S．inthefigureindicatesnosignificantdifferences．(P．<0．05，Studentt'stest)．以下各图同。Thesameforthefollowingfigures．∞∞∞975311舢∞∞DoJdoo矗丑g；gIB_p_noQo．I△Bco；∞u曲IIIuo口koJaD暑=ZCco；¨m叫u1．七oLlS芑Ja上EjzD骚怒鞲暴蹈籁怒聪暴舡釜袢籁《缸苷嫂=oIl∞D噬II!．M叠。一-o．IQo—IITlZ 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究C番茄Tomato辣椒曼陀罗矮牵牛P印gerStramoniumPetunia图3-2不同寄主植物上感毒西花蓟马雌雄成虫不同类型波形取食时间的差异Fig．3-2DifferenceintotaldurationofprobesoffemaleandmaleadultswithTS、7lⅣondifferenthostplants∞帅∞帅∞o姗湖咖湖咖湖。姗2lA眦cIqoJdu暑；lBloh一∞一垦莒冁暴躜O)瑚啪如铷枷∞廿Do．IaIIoIl∞QMl．j口o【IB‘o二。一苗Jn勺一50工一∞一旦茁蹈鞲苠扭墨袢0O咖鲫瑚瑚咖姗l-，‘1∞O∞O5的uoo_IQco；们u吐暑∞QDoJQ口ou∞oM5。乞oII们ko口。霉∞'I；口≮_^)工D．HIIo一-oIIo翟再．1j可一Bl^'工一∞一垦蓄蹈钲苍璎一∞一厘窖蹈缸醛半 下篇研究内容第三章EPG分析感毒(TSWV)的西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为言垦譬露牛缸备鼎3吾薹墨s00吾芑詈薹耋善400萋善量。∞>《．400●雌虫FemaleI-1雄虫Male番茄辣椒曼陀罗矮牵牛TomatoPepperStramoniumPetunia图3．3不同寄主植物上感毒西花蓟马雌雄成虫不同类型波形取食平均时间的差异Fig．3-3DifferenceinaveragedurationofprobesoffemaleandmaleadultswithTSWVondifferenthostplants3．讨论3．1感毒西花蓟马取食行为与病毒传播的关系已有研究表明，非取食刺探行为对蓟马传播病毒非常有利，短取食刺探行为对传播病毒非常不利(Staffordeta1．，2011)。本实验表明，不管感毒(TSWV)西花蓟马雌虫还是雄虫在四种不同寄主植物上的非取食刺探行为均无显著差异(表3一l、表3．3)。除在矮牵牛上雌虫的非取食刺探次数显著高于雄虫外，在其他寄主上，感毒西花蓟马雌虫与雄虫的非取食刺探行为无显著差异(图3．1B、41628401●O0∞uo。|d=o翟∞o凹眉口。口A一硝j勺一>一口昌一-oc。—葛．Ij日。叫母．Io>《^∞一垦雷露}鞲毒邻甾特42O86420Ol1O2们mDoJ△co；蚺∞凹cl-七oL．蚺—廿一毋3D一>一刁c一芑co；m．13口∞∞甩．Ia^《C一 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究图3-2B)，这与Stafford等(2011)的研究结果是一致的。说明感毒后的西花蓟马在传播病毒方面的差异主要来源于短取食刺探行为的影响。从本实验结果中可以看出，雌虫的短取食显著高于雄虫(图3．1C、图3-2C)，因此破坏更多的寄主植物细胞，造成的直接伤害更严重。Stafford等(2011)的研究表明雌虫在寄主植物上取食的范围小而集中，雄虫取食的范围大而扩散。这就导致了雌虫的非取食刺探中夹杂了更多的短取食，从而破坏了非取食刺探后的大多数植物细胞，对于病毒的成功扩散传播非常不利。因此，感毒后的西花蓟马雄虫比雌虫的传毒效率更高，这与Stafford等(2011)和Wetering等(1998)的研究结果是一致的。而西花蓟马在矮牵牛上的短取食显著高于其他寄主植物(表3．1)，由此我们可以推断，与其他寄主植物相比，西花蓟马在矮牵牛上传播番茄斑萎病毒的效率可能最低。3．2西花蓟马取食行为与寄主适宜性的关系Zhang等(2007)的研究表明，与辣椒相比，番茄为西花蓟马的较适宜寄主。而感毒西花蓟马在这两种寄主植物上的取食行为均无显著差异，这与非感毒雄蓟马在番茄上的非取食刺探显著高于辣椒的结果不同。由此，我们也可以推测出感毒西花蓟马雄虫的取食行为因为病毒的影响而改变。但是，感毒西花蓟马对寄主植物的适应性与取食行为并无显著关系，这与非感毒西花蓟马的研究结果是相似的。．3．3EPG实验的改进问题本实验采用的是携带TSWV的西花蓟马进行实验，但是感毒西花蓟马包含携带病毒并可以传播与携带病毒不能传播两种情况(Nagataeta1．，2004)，这两种情况的西花蓟马的取食行为是否有差别?因此，在今后的实验中，我们可以进一步研究这两种感毒西花蓟马的取食行为。由于西花蓟马的食性杂，寄主范围广，我们可以增加寄主类型，使得西花蓟马在不同寄主上的取食行为研究更加全面具体，为今后研究西花蓟马和番茄斑萎病毒的防治提供有效的理论基础。42 下篇研究内容第四章感毒(TSWV)西花蓟马RNA的提取与检测第四章感毒(TSWV)西花蓟马IⅢA的提取与检测西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)是番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvires，TSWV)最有效的传播媒介(Wijkampeta1．，1995)，主要由于该病毒可以在西花蓟马体内进行复制增殖(Elisaveteta1．，2002)。但是已有研究表明，西花蓟马一龄若虫取食感毒植株可以从寄主植物中获取该病毒(Wijkamp“aL，1995)。但是这一方法并不能确保取食的每头西花蓟马均可获得该病毒，0-24h的西花蓟马若虫最高感毒效率雌虫为61％，雄虫为51％(Elisaveteta1．，2002)。那么西花蓟马体积如此微小，如何确定1头西花蓟马成虫体内是否携带TSWV病毒?早期的国外学者采用间接检测法——叶碟法，通过西花蓟马将获取的TSWV病毒传到叶碟上使其发病，从而利用ELISA来检测叶碟发病情况来确定该蓟马是否带毒(WijkampetaL，1995)。但是，另有研究表明，不是所有携带TSWV的西花蓟马都可以成功使其取食的叶碟发病的，其传播效率不仅与其最初获毒量和体内复制数量有关，而且可能受到蓟马体内病毒循环的障碍物所影响(NagataetaL，2004)。由于西花蓟马自身体内缺陷、环境或叶片的因素，导致叶片没有发病或病毒含量微小而未被检测到，这种情况亦时有发生。所以需要建立一种直接而合适的检测方法来对携带TSwV的西花蓟马进行确认。1．实验材料1．1供试昆虫将感染TSWV症状明显的曼陀罗和1000头左右健康的西花蓟马成虫一起置于纱罩笼子中。让西花蓟马成虫取食感毒曼陀罗产卵2天后，将曼陀罗从笼子中取出，去除西花蓟马成虫，在温室中放置3天左右待卵孵化成一龄若虫。待一龄若虫在感毒的曼陀罗上取食2天获毒以后，将获毒后的若虫收集至玻璃缸，用健康豆角饲喂直至成虫。实验条件：温度为27士1℃，相对湿度为750／社5％，光照周期为L：D=I6：8。1．2TSWV的N．gene特异性引物设计根据TSWv上的N蛋白基因设计两条特异性引物，由生工生物(上海)公司合成，引物序列如下：PTSW302：5’．GGGTCAGGCTTGTTFAGGAAAC和PTSW575：5，．TTCCCTAAGFCTTCCCTGGTG，扩增产物片段约为273bp(Vakaetal．，1995：MasonetaL，2003)。1．3主要试剂和药品Trizol试剂(250m1)，购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；RT-PCRQuickMasterMix试剂盒，购自上海硕盟生物科技有限公司(SoloMon)；70％酒精；氯仿混合物(V氯仿：V异戊醇=24：1)：琼脂糖，购自生工生物(上海)公司；2KDNAMarker，购自生工生物(上海)公司：6xloadingbuffer染色剂，购自生43 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究工生物(上海)公司。2．实验方法2．1单头蓟马RNA提取将单头获毒后的西花蓟马置于1．5ml的离心管中，加入适量的液氮，用微型小杵研磨均匀，加入250mlTrizol试剂，将样品室温放置5min。加入50LLl氯仿混合物(氯仿：异戊醇=24：1)，震荡混匀3min后，将样品在4℃条件下，12000xg离心10min，将上清液移至另一离-th,管中(125肚1)，随后加入125gl冷的异丙醇。室温温育10min后，再在4℃条件下，12000xg离心10min。弃上清，加入70％预冷的酒精(25091)洗涤，在4℃条件下，12000xg离心5min。弃酒精，在真空离心蒸发浓缩机中干燥处理，之后加入8ul无菌水，在60℃条件下温育15min。将提取得到的RNA立即进行RT-PCR或存于．80℃冰箱中保存(Masoneta1．，2003)。2．2一步法RT-PCR扩增cDNA合成将存于．80℃冰箱的样品取出，在60℃条件下解冻15min。取灭菌后的0．2gl离心管，按照以下体系混合加入各试剂和样品。10ul体系：H203山2XRT-PCRQuickMasterMix5gl。50MmMn(OAC)20．5“l引物PTSW3020．5LLl引物PTSW5750．5ulRNA模板O．5ul将配置好的109l体系的离心管置于PCR仪中，按照PCR反应程序进行扩增。PCR程序反应条件：变性90。C30sec；RT60。C30rain；变性94"C，30sec；94。C30sec，60℃30sec，72℃lrnin，35个循环；延伸72℃7min。2．3凝胶电泳将反转录的cDNA在1％的琼脂凝胶125V下电泳。25min后，将琼脂胶在紫外光下观察扩增片段。2．4测序将扩增的片段cDNA送至铂尚生物技术(上海)有限公司(BioSune)进行检测。3．结果与分析经过扩增和电泳跑胶，得到273bp的片段，如下图4．1所示。44 下篇研究内容第四章感毒(TSWV)西花蓟马RNA的提取与检测500bp250bpMl23456789图4—1单头西花蓟马病毒(TSWV)检测Fig．4-1TSWVtestinindividualFrankliniellaoccidentalisM：2KDNAMarker。5．9：单头西花蓟马扩增片段。ThefragmentoftheindividualFrankliniellaoccidental如amplification．由图4—1可知5，9中检测出273bp的片段，经过铂尚生物技术(上海)有限公司(BioSune)测序后，与TSWV进行比对，相似率均大于96％，可以确认为TSWV病毒。因此，我们可以确定，这2头西花蓟马成虫体内携带有TSWV病毒。4．讨论在国内外，检测单头昆虫(如飞虱、蚜虫、烟粉虱等)的DNA或RNA的技术已经非常成熟。但是由于西花蓟马体积小，病毒含量相对小等特点，检测单头西花蓟马中的病毒的方法仍然较少。目前只有国外拥有该技术，国内仍为空白。该技术对TSWV病毒在单头西花蓟马体内的检测提供有力的参考，为以后病毒在西花蓟马体内的传输、作用机制等研究提供科学的方法依据。45 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究第五章全文总结与展望1．全文总结1．1西花蓟马传毒能力的测定本研究将一龄的西花蓟马若虫取食番茄斑萎病毒叶片48h，并用健康叶片饲养至成虫后，随机选取30头成虫2d的西花蓟马作为一组进行实验，重复3组。采用叶碟法，分别对健康番茄叶碟，辣椒叶碟，曼陀罗叶碟和矮牵牛叶碟进行传毒实验。然后利用ELISA方法检测叶碟的带毒率。叶片的带毒率即为西花蓟马的传毒效率。经过检测，西花蓟马在番茄、辣椒、曼陀罗及矮牵牛上的传毒效率率可能在10％～30％之间，且在四种寄主上的传毒效率不存在显著差异。1．2EPG分析非感毒西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为本研究利用刺吸电位技术对西花蓟马在健康番茄、辣椒、曼陀罗及矮牵牛上的取食行为进行分析。已有研究表明，番茄比辣椒更适宜西花蓟马。而西花蓟马在番茄和辣椒上的取食摄入并不存在显著差异，由此，我们推测，西花蓟马在这两种适宜及非适宜寄主植物上生长发育的差异可能与其取食行为无关。1．3EPG分析感毒西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为在本研究中，感毒后的西花蓟马在番茄和辣椒上的取食行为并无显著差异。我们推测，感毒后的西花蓟马的取食行为与寄主适宜性可能无关。而雌虫与雄虫之间的非取食刺探无显著差异，而雌虫短取食显著高于雄虫，我们推测可能由于雌虫的短取食大量破坏了寄主植物的细胞导致雌虫比雄虫的传毒效率低。1．4感毒西花蓟马RNA的提取与检测本研究采用一步法RT-PCR对感毒(TSWV)单头西花蓟马进行病毒检测，成功地检测出了单头西花蓟马体内的TSwV病毒，为国内单头西花蓟马TSWV的检测填补了空白。2．主要创新点西花蓟马是一种重要的蔬菜和花卉观赏植物的害虫，也是传播番茄斑萎病毒的主要媒介昆虫。本研究通过对感毒西花蓟马在四种寄主植物上的传毒效率进行研究，利用刺吸电位技术，对非感毒西花蓟马和感毒西花蓟马的取食行为进行了分析。明确了非感毒西花蓟马和感毒西花蓟马的取食习性，为今后西花蓟马与病毒互作方面的研究提供依据和参考，从而能够找到更有效的防治西花蓟马和番茄斑萎病毒的方法。本研究通过RT-PCR一步法成功检测出单头西花蓟马中的TSWv，为感毒西花蓟马的检测提供了一种有效的方法。3．研究展望 下篇研究内容第五章全文总结与展望番茄斑萎病毒在西花蓟马体内影响了西花蓟马的取食行为。在今后的研究中，可以利用分子研究方法，明确番茄斑萎病毒作用于西花蓟马的哪些部位，从而影响并改变了西花蓟马的取食行为。47 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硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究附录1．接种缓冲液Na2S03：1％(w／v)29．PVP：2％(w／v)49，Na2HP04’12H200．43709，NaI-12P04。2H200．12169，加入200mlH20，调节PH值至7．0，4"C保存。2．试剂盒TSwV快速检测试剂盒，购自安德珍生物公司(AdgenPhytodiagnostics)。3．仪器设备智能生物人工气候箱：XutempXT5401，杭州雪中炭恒温技术有限公司，可对温度、湿度和光照进行设定和控制：酶标仪：BIO．RADxMarkMicroplateSpec廿ophotometer，宝成生物公司；洗板机：BIO．RADMODEL1575ImmunoWsah，宝成生物公司：灭菌锅：LDZX．50K．BS，立式压力蒸汽灭菌锅，宁波江南仪器厂，上海申安医疗器械厂；生化培养箱：SPX．250B—Z型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电热鼓风干燥箱：XT5118-OV50，·杭州雪中炭恒温技术有限公司，可调节温度5℃～260℃；真空浓缩器：MV-100型，TOMYMEDICOCO．，LTD，产自日本；PCR仪器：6331BM302044，NewBrunswick，产自德国：电泳仪：DYY-7C型，北京市六一仪器厂：电子天平：AY220，Shinadzu；离心机：Microfuge22Rcentrifuge，Beckmancoulter；移液枪：Eppendorf公司生产：．70。C超低温冰箱：U410．86premium，NewBrunswickScientific，产自英格Ⅱ．--一，涡旋振荡器：WH．861，华利达生产：磁力搅拌器：X85．2恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦生产；酸度计：PH211MircoprocessorpHMeter，HANNAinstrument。4．其他培养皿、研钵、液氮、打孔器、滤纸、毛笔、帕拉膜、剪刀、镊子、96孔酶标板、24孔板、离心管、离心管架、组织研磨杵。 59 硕=l：学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究攻读硕士学位期间发表论文情况1．张玉秀，张治军，吕要斌．利用EPG技术分析西花蓟马在四种寄主植物上的取食行为．浙江农业学报(己录用，待发表)．60 61 硕士学位论文西花蓟马在不同寄主植物上对番茄斑萎病毒传播效率的研究致谢本论文是在导师吕要斌研究员地悉心指导和关怀下完成的。在整个实验的选题，实验设计，数据分析和论文写作中，倾注了吕老师对学生大量的心血与关爱。科研实验的过程并不是一帆风顺的，在此过程中，吕老师从不吝啬于对学生的教导，帮我分析并找出实验出现问题的症结，努力引导我独立思考，自我分析，培养我对科研所需的专业素养。他渊博的知识，严谨的科研精神，无私的奉献品格深深的感染了我，让我终身受益。在此，我万分感谢吕要斌研究员对我的指导和栽培，我相信在此学习到的一切将会成为我今后工作和生活的指南针，指引我前进的方向。本论文是在浙江省农科院植物保护与微生物研究所农业经济作物虫害实验室完成的。特别感谢张治军老师给予的悉心指导和帮助，张老师对我严厉的要求和严谨的科研态度培养了我自主学习和思考的能力。同时要感谢实验室中贝亚维、黄芳、郦卫弟、林文彩、章金明和张蓬军老师对我学习和生活上的关心和帮助，让我感受到实验室大家庭中的温暖。感谢实验室里所有同学和朋友们对我的帮助和关爱，你们就像是阳光一样照亮了我研究生生涯中的道路，有你们的陪伴，我才更加快乐，谢谢你们：祝晓云师姐、李晓星师姐、朱义勇师兄、刘敏、宋亮、卢欢欢、王飞飞师弟、张革伟师弟、廖倩师妹、杜亮师妹、李秀琼师妹以及所有帮助过我的人。时光飞逝，研究生生涯即将结束，在这不长不短的三年里，我遇到了许许多多的人，有欢笑，有泪水，有烦恼，有忧愁，装点了我的人生，让我的生活丰富多彩。但是天下无不散的宴席，临别之际，更多的却是不舍和牵绊，在这里的生活的点点滴滴将会永远珍藏在我的记忆深处，成为我永久的财富。在我二十多年的读书生涯中，家人一直是我坚强的后盾和永远的依靠，是我人生道路上前进的动力。毕业之际，我想特别感谢我的父母，感谢他们对我永恒的爱，无限的包容和无私的奉献。张玉秀2013年5月