番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒细胞病理学及其运动蛋白的研究

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洳≥：J、硕士学位论文⑧中文论文题目：垂蕴超萎痘圭狸叠蒸丕纹壅蛊痘壹垫胞痘垄堂区基鋈边蛋自数珏究英文论文题目：．StudyofcytopathologyofTomatospottedwiltvirus．．andTomatozonatespotvirusandfunctionsofMP．．．申请人姓名：尚里娜指导教师：湛健盈究员专业名称：撞堑痘堡堂所在学院：盔些盏生塑垫盔堂瞳 分类号：学号：2Q窆!鱼Q9窆番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒细胞病理学及其运动蛋白的研究StudyofcytopathologyofTomatospottedwiltvirusandTomatozonatespotvirusandfunctionsofMP论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4．委员5：答辩日期：魁¨Il●-●ll^ 浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝堑太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：1司,4P卫姆签字日期：2口f歹年j月巧日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解堑婆太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑堑塞堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：I尚耍主刃f导师签名：签字日期：如j2年』月2‘日澎湿沈湿登芋B觌i≯o|盖年七目“B 课题来源国家“973项目"前期研究(2010CBl34501) 致谢时光飞逝，如白驹过隙，转眼间我又走过人生的又一旅程。在浙大学习生活了三年，马上就要毕业离校了，说实话，还挺怀念这三年的生活。从研一刚入学时期的迷茫，到现在对科研实验的热爱，我感觉这三年的生活收获颇丰。尤其是过去的这一年，我充分体验到了实验学习的忙碌与充实，由以前对实验以及科研前途的无知与茫然，到现在在实验中渐渐地充实，不断地学习，我已经逐渐的喜欢上了这种忙碌而充实的“科研生活”。首先，深深感谢我的导师洪健教授。三年来，导师以儒者的风范在工作和学习中以身作则，他严谨务实的治学态度、豁达平易的待人风格、精益求精的工作作风无一不是我学习的榜样。本论文能够顺利完成，是在导师的悉心指导和帮助下一步步实现的。从研究工作的选题、构思、实验设计和实施到论文的撰写、修改，无不凝聚着导师的心血和智慧。授人以鱼不如授人以渔，置身其间，耳濡目染，潜移默化，使我不仅接受了全新的思想观念，树立了宏伟的学术目标，而且强化了动手能力，掌握了学习方法。值此论文完成之际，谨向恩师致以深深的谢意!衷心感谢电镜室的黎军英、徐颖、方月鲜、孟春梅、何黎平和余东宁六位老师，他们不但教会了我关于电镜技术方面的知识，还让我懂得了人与人之间那份和谐、友爱的团队精神的可贵，他们那真诚、豁达、随和的待人态度，营造了一个良好的实验室氛围，同时不辞辛苦地为我的实验提供无限的帮助和支持，论文中同样凝聚了他们的汗水，在此表示我衷心的感谢!感谢周雪平老师、钱亚娟老师、谢艳老师、吴建祥老师、李正和老师在我实验过程中给予的帮助，不仅慷慨提供了部分实验材料和试剂，更给予了热情耐心的理论和技术指导。感谢张传溪老师和程若琳博士在昆虫杆状病毒表达体系方面的热忱帮助。感谢云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所张仲恺教授、丁铭老师和郑宽瑜硕士在课题设计、病毒材料和实验方面的指导和帮助。感谢徐毅师兄、张洁师姐、李方方、董静云、顾周杭、侯虎威、王强等对我分子生物学实验的帮助和指导，感谢刘欢、倪跃群师妹和胡涛师弟在蛋白表达和抗体制备方面的帮助。最后，对参加本论文评阅、答辩和对本论文提出宝贵意见的所有专家老师表示最衷心的感谢。尚卫娜2012年5月于浙大紫金港I 目录至迂谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．I目勇之⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．¨摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯VSummary⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯、，I第一章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1番茄斑萎病毒属病毒分子生物学研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．1番茄斑萎病毒属病毒的分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2番茄斑萎病毒属病毒的基因组结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．1．3生物学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2病毒细胞间运动模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．2．1运动蛋81核酸(MP／RNA)复合体模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2_2管状结构模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．3三基因盒模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．2．4双生病毒模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．3选题的意义、研究内容和目标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．3．1选题的意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．3．2研究内容和目标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．1．1．1病株材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．1．1．2试齐U⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。152．1．1．3仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．1．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．1．2．1常规化学固定和包埋⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．1．2．2高压冷冻固定和冷冻替代⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．i．2．3样品的超薄切片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．1．2．4超薄切片的染色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．16 2．1．2．5超薄切片的电镜观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2．1化学固定感染TSWV的植物叶细胞病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一172．2．2化学固定感染TZSV的植物叶细胞病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．3高压冷冻固定感染TSWV的植物叶细胞病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．3小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．23第三章TSWV和TZSV运动蛋白在植物细胞内的定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．253．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．253．1．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．263．1．2．1病毒的接种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．1．2．2病毒基因组的抽提⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．1．2．3cDNA第一链合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．1．2．4TSWV和TZSVNSm目的片段的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．273．I．2．5DNA克隆技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．I．2．6重组质粒的提取和鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．1．2．7重组表达载体导入农杆菌C58Cl⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．1．2．8农杆菌培养和浸润⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．1．2．9激光共聚焦显微镜观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．2．i重组质粒构建的鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。323．2．2NSm在本氏烟表皮细胞内的定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。323．3小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．35第四章TSWV和TZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．374．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．384．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一384．1．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．384．1．2．1PCR扩增目的基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384．1．2．2重组病毒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384．1．2．3Lipofectin介导重组病毒转染昆虫细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40 4．1．2．5激光共聚焦显微镜观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯404．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．404．2．1Bacmid-NSm的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯404．2．2NSm在昆虫Tn细胞内的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯414．2．3TSWV和TZSV序列比对结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．444．3小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45第五章TSWV和TZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．475．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．475．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．475．1．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．475．1．2．1常规PCR反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．475．1．2．2原核表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯485．1．2．3目的基因在大肠杆菌中的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯485．1．2．4表达产物在变性条件下的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．495．1．2．5重组蛋白的SDS．PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯505．1．2．6多克隆抗体的制各⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．515．1．2．7Western印迹分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯525．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．535．2．1TSWV、T／_SVNSm基因的克隆和原核表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯535．2．2TSWV、TZSV运动蛋白的原核表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯535．2．3TSWV、TZSV运动蛋白的大量表达及纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯555．3小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58全文小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61附录A本论文中所用缩写与中英文对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．66附录B：常用试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69附录c：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74V 摘要番茄斑萎病毒属(Tospovirus)侵染植物，寄主范围广泛，危害严重，近年来在我国陆续有许多新种或新分离物报道。其中番茄环纹斑点病毒(Tomatozonatespotvirus，TZSV)是2008年报道的该属新种，与该属代表种番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)基因组结构相似，但是同源性较低。为了研究大颗粒病毒的胞间运动机理，我们对两种病毒的细胞病理学及胞间运动机理开展了研究。通过透射电子显微镜观察常温固定包埋和高压冷冻固定包埋两种方法处理的Tswv、TZSV感病植物叶片发现，两种病毒的形态及细胞病理变化大致相似，但也存在差异。与TswV相比，TZSV对细胞器的影响更大。TZSV侵染的叶片在叶绿体处也能像Tswv一样产生囊泡，部分叶绿体的囊泡几乎占据整个叶绿体，片层结构破坏更加严重。在线粒体中也能够产生与叶绿体内相似的囊泡结构，这种现象在Tswv侵染的叶片内难以观察到，相比之下，Tswv侵染的叶片线粒体保存的更加完好。该结果也可以在一定程度上说明为什么在田间状态下，TZSV对作物造成的危害更加严重。为了研究TsWV、TZSV运动蛋白NSm的细胞定位。将两种病毒的NSm基因融合叩P后构建到植物双元表达载体pCHF3中，农杆菌介导浸润本氏烟叶片，同时将融合钮P的NSm基因利用Bac．to．Bac杆状病毒表达体系转染昆虫Tn细胞。在激光共聚焦显微镜下观察NSm．GFP在烟草表皮细胞中和昆虫Tn细胞中的定位情况。观察发现与单独表达GFP在细胞壁周围和细胞核处均匀分布不同，TswV、TZSVNSm．GFP融合蛋白会在植物细胞内扩散，能够在细胞壁边缘定位，并且在胞间连丝处呈不连续的绿色荧光小点，偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间。TSwrV的GFP．NSm融合蛋白能够在昆虫Tn细胞表面诱导产生数量众多的管状结构并向外延伸，长度远长于在胞间连丝处形成的NSm蛋白小管。TZSV的GFP．NSm融合蛋白也能在昆虫Tn细胞内表达，但是不能产生管状结构，主要分布在细胞质内，成团块状聚集；该蛋白也能在细胞核表面定位，呈网刺状，围绕着细胞核形成圆环形。为了进一步直观研究两种病毒的运动蛋白在亚细胞结构内的确切定位分布情况，利用大肠杆菌系统pET系列载体表达了TSWV、TZSV的朋沏基因，以Ni2+-NTAagarose亲和柱分别纯化了这两个蛋白与His组氨酸的融合蛋白并制备了相应的多克隆抗体。其中，TswvNSm蛋白制备的多克隆抗血清进行Westemblot结果显示，抗血清对该蛋白具有特异性反应，可用于进一步免疫胶体金标记分析。而TZSVNsm蛋白的抗血清正在制备过程中，结果暂不显示。关键词：番茄斑萎病毒，番茄环纹斑点病毒，NSm，细胞定位，胞间运动，Tn细胞V SummaryTospovirusisthecausalagentforlargeeconomiclossesinawidevarietyofplanthosts．Sincethen，increasingnumberoftospoviruseshavebeenfoundinmanyregionsofChina．Similartoothermembersofthetospoviruses，tomatozonatespotvirus(TZSV)_一aIlisolateofanewtospovirusspecies，hasquasi-spherical，envelopedparticles(80～110nmindiameter)andatripartitesingle·stranded(ss)RNAgenomedenotedaslarge(L)，medium(M)andsmall(S)RNAs．SequenceanalysisindicatedthattheidentitiesofSandMRNAIGRsequencessharedbyTZSVwithothertospovirusesarebelow37．8and54．6％，respectively．Inordertostudythelarge—particlevirusintercellularmovementmechanismincloudingTomatospoHedwiltvirus(TSWV)andTZSV，thecytopathologicalstructureofthesevirusesWasobserved，thesubcellularlocalizationofmovementpoteinNSmswerestudied．Usetwokindsofmethod，theconventionalchemicalmethodandtheultra-low-temperaturefast-frozenmethod．toprocessingthevirus-infectedplantsbyTSWVandTZSV．Theultrastructureofthehostcellsisobservedusingtransmissionelectronmicroscope．Theresultsshowedthatthedistributionofthevirusparticlesandthecytopathologicalstructurehasnosignificantdifferencebetweenthetwovirus．Quasi-sphericalparticlesenclosedinamembranousenvelope，typicaloftospoviruses，wereobservedinbothoftheviruses．Howere，thecellularorganellesofleavesinfectedbyTZSVaredestoriedmoreserious．Forexample，thechloroplastsarevacuolarintheleavesinfectedbythetwovirus，butthevacuolesaremoreandlargerintheleavesinfectedbyTZSV．TherearealsosomevacuolesCanbeobservedinthemitochondriaintheleavesinfectedbyTZSV．butinvisibleintheleavesinfectedbyTSWV．ThesemaybetosomeextentexplainwhyTZSVhasmoreserioushazardstocropsinthefieldstate．TheexpressionandsubcellularlocationoftheNSmproteinofTSWVandTZSVwerestudiedusingtwodifferentmethodsbybothplantcellsandinsectcells．First，theNSmgene，locatedontheambisenseMRNAsegmentofTSⅥⅣandTZSV．wasclonedintothepCHF3vectorwhichincludeaGFPgene．Agrobacterium-mediatedtransientexpressionfromN．benthamianaleaveswasusedtostudythelocationofNSminplantcells．Second，inordertotestwhetherplant—specificcomponentswereinvolvedintubuleformation，theNSmgenewasVI alsoexpressedinaheterologousexpressionsystem，i．e．，insectcells．SoT．ni(Tn)cellswereinfectedwitharecombinantbaculovirusexpressingtheNSmgene．TheresultsshowedthatNSm-GFPfusionproteinsofthebothvirusdiffusedinthetobaccoepidermalcellsandwerelocatedattheedgeofthecellwalls，formingdiscontinuousgreenfluorescentspotsattheplasmodesmata，whichweresometimespresentinpairsbetweentwoneighboringcells，whileGFPproteinsexpressedalonedistributedevenlyaroundthecellwallandinthenucleus．IntheentomicTncells，TSWVNSmproteinsformedalargenumberoftubularstructuresextendingfromthesurface．ButthelocalizationofTZSVNSmproteinsaredifference．Theycanjustdiffusedinthecytoplasmandthesurfaceofthecellnucleus．TheNSmgeneofTSWVandTZSVwereexpressedinE．colistrainBL21(DE3)pLysSusingpET32avector，andrecombiantproteinswerepurifiedwithNi2+．NTAagaroseaffinitychromatography．ThepolyclonalantibodiesagainsttheNSmofTSWVandTZSV，wereproducedinrabbits，respectively．WesternblotanalysisofpurifedrecombinantNSmproteinofTSWV，purifiedNSmproteinwasshowntobindspecificallytointactthepolyclonalantibodies．Thesepolyclonalantibodieswerepreparedforthenextimmunocytochemistryobservation．Keywords：TSWV，TZSV，NSm，Subcellularlocation，Cell—to—cellmovement，TncellsV 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述1．1番茄斑萎病毒属病毒分子生物学研究进展番茄斑萎病毒属(乃印Dv护淞)侵染植物，其寄主范围非常广泛，据报道该属代表种番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TswV)能够侵染15个科1090种的单子叶植物，69个科的双子叶植物和一个科的蕨类植物(Parrella，eta1．，2003)，而属内其他病毒的寄主范围要窄的多。TswV在世界范围内均有分布，一般发生在温带和亚热带地区。对许多经济重要性作物都造成相当严重的损失。该病毒和其他的Tospovirus已经成为世界范围内多种食物和观赏作物经济损失上升的重要因子。虽然经济损失数据有限，但是在农作物上的损失可能高达100％(Berling，eta1．，1990)。巴西、美国夏威夷和南非的发生率高到使农民放弃生产。在意大利的利古里亚区，辣椒生产受严重影响，而临近的番茄和莴苣则保持健康。在意大利的其他地区，莴苣和番茄作物同辣椒一样受严重影响。在保加利亚，希腊和其他的欧洲东南部国家的烟草中出现毁灭性流行病害。在印度，花生芽枯病毒(Groundnutbudnecrosisvirus，GBNV)是花生的最重要病毒病害，作物损失范围在5％～80％之N(Ghanekar，eta1．，1979)。在日本，番茄斑萎病毒在1965年第一次从大丽菊分离出，随后从番茄、青椒和许多其他观赏植物分离出。20世纪90年代末番茄斑萎病毒迅速在日本各地传播，成为对温室栽培的蔬菜和观赏植物侵袭最严重的病原之--(Okazaki，eta1．，2007)。我国对Tospovrirus的研究较少，许泽永实验室报道该属有5种病毒可侵染花生，是侵染花生病毒种类最多的一个病毒属(陈坤荣等，2005)，云南农业科学院植物病毒实验室研究发现Tospovrirus在云南广泛分布，从海拔300多米的热带气候类型区到海拔3000多米寒带气候类型区均有分布，目前已分离鉴定出6种该属成员，其中番茄环纹斑点病毒(Tomatozonatespotvirus，TZSV)是该属新种，同时也是该属病毒在云南的优势种，在云南大部分地区发生，局部地区甚至造成毁灭性损失(Dong，eta1．，2008)。1．1．1番茄斑萎病毒属病毒的分类番茄斑萎病毒属为布尼亚病毒科(Bunyaviridae)中唯一一类侵染植物的病毒，国际病毒委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV)已公布了番茄斑萎 病毒属的8个确定种和8个暂定中，随着研究的不断深入，该属的新种也不断被发现，并表现出了新的特征。目前该属确定种和暂定种已达20种之多(seepiban，eta1．，2011)。其中已报道病毒有，番茄斑萎病毒、番茄褪绿斑病毒(Tomatochloroticspotvirus，TCSV)(Deavila,eta1．，1993)、番茄黄斑病毒(Tomatoyellowringvirus，TYRV)(Hassani．Mehraban，eta1．，2005)、番茄环纹斑点病毒(Tomatozonatespotvirus，TZSV)、六出花坏死条纹病毒(Alstroemerianecroticstreakvirus，ANSV)(Hassani．Mehraban，eta1．，2010)、辣椒萎黄病毒(Capsicumchlorosisvirus，CaCV)(McMichael，eta1．，2002)、马蹄莲褪绿斑病毒(Callalilychloroticspotvirus，CCSV)(Chen，eta1．，2005)、菊花茎坏死病毒(Chrysanthemumstemnecrosisvirus，CSNV)(Resende，eta1．，1996)、花生芽枯病毒(Groundnutbudnecrosisvirus，GBNV)(Reddy，eta1．，1992；Satyanarayana,eta1．，1996)、花生环斑病毒(Groundnutringspotvirus，GRSV)(Deavila,eta1．，1993)、花生黄斑病毒(Groundnutyellowspotvirus，PYSV)(Satyanarayana，eta1．，1998)、花生褪绿扇型斑病毒(Peanutchloroticfanspotvirus，PCFSV(ChenandChiu,1996)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiensnecroticspotvirus，rNSV)(Law，etal，1991)、鸢尾花黄斑病毒(Irisyellowspotvirus，IYSV)(Cortez，eta1．，2001)、甜瓜黄斑病毒(Melonyellowspotvirus，MYSV)(Kato，eta1．，2000)、甜瓜重型花叶病毒(Melonseveremosaicvirus，MeSMV)(Ciuffo，Kurowski，Vivodaeta1．，2009)、西瓜芽枯病毒(Watermelonbudnecrosisvirus，WBNV)(Hassani-Mehraban，eta1．，2010)、西瓜银色斑驳病毒(Watermelonsilvermottlevirus，WSMoV))(Jain，eta1．，1998)、南瓜致死褪绿病毒(Zucchinilethalchlorosisvirus，ZLCV)(Resende，eta1．，1996)、蓼环斑病毒(Polygonumringspotvirus，PRSV)(Ciuffo，eta1．，2008)和酸浆重型斑驳病毒(Physalisseveremottlevirus，PSMV)(Cortez，eta1．，2001)。根据研究数据、序列比对和系统发生学分析，云南优势种TZSV更接近于WSMoV组，属于WSMoV血清组，而非TsWV血清组，且与Tospovirus其它成员的同源性较低(见图1．1)(Dong，eta1．，2008)。因此，我们在对新病毒TZSV展开研究的过程中，选取该属典型种，也是目前各方面尤其细胞间运动研究较多的Tsw．V作为对照，由于两者既有相似又存在较大差异，因此本研究力图在现有研究基础上，探究清楚两个病毒的差异，为研究大分子颗粒胞间运动的确切机制提供材料。 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述CG艄3cp鼬13IRdRp图1．1Tospoviruses病毒系统树分析Fig1．1Phylogenetictreesoftospovirusesbasedonaminoacidsequencesof(a)Nprotein，(b)NSmprotein，(c)Gn／Gcprotein，and(d)RdRp．(Bootstrapvaluesonthebranchesrepresentthepercentageof500bootstrapreplicates．1．1．2番茄斑萎病毒属病毒的基因组结构Tospovirus病毒粒体为球状体，病毒颗粒较大，直径大约有80～110nm，核壳体直径也有60nm，粒体外层由一层脂质包裹，脂质由二种被称为G1和G2的多糖蛋白组成。与其它布尼亚病毒科侵染人和动物的成员类似，Tospovrirus为三基因组RNA病毒，基因组从大到小分别被称为LRNA、MRNA和SRNA，其中ssRNA．L为负义，ssRNA．M和ssRNA．S为双义，每个RNA片段末端核苷酸碱基互补配对，从而形成一个锅柄状结构。TswV三个RNA片段末端8个核苷酸(序列为3’UCUCGUUA⋯⋯)高度保守，但INSV只有MRNA和SRNA末端8个核苷酸系列为保守区。番茄斑萎病毒的LRNA片段为单个开放阅读框架(ORE)，编码一个大蛋白，该蛋白可能是依赖于RNA的RNA复制酶(RdRp)(DeHaan，etal．，1991)。MRNA片段的互补链≈ 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述RNA编码两个糖蛋白G1和G2，病毒链RNA编码非结构蛋白(non—strucRkralprotein，NSm)。S链的互补RNA编码外壳蛋白，病毒链RNA编码非结构蛋白NSs，NSs在寄主细胞中可形成拟结晶状或纤维状内涵体，其功能未知。在病毒之间，G1／G2蛋白比核衣壳蛋白(nucle--oprotein，№更保守。Sin等最新研究证明，由MRNA编码的病毒膜多糖蛋白与蓟马传播特性相关(Sin，eta1．，2005)，而由MRNA正义链编码的非结构蛋白NSm是唯一一种该科其它动物侵染性病毒所不能编码的蛋白，被认为是番茄斑萎属病毒适应植物的结果(Li，eta1．，2009)。该蛋白与病毒在细胞间的运动有关，并能在原生质体中刺激形成管状体结构(图1．2)。RdRpIo—t|]nlllllIIIIIII．IIIIIIIIIiilMGn／GcS焉NSHsL纠图1．2Tospovrirus基因组结构Fig．1．2GenomicorganizationofTospovrirusTZSV属于Tospovrirus中的WSMoV血清组，离体负染色电镜观察直径为85nm～100rim，超薄切片中的直径为85rim。TZSV基因组结构与Tospovrirus代表种TswV相似，也为三分基因组，其中LRNA全长8919nts，编码332．7kDa的复制酶(RdRp)；MRNA全长4945nts，编码34．4kDa的非结构蛋白(NSm)及127．4kDa的糖蛋白(Gn／Gc)；SRNA全长3279nts，编码51．9kDa的非结构蛋白(NSs)和30．6kDa核壳体(N)蛋白，N蛋白序列与已报道的Tospovrirus中马蹄莲褪绿斑点病毒相似性最高，为80．9％，与代表种TSwV基因组编码的蛋白相似性在45．5％以下，其中运动相关蛋白(NSm)相似性为38．7％(Dong，eta1．，2008)。1．1_3生物学特征TswV侵染寄主后，即使是在同一寄主植物上，也会因品种、生长期、营养状况和环境条件的的变化诱导多种症状：TswV侵染的番茄，叶子呈青铜色、卷曲、出现坏死条纹和斑点，叶柄、茎和茎尖也产生黑褐色条纹，被害植物矮小。红色或黄色的番茄成熟时4 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述表皮出现暗红色和黄色块斑。坏死严重时，能够导致植株死亡。受害的辣椒，植株发生矮化和黄化，叶片出现褪绿线纹或花叶并伴有坏死斑，茎上坏死条纹从茎部蔓延至枝端。成熟果实产生黄化，伴有同心环或坏死条纹。在感染的幼嫩烟草叶片上会出现坏死的同心圆斑和坏死的环带状斑点。初时，叶斑为黄色，而后迅速转为红褐色。病株会出现发育不良，顶芽脱落或弯曲。沿茎秆会出现坏死条纹，茎的表皮和髓部可能出现暗色的坏死区域或空洞，而病株很难收获到可调制的叶片。烟草的幼苗到成熟阶段都可能受害。同TSwV相似，依据品种、侵染的阶段及环境因素的不同，番茄环纹斑点病毒的症状差异也较大。在植物生长的早期阶段被TZSV侵染，可诱使植株无果和严重的萎缩。受感染的番茄叶片通常具有褐色的环纹斑；幼叶通常产生大量的白绿相加的斑点，并迅速坏死，老叶上可见大片的环纹状坏死斑；幼果感染病毒，果实表面略有凹陷的斑块或小的坏死环斑点，通常畸形，但仍然保持绿色；在成熟的果实上，可以明显看到红白相间或红黄相间的环斑。对于辣椒来说，叶子上的褐色斑及果实上的同心环斑不太明显，但是会产生叶片褪绿和果实上出现褪绿的环斑。被侵染的植物，初期症状包括叶脉，叶柄和茎的内部局部坏死性病变。如果症状全面发展，茎内部的坏死会扩大，最终导致整个植株死亡(Dong，eta1．，2008)。1．2病毒细胞间运动模式在主要的植物病原物(包括细菌、真菌、线虫和病毒)中，病毒完全生活在寄主的共质体中，这种生活方式要求病毒必须在细胞间进行移动以获取足够的物质供应保障生存；而且其基因组很小，所利用的基因组材料有限，有些病毒的一个基因组少则编码3种蛋白，多的甚至可编码多达10～15种之多，因此任何一个基因组的每一个基因都代表了一项重要功能。但是有一类蛋白是每一个病毒都会编码的一一运动蛋白(movementprotein，MP)(Schoelz，eta1．，2011)。植物病毒在寄主体内的成功侵染依赖于病毒在寄主体内的扩散。每个植物细胞都有纤维质的细胞壁包被着，动物病毒通过受体介导的吞噬作用和细胞融合的运动机制不适合于植物病毒(Giesman．CookmeyerandLommel，1993)。因此植物病毒必须首先通过机械或介体造成的微伤进入植物细胞，然后进行复制、装配，再利用MP的协调从侵染点细胞向周围健康细胞运动。病毒在寄主体内的运动可分为两个阶段，即细胞与细胞之间的短距离运动和组织之间的长距离运动。目前没有研究显示病毒有降解细胞壁的能力，因而胞间连丝(Plasmodesmata，PD)是病毒从初侵染细胞到达周围健康细胞的唯一通道。很早之前研究人E 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述员就发现无论何种形式的病毒粒体相对于未修饰的PD来说都过大而难以通过，因此MP的一个重要功能就是扩大PD以允许部分形式的病毒到达相临的细胞(Wolf,eta1．，1989)。病毒穿过胞间连丝的过程是一个主动运输的过程，这个过程需要通过一种由病毒自身编码的非结构蛋白一运动蛋白与寄主细胞内多种亚细胞结构的相互作用来实现。依据MP改变植物PD结构的变化程度以及病毒穿过PD的核酸一蛋白复合体的形式，MP可以明显的分为两类(Benitez-Alfonso，eta1．，2010；NiehlandHeinlein，2011；Scholthof,2005)。一些病毒的MPs，以烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)为例，可以通过增加胞间连丝分子扩散上限(sizeexclusionlimit，SEL)而实现MP．RNA聚集体在细胞间转移，但是不导致PD产生明显可见的结构变化。另一些MPs，例如豇豆花叶病毒(Cowpeamosaicvirus，CPMV)、花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus，CaMV)，可以通过参与去除PD内紧密连接内质(endoplasmicreticulum，ER)的连丝微管，导致中心孔扩张的方式显著改造PD结构以达到使直径宽达50rim的病毒体穿过PD的目的，研究者认为这些病毒的MP可以形成一管状结构插入PD方便病毒的运输。ti◆，吖／／"myosinVIII图1．2形成管子的MP和不形成管子的MP修饰PD的模式(引自AnnetteNiehl·ManfredHeinlein，2011)Fig．1．2ModelforPDmodificationbytubule-formingandnon-tubule-formingMP．a：Structureofnon。modifiedPD；b：PDmodificationbyGFLVMP，assemblyofGFLVMPintotubulesoccursuponinteractionoftheMPwithPDLP；c：InthepresenceofTMVMP，1，3-13-glucanaseisdeliveredtothecellwallanddegradescalloseatthePDneckregion，leadingtodilationofthePDpore．不同类型的病毒在胞内增殖与扩散、胞间移动侵染等行为有较大差异，目前有假说认为病毒会依据寄主种类及环境因素改变他们细胞运动的策略。但是按照MP的基因组成和运动特点，目前已了解的植物病毒胞间运动基本可归类为四大类： 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述1．2．1运动蛋白／核酸(MP／RNA)复合体模式烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的TMV编码的运动蛋白属于运动蛋白的“30K超级家族”(Melcher，2000)，该类蛋白是运动蛋白中的一个大家族，主要依据运动蛋白的预测二级结构来归类，属此类MP的有烟草脆裂病毒属(Tobravirus)、香石竹环斑病毒属(Diantovirus)的成员。该类型的特点是基因组编码单个MP，MP能与ssRNA和ssDNA结合，把病毒RNA或DNA从散乱的螺旋转折叠变成直型管状，缩小直径，形成蛋白．核酸复合物(viralribonucleoproteincomplexes，vRNes)，从病毒复制复合体(viralreplicationcomplex，VRC)上释放出来，借助ER和细胞骨架的帮助到达细胞的边缘，在此过程中，微管末端结合蛋白1(Microtubuleend-bindingprotein1，EB1)可能促进v时岬s的附着和分离，在PD处MP与PD互作扩大SEL，复合体通过通道扩大了的PD，到达新的细胞(见图1．5a)。现在的研究结果显示，一方面TMVMP具有切断微丝的功能(su，eta1．，2010)，而破坏激动蛋白丝又可能导致SEL的扩增；另一方面该蛋白可能与一种寄主感受器一一锚蛋白重复包含蛋白(ankyrinrepeatcontainingprotein，ANK)在PD处互相作用，这种相互作用有可能降低PD处胼胝质的聚集，从而增大SEL促进病毒的细胞间运@(Ueki，eta1．，2010)。值得注意的是，TMVMP也能与钙网蛋白相互作用。钙网蛋白能够调节细胞内ca2+的浓度，有时在PD处能与ER及其腔道连结。研究证明，这两种蛋白在体内外都可成功互作，且具有相似的PD处亚细胞定位方式。虽然两者的互作在病毒运动过程中的重要性不是很清楚，但是如果在细胞内过表达钙网蛋白，会导致MP从PD向微管逆转，严重阻碍病毒的扩散(Chen，eta1．，2005)。同时，TMVMP-VIⅢA复合体在运动的过程中也会受到磷酸化和去磷酸化的调节，PAPKl、CK2等细胞内的激酶与MP的相互作用也是细胞成功侵染的关键(Lee，eta1．，2005；Matsushita，eta1．，2003)。烟草花叶病毒的胞间运动不需要外壳蛋白CP的参与，但是雀麦花叶病毒属(Bromoviruses)的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)和雀麦花叶病毒(Bromemosaicvirus，BMV)虽然具有“TMV类”运动蛋白，但是单独的运动蛋白不足以转运核酸，必须在外壳蛋白的辅助下才能进行。植物病毒的胞间运动是否需要CP的参与依赖MP和病毒RNA的亲和性，牢固的RNA绑定MPs方式不需要CP的参与，例如TMV；而较弱的RNA结合MPs方式则需要CP的帮助，像CMV(LiandPalukaitis，1996)。 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述1．2．2管状结构模式该模式的运动蛋白可使PD发生显著的变化，包括去除PD孔内的连丝微管，降解PD处的胼胝质，MP形成管状结构插入PD孔，增大SEL等。PD孔内的连丝微管消除表明，尽管病毒从复制位点到PD管状结构处的细胞内移动活动需要内膜系统的参与，可是，病毒在PD处细胞间移动可能与内膜系统无关。属于该模式的病毒主要包括豇豆花叶病毒属、线虫传多面体病毒属(Nepovirus)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)、番茄斑萎病毒属等(RitzenthalerandHofmann，2007)。研究结果显示，在原生质体内表达该种模式的MP，会导致原生质体表面产生管状结构向四周延伸。当病毒成功侵染后，首先在初侵染细胞发生脱壳作用，然后开始复制、翻译，随着病毒的组装，新合成的病毒粒子被转运到PD。MP和病毒粒子或核蛋白复合质是如何从细胞质内组装和聚集位点转运到PD管状结构处有待进一步的研究。但是，由于PD孔内包含MP的管子形成涉及到连丝微管的去除，ER的连续性在该种病毒运动机制中不再存在，因此利用分泌途径可能是该种病毒细胞内移动及胞间连丝定位的主要方式。研究显示，加入细胞骨架抑制剂不会影响CPMVMP的细胞壁定位和管状结构的产生。然而，通过分泌途径抑制剂的影响，MP管状结构的生成会受到影响而细胞壁定位却正常，可能意味着有寄主因素参与到该运动过程(Pouwels，eta1．，2002)。以葡萄扇叶病毒(G唧Pv砌e细彪矿virus，GFLV)为例管状结构模式的病毒运动方式为：首先，病毒在ER膜处进行复制，MP在细胞质内扩散，病毒在病毒发生基质处组装；然后，PDLP一一一种寄主PD定位蛋白，先利用分泌途径传送到质膜上，然后在质膜上扩散到PD处；其次，病毒利用MP或自由扩散方式到达PD，MP和PDLP在PD发生相互作用，诱导PD内形成由MP组成的管状结构，单向突进到邻近细胞，这种延伸的微管可能被细胞骨架结构固定在一个或两个细胞，在细胞内装配的病毒粒子通过与MP互作，被运送到PD，然后，完整病毒粒子通过专化性的MP与CP相互作用而运送到管状结构里，随后被运送到邻近的细胞里去；最后，在临近的细胞，管状结构的稳定性破坏，释放病毒粒子以达到进一步的侵染(图1．5b)。对于不同的病毒，关于MP是如何定位到PD处的，也有研究者将其划分为两种定位机制：机制一，以GFLV为例，MP定位于来源于高尔基体的分泌小泡表面，沿着微管转运到PD(Laporte，eta1．，2003)；机制二，以CPMV为例，MP定位于来源于高尔基体的分泌小泡表面，首先移动到细胞质膜，然后定位到PD(见图1．4)(Carvalho，eta1．，2004；Pouwels．eta1．，2003；Pouwels，eta1．，2004)。 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述图1．4管状结构模式病毒的细胞内和细胞间运动Fig．1．4Schematicrepresentationoftheintracellulartraffickingandceil=to-cellmovementstepsduringinfectionwithtubule-formingviruses．在所有利用管状结构进行细胞间运动的病毒当中，TswV比较特殊，因为该病毒被一层来源于寄主的囊膜包裹，且病毒颗粒很大，直径大约有80～110rim，核衣壳直径也有60nm，而以整个病毒粒子通过管状结构的豇豆花叶病毒的直径才28～30nm，且无囊膜包裹，如此大的差异预示着TswV以管状结构通过PD应当存在一些特殊方式。迄今为止，尚未有TSw-V以完整病毒粒子或者核壳体形式穿越胞间连丝管道的直接证据，因此像TSwV这样的大颗粒病毒有可能存在着新的胞间运动机制。1．2．3三基因盒模式该模式的特点是运动蛋白为三基因连锁，病毒基因组中三个开放阅读框(openreadingframe，ORE)部分重叠，三个ORF编码的蛋白都与病毒运动相关，分别命名为TGBl，TGB2和TGB3。代表属包括马铃薯x病毒属(Potexvirus)，香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，青葱x病毒属似llexivirus)，凹陷病毒属(Foveavirus)，大麦病毒属(Hordeivirus)，甜菜坏死黄脉病毒属(Benyvirus)，马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)和花生丛簇病毒属(Pecluvirus)等。根据TGB初级结构和功能的差异，分为hordei．1ike和potex-like两类。在病毒的运动中，它们之间存在一个很大的区别，即hordei．1ike类的细胞间转运无需CP参与，而potex．1ike病毒则需要在CP的存在下完成细胞与细胞之间的运动(NiehlandHeinlein，20111。该模式所有病毒的TGBl蛋白能够绑定RNA，且具有核苷酸水解酶(NTPase)／解螺旋酶(helicase)活·l生(Donald，eta1．，1997；Kalimna，eta1．，2002；Leshchiner，eta1．，2006；Q 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述Makarov，eta1．，2009)。值得注意的是，Potexvirus的TGBl能够在细胞内独立移动，但是hordei．1ike类病毒必须在TGB2和TGB3的参与下才能移(Verchot．Lubicz，eta1．，2010)。TGB2蛋白12～14KDa大小，具有显著的序列相似性，含有两个预测的跨膜区域和一个保守的亲水环；该蛋白能以一种序列非特异性方式绑定RNA，部分种类的TGB2蛋白还能够扩大PD的SEL。TGB3蛋白的序列保守性较差，蛋白分子量从7-24KDa不等，较大的TGB3蛋白，主要来自于hordei．1ike病毒，具有两个跨膜区域，而较小的potex．1ike类TGB3蛋白则只有一个跨膜区域。TGB蛋白之间可发生相互作用，例如大麦条斑花叶病毒的TGB3和TGBl可利用酵母互作，但是目前尚未发现TGBl和TGB2互作的证据(Cowan，eta1．，2002；Lim，eta1．，2008)。三基因盒模式主要是病毒核糖核蛋白复合体(vRNP)通过PD。以hordei．1ike类的大麦条纹斑花叶病毒(Barleystripemosaicvirus，BSMV)为例，首先，病毒在叶绿体膜处复制，进入到细胞质中于TGBpl结合，形成TGBpl．RNA复合体；然后，该复合体与具有完整膜结构的TGBp2和TGBp3结合，在细胞骨架的帮助下沿着内质网(ER)移动，最终定位到PD；TGBp2能够结合寄主因子胼胝质降解酶TIP来调节PDSEL，TGBp3为完整的膜蛋白，主要在病毒的细胞内转运中起作用，引导TGBp2靶定于细胞边缘；在PD孔处，TGBp2和TGBp3与寄主受体蛋白相互作用，共同引导病毒复合体通过PD，随后，TGBp2和TGBp3可再次循环作用。与hordei—like类病毒不同的是，potex．1ike类病毒CP与TGBl的互作才能协助病毒运动，且TGBl具有定位PD的能力，可以增大PD的SEL，能够独立在细胞问运转。1．2．4双生病毒模式双生病毒是植物病毒中惟一具有单链DNA的单分体或二分体基因组病毒。该类病毒在细胞间的运动需要两个MP的相互合作才能将细胞核中复制的病毒基因组移动到PD，通过管状结构穿过细胞壁，其中单组分病毒的运动需要cP的存在(Rigden，eta1．，1994；Rojas，eta1．，2001)，而双组分病毒在部分寄主内的运动过程和系统侵染过程都不需要cP的存在，说明该类病毒能以非成熟粒子的形式在细胞间进行有效的运动(Padid锄，eta1．，1995)。以菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)南瓜曲叶病毒(Squashleafcurlvirus，SqLCV)的MP为代表，SqLCV编码两种MP：核穿梭蛋白烈SP，也称BRl)和MP(也称BLl)，两个MP的协同作用才能完成病毒的胞间穿越。NSP相当于分子伴侣，结合病毒新合成的1n 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述单链基因组DNA，并将其由细胞核运输至细胞质；MPB定位于胞间连丝，与ER衍生的管状结构互作，识别并结合细胞中的NSP．DNA复合物，并调节PD的SEL，通过管状结构的引导携至原生质体膜，从而穿过细胞壁完成运输。SqLCVMP只能与ssDNA结合，它的两种MPBLl和BRl的共同作用形成BLl．BRl．ssDNA复合物才能介导ssDNA穿过胞间连丝(Pascal，etal．，1994)，而同属双生病毒的菜豆矮缩花叶病毒(Beandwarfmosaicvirus，BDMV)编码的BLl和BRl两种MP，BLl只能与双链DNA(DoublestrandedDNA，dsDNA)结合并介导其转移(Noueiry，eta1．，1994)，BRl既能与dsDNA结合也能与ssDNA结合并介导其转移。aTMVbGFLV‘一●；f．’0af．●·q和ql,¨Pr|∞l啊毒●vRN^vRNPEBI●■■-●●■一n州了口饥CuIeaF．t,nCBSMVr■—■—忑11飞●§●’曩roaDlTG8p2'GBp3唧妇聃VR№VR咿●一_—“：鹏怕嚆I相ma蜘岫icln1●-vRt执w1"101"1pDLpdCaLCuV汐l一删^j●SPNIGl—剐斑岣考mm图1．5病毒细胞间运动及PD定位模式Fig．1．5ModelforPDtargetingandcell·to—celltransportmechanismsofviruses．11 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述目前，植物寄主因素与病毒运动的相互作用是研究的热点，最近研究结果显示植物synaptotagmin一一一种涉及内吞作用的分泌蛋白，在大白菜曲叶病毒(Cabbage昆矿curlvirus，CaLCuV)的运动过程中具有重要作用(Bassham，eta1．，2008)。CaLCuV以vDNA．protein．complex的形式进行细胞间运动。NSP将ssDNA穿梭带入细胞核内进行复制，复制后的基因组又在其的帮助下转出核进入细胞质进行cell．to．cell的移动，该过程需要植物因子NIG一一NsP．interactingATPase的帮助完成。在细胞质中，DNA-NSP粒子被MP捕获，通过自由扩散或连接ER网络结构移动到质膜上，同时MP在质膜上与synaptotagmin发生相互作用。Synaptotagmin调节MP或者MP-NSP-ssDNA复合体通过endocytotic-recapture方式到达PD(图1．5d)。有趣的是，synaptotagmin同样可以与TMVMP发生相互作用，降低该蛋白的表达量可以抑制TMV的细胞间运动。因此，RNA病毒和DNA病毒在转运过程中可能存在一些共同特征。除上述几种模式外，还有些病毒的运输机制至今不明，需要进一步研究，如基因组片段多达10个以上的植物呼肠孤病毒，病毒种类庞大的马铃薯Y病毒科的病毒。而且病毒的转运也并不总是以单一模式进行，有些病毒甚至具有几类运动蛋白的特点。同时病毒在细胞内和细胞间的运动还需要多种植物因素的参与，即使属于同一种模式运动的病毒，在真实运动过程中也存在很大的差异，因此病毒在寄主胞内和胞间的扩散和运输的精细分子机制远比想象的要复杂的多。病毒在侵染点成功扩散后，必须通过叶肉细胞的维管束系统，进入物质运输的快速通道一筛管进行长距离运输达到系统侵染。由于成熟的筛管分子没有细胞核、核糖体以及其它许多重要的细胞器，不具备合成蛋白质的能力，病毒也不能在此复制，因此病毒进出筛分子的过程需不同于MP的一些病毒因子和寄主因子的参与。病毒长距离运输涉及的结构较多，机理复杂，因此有关病毒的运动蛋白在病毒长距离运输过程中的作用的报道很少，仅有少量证据表明MP在病毒长距离运输过程中起到特殊作用(Carrington，eta1．，1996)。1．3选题的意义、研究内容和目标1．3．1选题的意义Tospovrirus是全球范围内广泛分布和危害严重的十几种重要植物病毒之一，是目前已知寄主范围最广的植物病毒。2008年新报道的番茄环纹斑点病毒是该属新种，同时也是该属病毒在云南的优势种，在云南大部分地区作物，在番茄和辣椒上引起叶部环斑、顶 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述芽坏死及果实黄化或坏死环斑，在局部地区造成毁灭性损失。我国大陆对Tospovrirus的研究较少，目前TswV的胞间运动机制有了一定的研究基础，但是尚未有TZSV关于胞间运动方面的报道。植物病毒的胞间运动是病毒对寄主植物侵染为害的关键环节，也是植物病毒研究中的前沿和热点，对于揭示植物病毒侵染为害机制具有重要的意义。对于大颗粒植物病毒如番茄斑萎病毒属病毒(Tospovrirus)、植物呼肠弧病毒(Phytoriovirus)等的胞间运动研究较少。关于Tospovirus致病性的相关研究，Storms等确定了NSm的运动相关蛋白功能，Soellick等人对NSm的作用机制进行了研究，Kikkert等人应用原生质体模型研究了Tswv的侵染。有关Tospovirus在寄主体内的运动及其致病性的相关性未见有确定的报道。本研究在此基础上，进一步深入探讨TSwV和TZSV在不同寄主上的细胞病变差异，病毒在细胞内存在的形式，以明确该属新种TZSV的运动蛋白和TswrV的运动蛋白在植物表皮细胞和昆虫Tn细胞内定位的差异；通过构建两种蛋白的原核表达，制备NSm多克隆抗血清，进行NSm的细胞免疫标记定位，了解两种蛋白的分子生物学差异，为进一步深入了解大颗粒病毒在细胞内的运动机制奠定基础。1．3．2研究内容和目标1、将TswV、TZSV分别接种烟草、辣椒、曼陀罗等寄主，运用高压冷冻电镜和常温电镜技术研究感病细胞的超微结构变化、病毒的复制装配场所、病毒粒子存在形式、细胞器的病理结构变化，重点观察研究两种病毒之间以及不同寄主之间的细胞病理差异，分析两种病毒的基因组结构和致病性上的差异以及不同电镜技术还原细胞真实状况的差异。2、利用绿色荧光蛋白GFP分子标记TswV、TZSV的NSm蛋白，在激光共聚焦显微镜下观察两种蛋白在植物活体细胞和昆虫Tn活体细胞内的亚细胞定位，初步明确TZSV的运动蛋白，以及两种NSm蛋白在植物细胞和昆虫细胞内的定位情况和可能存在的差异。3、原核表达两种NSm蛋白，制备多克隆抗体，免疫胶体金标记两种蛋白各自在感病寄主细胞内的分布，推测病毒运动的可能方式。 塑坚奎堂强士堂垡论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察许多病毒给农、林、牧、渔等关系国计民生的重要产业造成了巨大的危害和损失，甚至人类的生命健康也受到一些病毒的威胁。因此，病毒学的研究成为当前国际科学研究的前沿和热点，电子显微镜在病毒的形态、病理、分类研究等方面都发挥了很大的作用。在植物病毒诊断鉴定中，利用电子显微镜技术可以直观了解不同病毒粒子的形态、大小、表面微细结构、有无包膜等重要特征，根据其特征可以确认其归属。除了病毒粒子形态以外，寄主植物受病毒侵染后所发生的细胞超微病理变化，尤其是内含体的形态结构也是诊断鉴定的重要依据(洪健等，2001)。用时在电镜下还可以直观研究病毒在细胞内的复制、增殖、胞间运输等过程，了解病毒侵害寄主的机理。为了更好的研究生物体的结构，在制备电镜样品时，人们一直希望在保存样品天然结构的同时，使之更加接近原来的生活状态。1952年Femandez．Moran就提出了把预先冷冻的样品在冷冻的条件下制备成超薄切片的方法(Fernandez．MoranandDahl，1952)，随着技术的不断进步，高压冷冻．冷冻置换技术(HPF．FS)日趋成熟。实践证明，冷冻样品制备技术，如冷冻干燥、冷冻置换、冷冻切片和冷冻复型，与常规样品制备技术相比，可较好地保存样品天然结构，有效地研究细胞内发生的快速变化，它们的共同特点是可快速对样品进行固定，避免常温样品制备过程中由化学固定剂和脱水剂等对组织结构产生的化学和物理因素等不利影响，减少细胞内各种物质的抽提丢失，使得生物大分子结构及酶的活性均可得到良好保存。新鲜样品高压冷冻固定后，可利用冷冻置换技术在低温下通过不会结冰的无水有机溶剂将样品中的水分置换出来，然后用树脂进行浸透和聚合，在室温下进行超薄切片。该方法不但对保存细胞有利，而且减少了化学固定、脱水引起的一些细胞化学成分及化学元素的丢失和移位。为了能够较为深入的对TswrV和TZSV两种病毒的细胞病理变化和胞间运动机制进行比较研究，我们使用常规电镜技术观察了两种病毒在植物细胞内的形态及细胞病理变化，同时应用高压冷冻一冷冻替代技术制备样品进行比较观察。为研究植物病毒的细胞病理学提供新的实验方法。14 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病重的塑堕堕里奎垡堕墼塑窒2．1材料和方法2．1．1材料2．1．1．1病株材料感染番茄斑萎病毒的烟草(Nicotianatabacum)，曼陀罗(Daturastramonium)，辣椒(Capsicumannuum)叶片取自浙江省农科院。感染番茄环纹斑点病毒的烟草(Nicotianatabacum)叶片由云南省农科院生物技术与种质资源研究所提供。2．1．1．2试剂Spun"’包埋剂、四氧化锇、戊二醛、1-hexadecene(十六碳稀)等均为进口。其它化学试剂均为国产分析纯。2．1．1．3仪器BAL-TECHPMl00高压冷冻仪(瑞士BAL．TEC公司)，LeicaEMAFS冷冻替代仪(德国Leica公司)，H．7650透射电子显微镜(日本Hitach公司)，Reichart—JungULTRACUTE型超薄切片机(奥地利Reichert．Jung公司)。2．1．2方法2．1．2。1常规化学固定和包埋1)将植物叶片病健交界处切成lmm×3mm的小块，置于0．1mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)配制的2．5％戊二醛固定液中，抽气至完全下沉，4"C固定3hr或过夜；2)吸去固定液，加入o．1mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)漂洗3次，每次15min；3)吸去漂洗液，在通风橱中加入相同缓冲液配制的1％四氧化锇后固定lhr；4)吸出固定液，加入0．1mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)漂洗3次，每次15min；5)吸去缓冲液，依次用50％、70％、80％、90％、95％乙醇梯度脱水，每次15min，100％乙醇20min，100％丙酮20min；6)配制Spurr’或Epon812包埋剂，loo％丙酮：包埋剂=1：1(v／v)浸lhr；7)100％丙酮：包埋剂=l：3(v／v)浸3hr；8)将样品置于新管中纯包埋剂渗透6hr或过夜；9)样品置于eppendorf管部，70"(2下聚合9hr以上或过夜。 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察2．1．2．2高压冷冻固定和冷冻替代本实验过程是在上海同济大学生命科学学院完成的，具体步骤如下(吴鸿等，2000；祝建等，1999)：1)在叶片病健交界处用直径为2mm的打孔器取材，制备叶片样品圆片；2)将样品放入铝制夹盘中，并用1-hexadecene填充夹盘内的剩余空间，然后用另一平底铝盘盖住夹盘后，将夹盘置于冷冻固定夹中，最后将固定夹插入高压冷冻仪进行冷冻固定；3)取下样品，快速转移至冷冻替代仪中．90。C预冷的1％锇酸．丙酮溶液，停留8hr；4)转移样品，至．60"(2预冷的1％锇酸．丙酮溶液，停留8hr；5)转移样品，至．30。C预冷的l％锇酸一丙酮溶液，停留8hr；6)转移样品，至0℃预冷的1％锇酸．丙酮溶液，停留lhr；7)O℃下更换纯丙酮，换洗2×15min，并去除铝盘；8)转移样品，至100％丙酮：Spurr’包埋剂=7：3(v加)，4"C下浸透12hr；9)转移样品，至100％丙酮：Spun"’包埋剂=3：7(v／V)，4℃下浸透48hr；10)转移样品，至纯Spurr’包埋剂，40C下浸透4hr或过夜；11)将样品和纯包埋剂置于包埋模具内，进行温度梯度聚合，37"(2，12hr；45℃，12hr；60℃，48hr。2．1．2．3样品的超薄切片上述化学固定和高压冷冻固定的样品经过定位、修块后，在Reichart．JungULTRACUTE型超薄切片机上切片，切片厚度60～80nm，收集于200目有膜载网上备用。2．1．2．4超薄切片的染色制备好的切片，用醋酸铀和柠檬酸铅溶液进行双重染色，具体方法如下：1)将载有切片的铜网竖直插入到染色胶板的缝隙中(一次可以染几片到几十片)，要保证切片大部分留在外面；2)用滴管将醋酸双氧铀染液滴到胶板上，保证液体完全覆盖切片，之后，胶板置于避光培养皿中浸润10～15min；3)倾掉胶板上的染色液，ddH20清洗20～30次，滤纸吸除铜网上的水滴(不要吸得太干)；4)用滴管将柠檬酸铅染液滴到胶板上，保证液体完全覆盖切片，之后，胶板置于避 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察光培养皿中浸润10～15min(培养皿中加入少许NaOH颗粒，以吸收C02，防止柠檬酸铅沉淀)；‘5)ddH20清洗20～30次，滤纸吸去水滴，晾干后即可进行电镜观察。2．1．2．5超薄切片的电镜观察所有样品切片均在H．7650型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)下观察，电镜加速电压80kV。用Gatan832型CCD相机(美国Gatan公司)记录图像。2．2结果与分析2．2．1化学固定感染TSwV的植物叶细胞病理变化Tswv侵染烟草、曼陀罗、辣椒的症状差异很大，但是超微结构下，TswV病毒在不同植物内的形态却一致，细胞病理变化基本相似。在不同植物的细胞结构内，TSwV均为80～120nm大小的病毒粒子聚集在内质网池内(图2．1B、C)。病毒主要分布在细胞质内，大部分聚集在内质网池中，也有少数病毒以单个粒子或两三个粒子分散在细胞质内，细胞核和液泡内均无分布。在侵染的早期阶段，可观察到大量的病毒质聚集块，其周围可观察到组装完成的病毒颗粒(图2．1A)。细胞核、线粒体、叶绿体等细胞器初期能看到完整的结构，但是叶绿体内部出现囊泡化现象，有的在叶绿体顶端出现一大的囊泡(图2．1D)，有的在叶绿体膜附近出现多个小的圆形囊泡，同时大多数的叶绿体片层膨大，有的甚至整个叶绿体崩解。叶肉细胞内线粒体亚细胞结构较完整，但是出现不正常延长，数量增多、聚集的现象(图2．1E)。内质网结构变化较大，尤其是粗面内质网，内质网腔变大，形状不规则，内含已包装完成的成熟病毒颗粒，粗面内质网的表面仍有核糖体附着(图2．1A、B、C)。高尔基体本身结构复杂且相对较小，目前结果观察与正常情况下无较大差异(图2．1F)，但是有研究显示高尔基体在TSwV的合成、组装及细胞内转移过程中具有重要作用。细胞核受病毒影响较小，核仁和染色体与正常叶片相同，但是偶尔会在核膜处观察到类似高尔基体潴泡结构小囊泡在不封闭的核膜附近散状分布，该结果是否为病毒产生异常现象尚未可知(图2．1G)。部分细胞壁的PD结构有膨大现象，但是即使在同一条膨大的PD上也存在宽窄不一的地方，其它细胞器结构如过氧化物酶体(图2．1H)等均无较大病理结构变化。观察多种TswrV侵染寄主的细胞超薄切片样品，均没有发现类似其它病毒产生的特殊内含体结构，至今也没有报道该属病毒具有产生内含体的病理变化结果。 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察蓄蕊鲢图2．1Tswv侵染的烟草叶片细胞超微结构变化Fig2．1UltrastructureofN．benthamianaleavesinfectedwithTSWVER．内质网CW．细胞壁M．线粒体CH．叶绿体G．高尔基体N．细胞核P．过氧化物酶体 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察2．2．2化学固定感染TZSV的植物叶细胞病理变化TZSV侵染的烟草叶片细胞病理变化与TswV侵染的叶片相似。病毒颗粒同样为80～120rim大小的粒子聚集在内质网池内(图2．2A、B)，可能由于所采叶片样品的原因，观察到的TZSV病毒颗粒多为少数几个病毒颗粒的聚集体，尤以单独一个或两三个病毒聚集散状分布在细胞质内的情况较多，很少出现类似TSwV侵染的叶片那样大量病毒聚集的现象。细胞器初期结构比较完整，但是后期变化较大。其中，与TswV相似，内质网的变化最大，成熟的病毒立体分布其中导致其原有结构改变。叶绿体内部也出现囊泡化现象，有的囊泡化严重，叶绿体片层大量消失(图2．2C)，同时大多数的叶绿体片层膨大，有的甚至整个叶绿体崩解。叶肉细胞内线粒体亚细胞结构较完整，但是出现不正常延长，数量增多、聚集的现象，有的还出现类似叶绿体的囊泡化现象，在较大的囊泡处，线粒体嵴消失，但是有类似细胞质的物质存在(图2．2D)。同时偶尔在细胞核膜处也能像TswV那样观察到类似高尔基体潴泡结构小囊泡在不封闭的核膜附近散状分布，细胞核其它结构正常(图2．1F)。其它细胞器例如高尔基体(图2．2E)、过氧化物酶体等结构病理变化不是很明显，但是由于TZSV和TswV的病毒形态、蛋白编码策略和细胞病理变化大致相似，推测高尔基体在TZSV的合成组装和侵染上也同样具有举足轻重的地位，因此其功能和结构细节仍需进一步研究。同TswV侵染寄主的细胞超薄切片样品一样，观察多种TZSV侵染的叶片细胞均没有发现类似其它病毒产生的特殊内含体结构，推测该属病毒可能不存在产生特异内含体的特性。 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察图2．2TZSV侵染的烟草叶片细胞超微结构变化Fig2．2UltrastructureofN．benthamianaleavesinfectedwithTZSVER．内质网CW．细胞壁M．线粒体CH．叶绿体G．高尔基体N．细胞核2．2．3高压冷冻固定感染TswV的植物叶细胞病理变化1j、经高压冷冻固定和冷冻替代(HPF．FS)制备感染TswrV的植物叶片样品，细胞质机制丰富，细胞壁饱满充实，细胞膜较之常温包埋的样品更加细腻，且与化学固定观察的细胞膜为一线状结构不同，HPF．FS处理的样品，细胞膜为一带状结构(见图2．3H)。病毒颗粒同样聚集在内质网池内，但是病毒颗粒结构比常温固定包埋的样品更加清晰，可以清20 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察楚的看到病毒外面的囊膜，即病毒的双层膜(DEV)内的单层膜(SEV)(见图2．3A、B)(Kikkert，eta1．，1999)。细胞超微结构保存的也更加完好，反差更加细腻，细胞器也较为饱满圆润。高压置换固定的样品，叶绿体不同于常温固定的两端尖的梭形，而是椭圆形或近圆形，叶绿体内基质丰富，同样存在片层膨大变形的现象，但是膨大片层线条圆滑，相邻片层之间无挤压，部分叶绿体内部可见一大的囊泡结构，内含一小的包含小颗粒的泡状结构(见图2．3c、D)。线粒体基质饱满，结构致密，嵴与嵴之间有基质填充与化学固定包埋的线粒体内部呈类似空网状的结构有较大区别(见图2．3E)。同时，利用高压冷冻制成的样品在显微镜下可以观察到常温下难以观察清楚的高尔基潴泡结构和分泌小泡且结构清晰，腔状结构明显(见图2．3F)。细胞壁PD结构清晰，部分PD会出现膨大现象，有的甚至可以看到PD孔内的膜状结构(见图2．3G)。因TZSV样品和仪器的一些原因，未拍到TZSV比较满意的图片，结果未予显示。 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察图2．3Tswv侵染的烟草叶片经HPF．FS固定包埋的细胞病理变化Fig2．3UltrastructureofN．benthamianaleavesinfectedwithTSWVbyHPF-FSER-内质网CW．细胞壁M．线粒体CH．叶绿体G．高尔基体N．细胞核PD．胞间连丝22 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察2．3小结与讨论通过观察常温固定包埋和高压冷冻固定包埋两种方法处理的感病植物叶片发现，两种病毒的病毒形态及细胞病理变化大致相似，但也存在差异。与TSwrv相比，TZSV对细胞器的影响更大。TZSV侵染的叶片在叶绿体处也能够产生囊泡，甚至部分叶绿体的囊泡几乎占据整个叶绿体，片层结构破坏更加严重。在线粒体中，TZSV能够产生与叶绿体内相似的囊泡结构，这种现象在TsWV侵染的叶片内难以观察到，相比之下，TSwV侵染的叶片线粒体保存的更加完好。该结果也可以在一定程度上说明了为什么在田间状态下，TZSV对作物造成的危害更加严重。在两种病毒感染的叶片细胞内，都观察到细胞核膜附近有小囊泡结构存在，该现象作者在其他病毒感染的植物细胞中也曾观察到，因此不能确定感现象是否由该属病毒所特异引起的，但是在正常植物叶片中较少观察到该现象，推测该现象可能与病毒的感染有关，但是其具体功能作用还有待进一步研究。虽然两种病毒的病毒形态及细胞病理变化大致相似，但细胞器病理变化差异较明显。推测两种病毒侵染植物的途径和在细胞内的转移有一定的联系，但也可能会存在差异。同时，结果显示植物细胞膜结构和它的主要细胞器的形态在常温化学处理过程中会受较大影响。相比之下，高压冷冻方法处理的样品能够更加真实地展现植物细胞内的超微结构，特别是细胞膜、高尔基体、线粒体、叶绿体等细胞器的结构保存良好，能观察到许多化学固定样品中所看不到的超微结构。由于不受化学物质的影响，超低温快速冷冻制备的超薄切片所观察到的植物细胞超微结构，更接近真实情况。因此在植物病毒学研究方面，利用高压冷冻电镜技术能观察到更加真实的被病毒侵染的植物细胞病理变化，便于人们更加真实地、直观地认识病毒对植物细胞的影响。在HPF．FS固定包埋处理的样品中，观察到大部分叶绿体是近乎圆球形的，这与化学处理样品电镜观察到的叶绿体大部分为梭形的形态有很大差异。而且冷冻方法处理的正常叶片的叶绿体基质片层与基粒片层的区域分布不是特别规则的，叶绿体内部内容物丰富。只有在病变的叶绿体中才观察到结构清晰的基质片层和基粒片层，病变的叶绿体内部内容物缺乏，片层结构松散且膨大变形。根据形态学分析，在液体环境中，没有外力阻碍的情况下，具有流动性膜结构的闭合整体，由于张力的自然存在必定呈现为球状体。因此推断正常生长的叶绿体在液泡并不发达的细胞内部应该是近乎圆球性的。冷冻处理样品的线粒体很多也呈现为近乎圆球形，而且线粒体内基质饱满均匀，内部嵴的线条柔和，嵴与嵴之间有基质填充。对于细胞核的观察两种方法处理的样品，未发现’气 浙江大学硕士学位论文第二章番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒的细胞病理变化比较观察有差异，不过冷冻处理的样品能更清晰的分辨核仁区域和核质区域。高尔基体和它的潴泡结构比常规化学方法制备的超薄切片更加清晰。细胞内部还含有丰富的内容物。细胞内膜结构相对化学处理的样品也更加清晰可辨。综上所述，在高压冷冻和常温化学固定两种方法制备的样品中，我们都能观察到内质网池中分布的病毒粒子，其结构与分布没有很大差别，这可能是由于病毒粒子都是一种蛋白质结构，不同的制样方法对其结构影响不大。经分析可知，在常温固定过程中，受化学制样影响较大的主要是各种细胞器的脂类膜结构，同时病毒的复制、包装和胞内运动与这些细胞器紧密相关，因此选择合适的制样方法对于正确认识寄主细胞超微结构变化具有重要意义。需要指出的是，虽然高压冷冻固定方法有许多优点，但依赖较为昂贵的仪器且准备过程和操作过程相对复杂，时间周期长。因此，常温固定包埋技术仍是研究细胞超微结构的主要手段。但是高压冷冻技术对细胞原生态保存的比较好，更加接近真实细胞情况，对脂膜类结构的保护更加好，在植物病毒细胞间运动方面的研究也是具有特别重要的意义的。24 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和TZSv运动蛋白在植物细胞内的定位第三章TswV和TZSV运动蛋白在植物细胞内的定位Tospovirus基因组中由RNA．M正义链编码的非结构蛋白NSm被公认为该属成员的运动蛋白。Kormelink等(1994)首次提取和纯化了NSm，利用免疫标记等方法证明了NSm参与了病毒的胞间运动(cell．to．cellmovement)(Kormelink，eta1．，1994)。Storms等(1995)将NSm表达于黄花烟原生质体和Tn细胞，免疫荧光标记证明了NSm能在原生质体和昆虫细胞表面形成管状结构(Storms，eta1．，1995)，Lewandowski和Adkins(2005)利用运动缺陷型的烟草花叶病毒(TMV)载体重组NSm，能够互补运动缺陷的TMV在细胞间运动并进行长距离运输，而且在原生质体中也发现有管状结构的形成(LewandowskiandAdkins，2005)。这些都与豇豆花叶病毒(CPMV)运动蛋白(MP)的运功能相类l'以(Pouwels，eta1．，2004)，表明NSm蛋白具有植物病毒运动蛋白的典型特征，因此被公认为该属病毒不同种的运动蛋白。虽然TswV的NSm与CPMV的运动蛋白在产生管状结构方面具有相似性，一些文献推测TswV也属于CPMV一类的管状结构胞间运动模式，但是TswV病毒颗粒很大，直径大约有80～110nm，外面有一层囊膜包裹，核衣壳直径也有60nm，而豇豆花叶病毒的直径才28—30nm，且无包膜。迄今为止，尚未有TswV以完整病毒粒子或者核壳体形式穿越胞间连丝管道的直接证据，因此像TSwV这样的大颗粒病毒有可能存在着新的胞间运动机制。为了解NSm在植物活体细胞内的定位及其功能，探讨Tospovirus的胞间运动机理，我们构建了NSm与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因NSm．钮P并在本氏烟叶片中进行表达，为下一步研究TswV及相关病毒的胞间运动过程奠定了基础。3．1材料和方法3．1．1材料农杆菌C58C1为本实验室保存，含GFP的双元表达载体pCHF3为本实验室构建保存。ExTaqDNA聚合酶、PMD．18．TVectorsystem、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自T水撒公司；质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂购自Axygen公司。 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和TZSV运动蛋白在植物细胞内的定位3．1．2方法根据TSwV和TZSVNSm序列合成以下特异性引物，每对均在上游引物的5’端引入勋以酶切位点，下游引物的5’引入BamHI酶切位点(划线部分为印n／、BamHI酶切位点，加粗部分为起始和终止密码子)：点≯址TSWV-NSm-F5'-GGTACCATGTTGACTCTTTTCGGTAATA．3’BamHI-TSⅥ7V二NSm．R5’．GGATCCTATTTCATCAAAAGATAACT．3’KpnI-TZSV-NSm-F5’．GGTACCATGTCTCGCATTACTAACGTCC．3’BamHI．TZSV』NSm．R5’．GGATCCGAAATCTAATGTGTTGTCAAC．3’3．1．2．1病毒的接种将预接种的材料置于35"C培养箱中黑暗处理24h。取少量病样组织于研钵中，加入1％(w／v)的硅藻土、0．5％(w／v)的活性炭和少量接种缓冲液(o．01mol／L磷酸缓冲液，pH7．0，containingO．1％Na2S03，l％13-巯基乙醇)，研磨均匀。在接种叶片上洒上少量500目的金刚砂，取少量汁液以逆着叶脉的方向轻轻涂抹于接种叶片上，放置10—15min后，清水冲洗干净后，暗室放置过夜，置于植物生长箱，白天25"C／夜间18"(2进行培养，一周后观察症状表现。3．1．2．2病毒基因组的抽提1器皿和容器的处理所有待用的烧杯、研钵、试剂、离心管、量简、试剂瓶等都用o．1％DEPC水溶液浸泡12h(37"C)，然后将离心管、枪头等塑料器皿和烧杯等玻璃器皿以及能用高压灭菌的试剂、溶液均需高压灭菌40min，玻璃和陶瓷制品180℃干烘3h；提取过程中要勤换手套及不要说话，以免降解RNA。2植物总RNA的提取采用TRIzol试齐](Invitrogen)--步法提取植物总RNA的步骤如下：1)剪取1g感染病毒的新鲜烟草叶片，加液氮研磨成粉末；2)将粉末转入1．5mL离心管中，50—100mg组织：lmLTrizol液的比例加入Trizol抽提液。注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％。按住管盖用力摇动使其匀浆，室温下放置5分钟(可放一20。C保存几个月)。3)加入200pL氯仿，盖紧离心管，按住管盖剧烈摇荡15sec，于室温放置2～3分钟。 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和TzSV运动蛋白在植物细胞内的定位4)于4。C，12000rpm离心15分钟，取上清液于一新离心管中，加入6009L异丙醇(与上清等体积)，颠倒数次混匀；室温放置10分钟；(若蛋白含量过高，可重复上一步骤)。5)4。C12000r／min离心10min，弃去上清液。每管用1mL75％酒精清洗沉淀两次；6)4℃，7500r／min离心5min弃去上清，室温干燥。溶于DEPC处理的ddH20中(每管409L左右)，用枪头吹打助溶，必要时可在65℃水浴中助溶3～5min，10000r／min离心3min取上清以去除不溶部分。保存于．70"C。3．1．2．3cDNA第一链合成1)取一新的进口的0．5ml离心管，2)依次加入以下试剂：DEPC水10XAMVbufferdNTP，10mmol／LPrimerRRNaseInhibitorAMV3)总体积为20pl，混匀后稍离心反应条件如下25℃42℃4℃3．1．2．4TSWV和TZSVNSm目的片段的获得10．5此2p,L2btL1肛L0．5此2“L10min1h10min1、利用特异性引物PCR扩增两种病毒的NSm片段，取一PCR薄壁管，依次加入以下试剂：TaKaRaExTaq(5U／p,L)0．25I_tL10XExTaqBuffer(M92+Plus)5此dNTPMixture(各2．5mM)4p,L模板DNA29L引物Flp,L引物R1此灭菌蒸馏水35此，7 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和TLSV运动蛋白在植物细胞内的定位2、反应参数设置如下：94。C预变性2min后开始以下循环反应：94"(2变性30see50Z：退火30see(退火温度根据引物的Tm值作相应调整)72"C延伸1min30个循环后72。C继续延伸10min。3、反应完毕后，取出反应液在l％琼脂糖凝胶中电泳检查扩增效果，并用于割胶回收。4、PCR产物割胶回收利用Axygen公司试剂盒，步骤如下：1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶；2)加入3个凝胶体积的BufferDE．A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2～3min)，直至凝胶块完全熔化(约6～8min)；3)加O．5个BufferDE．A体积的BufferDE．B，混合均匀；4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2mL试剂盒内提供的离心管)中，120009离心lmin，弃滤液；5)将制备管置回2mL离心管，加5009LBufferW1，120009离心30s，弃滤液；6)将制备管置回2mL离心管，加7009LBufferW2，120009离心30s，弃滤液；以同样的方法再用7001aLBufferW2洗涤一次120009离心1min；7)将制备管置回2mL离心管中，120009离心lmin；8)将制备管置于洁净的1．5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25～309LEluent或去离子水，室温静置1min，120009离心lmin洗脱DNA。3．1．2．5DNA克隆技术1、本研究通用的连接体系如下：外源DNA片段线性化载体DNA10X连接缓冲液T4DNA连接酶(3U／斗1)置16℃，反应过夜。2、感受态细胞制备方法7此1此1p,L 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和"rzsv运动蛋白在植物细胞内的定位1)取DH5a细胞单菌落(菌落直径约为2～3mm)，接种于5mLLB液体培养基37。C培养过夜。2)取lmL菌液接种于100mLLB液体培养基，37"C剧烈振荡培养至A600等于0．6。3)将培养物置冰上10min。4)将培养物转移至50mL离心管，4。C25009离心10min。5)用30ml50mmol／LCaCl2悬浮细菌沉淀，冰浴10min。6)4"C25009离心10min。7)用8ml50mmol／LCaCl2悬浮沉淀，加入终浓度为7％的二甲基亚枫，轻轻旋转混匀，冰浴10min。8)将细菌悬浮液以每管100pL分装于1．5mL离心管中，并立即浸没于液氮或．70。C冰箱保存，备用。3、转化1)取一管低温保存的感受态细胞，置冰上融化。2)加入5pL连接产物，轻搅混匀，冰浴30min。3)42。C热击50sec后迅速置冰浴2～5min。4)加入8009l液体LB培养液，37。C振荡培养1．5h。5)取2009L培养液涂布于麦康凯培养基(含100I，tg／mL氨苄青霉素)，37"C倒置培养至红、白斑区分明显为止。6)从麦康凯培养基上挑取白斑作为反应模板，PCR反应条件同前；筛选PCR阳性克隆。3．1．2．6重组质粒的提取和鉴定1、使用Axygen公司试剂盒提取重组质粒，步骤如下：1)取经PCR鉴定的插入有目的片段的重组克隆接种5mL液体LB(含Amp)，37℃培养至OD值约为1．o(约需12～16h)，取1～4mL菌液12000r／rain离心lmin，弃尽上清；2)加入250p．L已加入RNaseA的BufferS1充分悬浮细菌沉淀；3)加入250l-tLBuffers2，温和并充分地上下翻转混合4--6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min；；4)加入350rtLBuffers3，立即轻轻颠倒混匀6～8次，此时可见有白色絮状沉淀，Q 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和rzsv运动蛋白在植物细胞内的定位出现，12000r／min离心10min；5)将离心后上清移至DNA制备管(DNA制备管置于2mL离心管中)12000r／min离心1min，弃滤液；6)加入0．5mL的BufferW1洗柱，12000r／min离心lrain，弃滤液；7)加入0．7mL的BufferW2洗柱，12000r／min离心lmin，弃滤液；8)再次加入0。7mL的BufferW2洗柱，12000r／min离心1min，以彻底去除W1；9)12000r／min离心1min，去除管壁上的液体；将制备柱置于一干净的1．5mL离心管中；10)加入60～80此经65～70℃水浴预热的Eluent于制备柱滤膜中央，室温静置1min，12000r／min离心1min；收集的离心液即为质粒DNA溶液。2、重组质粒鉴定1)质粒提取后，选取合适的限制性内切酶进行酶切分析。常用的20此酶切鉴定体系如下：DNA1鹇限制性内切酶1u10X酶反应缓冲液2LLL加水至201．tL37"(2酶切消化1．5h。琼脂糖凝胶电泳鉴定。2)将含有目的克隆载体的菌液送Invitrogen公司测序。3．1．2．7重组表达载体导入农杆菌C58Cl利用电击导入法，步骤如下：1)将C58C1接种于5mL含50mg／mLRif的YEP液体培养基中，28"(2下震荡培养至OD值约O．6；2)取1．5mL菌液于eppendorf觥，8000rpm／min离心30s；3)弃去上清，沉淀用lmLddH：O充分悬浮，8000rpm／min离心30s：4)重复步骤(3)三次；5)弃去上清，沉淀用200uLddH20悬浮，即为电击用农杆菌C58C1感受态；6)取10uLpCHF3重组载体质粒至200uLC58C1感受态，轻打混匀，然后转移至电击杯中(200uL型号的电击杯使用前用无水乙醇浸泡，凉干)，置冰上；≈n 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和"I'ZSV运动蛋白在植物细胞内的定位7)装备好电击装置(BioRad)，电压为2．5kv，电阻200Q，电容25I-tF条件下，双手一起按住电击按钮，直到啪的一声即为电击完毕；8)室温静置2min后加入800p．LYEP恢复培养液，28"C静置lh，然后28。C下振荡培养2h；9)8000rpm／min离心30s收集菌液，沉淀用200uLddH20悬浮，用玻璃涂棒涂布于含有卡那霉素(50mg／mL)和Rif(50mg／mL)l钓YEP固体培养基平板，28"(2培养48h至长出单菌落；、10)长出的单菌落用特异性引物进行PCR鉴定后即为导入C58C1的pCHF3重组载体克隆。3．1．2．8农杆菌培养和浸润1)农杆菌培养将携带外源基因的根癌农杆菌菌株在含相应抗生素Km(50I．tg／mL)和鼬f(50¨g／mL)的YEP液体培养基中，28"(2恒温摇床培养约至OD值为1．0，离心收集菌体，用含终浓度为10mMMgCl2，10mMMES(pH5．7)和200州乙酰丁香酮的无菌水溶液重悬浮，调整菌液浓度使其OD600约为O．7左右，室温下放置2hr-24hr。2)浸润及观察用1mL注射器针尖在2-4周的本氏烟叶片背部刺2．3个小孔，一手按住叶面小孔处，一手用无针头的针管将菌液沿小孔慢慢注入叶片组织空隙中。浸润接种后的植物置于25"(2培养浸润2～3天后进行观察。先用荧光显微镜初步观察是否表达，然后用共聚焦显微镜详细观察荧光分布情况。3．1．2．9激光共聚焦显微镜观察用德国LeicaTCSSP5倒置型激光共聚焦显微镜(Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)对浸润48h、58h的本氏烟叶片进行观察，对选定位点用488nm激发光激发，500～530nm吸收光条件下进行检测。 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和Tzsv运动蛋白在植物细胞内的定位3．2结果与分析3．2．1重组质粒构建的鉴定结果将两种病毒的连接产物pCHF3-NSm．GFP转化农杆菌C58C1，利福平和卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，提取质粒DNA并进行鉴定。酶切和PCR均证明重组质粒的构建是正确的，经上海英潍捷基生物公司测序鉴定外源插入片段的方向和序列均正确。1000bp11STZ1000bpTSTz图3．1PCR和酶切验证重组载体pCHF3-NSm—GFPFi93．1AgarosegelelectrophoresisofPCRandenzymedigestionproductsofpCHF3-NSm—GFP3．2．2NSm在本氏烟表皮细胞内的定位1、TSWV-NSm．GFP在本氏烟表皮细胞的定位为了观察NSm在植物活体细胞内的定位，将GFP作为荧光标记追踪NSm，在激光共聚焦显微镜下观察荧光分布。所观察的是农杆菌浸润48h和58h后的活体本氏烟叶片，具有完整的活体植物细胞因子，能详细显示出NSm在细胞内的定位情况。在浸润48h用激光共聚焦显微镜观察结果显示：NSm．GFP融合蛋白在叶片细胞内得以表达，绿色荧光主要分布在细胞周边及细胞核，会在植物细胞内扩散，可以定位到细胞壁，一些不连续的绿色荧光小点分布在细胞壁上，偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间(图3．2A．B)。文献报道该不连续的点状结构位于胞间连丝上(Hofmann，SambadeandHeinlein，2007；Wei，Zhang，Hongeta1．，2010)，是植物病毒运动蛋白的特征。通过不同层次的扫描发现，相邻细胞的细胞壁出现明暗不均的绿色荧光，说明单独的NSm蛋白能够在细胞间运动。而且NSm．GFP在胞间连丝处定位的荧光信号较强，在细胞壁和细胞核处的荧光信号较弱。浸润58h后定≈， 浙江大学硕士学位论文第三章"I'SWV和TZSV运动蛋白在植物细胞内的定位位结果表明，即使细胞周围及细胞核处定位的荧光强度减弱，胞间连丝处的GFP荧光仍然存在(图3．2C)。图3．2TSWV-NSm—GFP在本氏烟表皮细胞的定位Fig．3．2SubcellularlocalizationofTSWV-NSm-GFPinepidermalcellsofN．benthamianaleaves．A—B：LocalizationofpCHF3--NSm—GFPexpressedintheleafcells48hrspost-agroinfiltration；C：LocalizationofpCHFr--NSm-GFPexpressedintheleafcells58hrspost-agroinfiltration；D：LocalizationoffreeGFP．2、TZSV．NSm．GFP在本氏烟表皮细胞的定位观察含有TZSV．NSm．GFP表达载体的农杆菌浸润的本氏烟表皮细胞，所得结果与TswV．NSm．GFP在本氏烟表皮细胞的定位结果相似，都为绿色荧光分布在细胞周边及细胞核，能在植物细胞内扩散，可以定位到细胞壁上，并且壁上会有一些不连续的绿色荧光33 浙江大学硕士学位论文第三章Ts、Ⅳv和TZSV运动蛋白在植物细胞内的定位小点，偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间。通过不同层次的扫描发现，同样发现相邻细胞的细胞壁会出现明暗不均的绿色荧光，说明单独的TZSV的NSm蛋白也能够在细胞间运动。而且TZSV-NSm．GFP在胞间连丝处定位的荧光信号较强，在细胞壁和细胞核处的荧光信号较弱。该结果与TswV及公认的运动蛋白的定位结果均一致，说明TZSV的运动蛋白同样为位于ssRNA．M上的NSm蛋白。图3．3TZSV．NSm．GFP在本氏烟表皮细胞的定位Fig．3．3SubcellularlocalizationofTZSV-NSm-GFPinepidermalcellsofN．benthamianaleavesA—C：LocalizationofpCHF3-NSm-GFPexpressedintheleafcells48hrspost—agroinfiltration；D：LocalizationofpCHF3-NSm-GFPexpressedintheleafcells58hrspost-agroinfiltration． 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和TZSV运动蛋白在植物细胞内的定位3、空白GFP对照定位与NSm-GFP相比，单独的GFP也会在植物细胞内扩散，主要集中于细胞壁和细胞核。细胞壁处的GFP荧光分布均匀，没有特异性的荧光小点出现。通过逐层扫描叠加发现细胞质内有绿色网络状结构，连接细胞核与细胞壁，荧光信号分布都较均匀(图3．2D)，说明NSm．GFP在细胞中的定位不是由GFP所决定的。3-3小结与讨论Tospoviruses近年来在农业生产上危害加剧，中国也陆续有许多新种或新分离物报道。这类病毒由蓟马传播至寄主植物局部部位后，必须经由胞间运动和长距离转运扩散到整株导致系统发病，但多年来其体内运输的机制一直是个未解之题。本研究通过农杆菌介导的植物双元表达体系研究了TswV、TZSV的运动蛋白NSm在本氏烟叶片表皮细胞的定位情况，其中TswV所得结果与国外报道NSm蛋白为TswV的运动蛋白相一致。利用PCHF3载体单独表达NSm蛋白，激光共聚焦显微镜观察发现绿色荧光主要分布在细胞周边及细胞核，表明在Tsw．V病毒其余蛋白缺失的情况下，该蛋白也会在植物细胞内扩散，并且定位到PD上。自TswV全基因组获得以后，研究者发现与其余侵染动物的布尼亚病毒科的病毒相比，TswV存在一个额外的基因(Kormelink，eta1．，1992)，该基因得到了研究者的普遍关注，1994年Richardkormelink首次利用免疫标记的方法证明该蛋白为TswrV的运动蛋白(Kormelink，eta1．，1994)，随后许多研究者又利用原生质体或昆虫细胞作为表达受体，研究该蛋白的功能．(Kikkert，eta1．，1997；LewandowskiandAdkins，2005；Li，eta1．，2009；Storms，eta1．，1995)。本研究利用模式植物本氏烟活体植物作为接种对象，更加接近野生型病毒侵染环境，研究结果不但验证了NSm蛋白为TsWV的运动蛋白这一结果，同时又作为TZSV研究的阳性对照，以便在同一条件下研究两种NSm功能的异同。TZSV至今未有关于细胞内移动的相关报道，根据基因组结构特点、编码策略以及序列分析推测该蛋白可能为TZSV的运动蛋白。几乎所有运动蛋白都有个共同的特征即不连续的定位在细胞边缘(Scholthof,2005)。本实验的研究结果显示，TZSV-NSm．GFP表达载体农杆菌浸润的本氏烟表皮细胞与TSWV-NSm．GFP在本氏烟表皮细胞的定位结果相似，也有绿色荧光分布在细胞周边及细胞核，并且壁上会有一些不连续的绿色荧光小点，偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间，符合植物病毒运动蛋白的共同特征。该结果证实了云南新种TZSV的NSm蛋白符合植物病毒运动蛋白的特性，且该属两种病毒的NSm均具有胞间连丝定位特性。从目前共聚焦观察的结果显示，单独表达NSm在本氏烟表皮细胞的定35 浙江大学硕士学位论文第三章TSWV和"r-zsv运动蛋白在植物细胞内的定位位情况，两种病毒表达结果相同，未发现较大的差异，而且其他病毒MP在植物细胞内的情况也和本氏烟研究结果相似(Wei，eta1．，20lo)，表明该实验方法正确有效。同国内外有关报道不同的是，我们利用GFP分子标记直接定位NSm，较早期报道采用免疫荧光标记定位NSm更为精确和灵敏；同时，利用pCHF3载体替换运动缺失型的TMV载体，去除了病毒因素对NSm定位可能存在的影响，说明TswV、TZSV的NSm蛋白不但在病毒体系中具有运动功能，而且在纯植物体系中也可以实现细胞间的转移。NSm在胞间连丝处具有特异性的定位表示TswV、TZSV在细胞间的扩散与胞间连丝直接相关。与目前研究MP较常用的运动缺陷型PVX载体相比，该实验方法所用载体简单，去除了外来病毒蛋白的影响，实验过程更加简洁。 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和TZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达80年代发展起来的杆状病毒一昆虫细胞表达系统作为一种优良的真核表达系统，具有表达量高，能够正确切除信号肽，表达产物后加工修饰较完全，且可将成熟蛋白分泌到细胞外，避免在细菌中表达形成包涵体等优点，备受国内外研究者青睐。与细菌表达系统不同，杆状病毒表达系统可以利用存在于高等真核生物中的多种蛋白质的修饰、加工和转运体系，这样有利于表达产物活力的保持及体外模拟病毒感染昆虫的机理研究。同时，杆状病毒可在培养的昆虫细胞中增殖至高滴度，能够相对容易地获得大量的重组蛋白，大部分超量表达的蛋白在昆虫细胞中保持可溶性，这与从细菌中常常得到不溶性表达蛋白形成鲜明的对照。而且杆状病毒的基因组较大(130kb)，可以容纳大的外源DNA片段。因此在植物病毒的胞间运动研究领域，该表达系统也得到了较为广泛的应用。研究证明，杆状病毒表达载体系统是一种十分有效且用途广泛的表达系统(IMandVC，1993)，目前主要有两种类型的杆状病毒表达系统用于重组蛋白的表达：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)系统和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)系统(Xiang，eta1．，2010)。其中AcMNPV系统是目前应用最广泛的杆状病毒表达系统，近年来已发展了线性化病毒、酵母一昆虫穿梭载体和大肠杆菌一昆虫穿梭载体等表达系统。由于昆虫细胞没有细胞壁包裹，是天然的原生质体，因此许多病毒运动研究者利用其研究病毒运动蛋白的细胞定位和胞间运动模式。目前为止，多种病毒包括CPMV、CaMV以及TswrV等都可获得各自MP在昆虫细胞表面形成管状结构的结果，且结果与相同蛋白在植物原生质体内的表达结果相同(Kasteel，eta1．，1996；LentandSchmitt-Keichinger，2006；Storms，eta1．，1995)。因此，对于形成管状结构不需要寄主因素参与的病毒可以使用昆虫细胞作为原生质体研究病毒的MP，如果寄主因素在病毒MP形成管状结构的过程有重要作用的病毒．，若要使用昆虫细胞进行定位，则必须该寄主因素在昆虫细胞和植物体内具有相似的特性。因之前有研究者运用过昆虫细胞研究TswV的MP表达，因此本实验采用昆虫Tn细胞做为原生质体结构研究TZSV的MP表达定位，同时比较两种病毒NSm的定位差异。 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和"I'ZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达本实验采用的Bac．to．Bac杆状病毒(AcMNPV)表达系统不同于传统的杆状病毒系统，该方法是由孟山都公司的研究人员利用大肠杆菌DHl0Bac中含有表达转座酶的helper质粒和可在细菌和昆虫细胞之间转移和扩增的杆状病毒穿梭质粒Bacmid开-发的高效真核表达系统(Luckow,eta1．，1993)。4．1材料和方法4．1．1材料含GFP的pBacHTeGFPTshuttlevector、昆虫Tn细胞和大肠杆菌(Escherichiacoli)DHl0Bac由浙江大学昆虫研究所张传溪教授提供。Lipofectin和胎牛血清为Invitrogen公司产品。昆虫细胞培养基TNM．FH购自Sigma公司(美国)．4．1．2方法4．1．2．1PCR扩增目的基因根据TsWV和TZSVNSm序列合成以下特异性引物，每对均在上游引物的5’端引入BamHI酶切位点，下游引物的5’引入Sail酶切位点(划线部分为BamHI、SalI酶切位点，加粗部分为起始和终止密码子)：BamHI．TSWV—NSm．F5’·鱼Q△!￡￡ATGTTGACTCTTTTCGGTAATA-3’Sa／I-TSWV-NSm．R5’一鱼I￡Q△￡TATTTCATCAAAAGATAACT一3’BamHI．TZSV．NSm-F5’-Q鱼△!￡堡ATGTCTCGCATTACTAACGTCC-3’S口n．TZSV．NSm．R5’-Q!￡鱼△￡GAAATCTAATGTGTTGTCAAC一3’4．1．2．2重组病毒的构建利用特异性引物从PMD．18一TVector上分别扩增Tswv、TZSV的NSm片段，PCR产物用BamHI和SalI限制性内切酶酶切，插入含GFP的pBacHTeGFPTshuttlevector的BamHI／SalI位点，GFP连接在目的片段的N一端。提取该重组质粒DNA，与只含GFP的对照质粒分别转化带有穿梭载体Bacmid和辅助质粒的感受态大肠杆菌DHl0Bac，在IPTG(40ug／mL)、X．gal(100ug／mL)、卡那霉素(50ug／mL)、庆大霉素(7ug／mL)、四环素(10ug／mL)的LB平板上进行筛选。选出的重组杆状病毒DNA，我们分别标记为Bacmid．TS．NSm、Bacmid．TZ-NSm利用各自的特异性引物和PUC／M13进行PCR鉴定， 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和TZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达然后同对照质粒一起用Lipofectin转染昆虫Tn细胞(Liu，Ye，Langeta1．，2011；刘艳荷，陈艳霞，章亦卿eta1．，2007)。二．+JNSm图4．1供体质粒的构建及供体质粒与Bacmid的重组Fig4．1ConstructionofdonorplasmidandrecombinantBacmid 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和TZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达4．1．2．3Lipofectin介导重组病毒转染昆虫细胞取2mL左右Tn细胞液于①35mmDish中，27。C培养箱过夜；取4个干净1．5mLEP管，均加入lOOgLTNM无血清培养基，一个加入IOBL带目的片段Bacmid质粒，一个加入1o止Bacmid质粒(重组HTe空质粒)，另外两个均加入6灿脂质体，轻轻混匀，室温放置15min；将两个质粒分别与脂质体混合，轻弹，室温放置30min；吸走Dish中的细胞培养基，用TNM无血清培养基洗涤细胞一次，加入800tiETNM无血清培养基；将混合好的质粒+脂质体逐滴均匀加到Dish中27。C培养5h，之后将无血清培养基吸出，加入12mL左右有血清培养基，27。C培养72h。4．1．2．4感染昆虫细胞收集转染3天后的上清液体，取500I．tL逐滴均匀加到含2mL正常Tn细胞的Dish中，27。C培养一定时间。4．1．2．5激光共聚焦显微镜观察用德国LeicaTCSSP5倒置型激光共聚焦显微镜(Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)对感染后27。C培养3d的重组杆状病毒DNA侵染的Tn细胞进行观察，对选定位点用488am激发光激发，500～530am吸收光条件下进行检测。4．2结果与分析4．2．1Bacmid-NSm的构建在IPTG(401．tg／mL)、X—gal(100“g／mL)、卡那霉素(501．tg／mL)、庆大霉素．(7p．g／mL)、四环素(10pg／mL)的LB平板上筛选的白斑菌落，提取病毒DNA，利用引物NSm．BamHI-F、NSm．SaiI-R扩增出900bp左右的条带，符合目的条带的大小。未发生重组的Bacmid，以PUC／M13引物扩增得到的片段大小为300bp；重组后的Bacmid，经相应的PCR扩增得到的片段大小为转座子内侧片段2300bp加上GFP及克隆片段的大小之和，故本研究中，最终所得到的重组病毒经PUC／M13引物扩增后片段大小为总长约4000bp左右(图4．2)，与预期的基因片段大小一致，证明已获得重组病毒pFastBac—NSm。 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和TZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达4000bp一图4．2PUC／M13引物鉴定Bacmid．NSmFi94．2PCRassayofBacmid-NSmwithfourreplicationsofeachNSm4．2．2NSm在昆虫Tn细胞内的表达体外培养的昆虫Tn细胞大多呈梭形(图4．3F)，感染重组病毒后48h用激光共聚焦显微镜观察显示：含有目的基因的Tn细胞大多数变为圆形，细胞表达GFP-NSm蛋白，但是表达Tswv和TZSV两种不同病毒的NSm融合蛋白结果却差异很大。表达Bacmid．TS-NSm的细胞(图4．3A．B)，能在Tn细胞内形成一些丝状结构，并在细胞表面长出许多长短不一的管状结构(图4．3c．D)，一些细胞表面的管状结构显得相当密集，并且在管状结构的顶端具有较强的荧光信号(图4．3c)，表明该部位聚集了较多的GFP．NSm融合蛋白。表达Bacmid．TZ-NSm的细胞NSm蛋白定位和表达Bacmid．TS-NSm的细胞完全不同，不能在细胞表面产生类似TswVNSm蛋白产生的管状结构和细胞内的丝状结构，也不像空载体质粒对照那样均匀分布在细胞核质内(图4．4A．B)。但是可以在细胞核表面及细胞质内表达：在细胞核表面表达的蛋白呈网刺状，围绕着细胞核形成环形，不能进入细胞核内部；在细胞质内表达的蛋白成大小不一的团块状聚集(图4．4c．E)，具体能够定位在哪种细胞器上有待进一步研究。只含GFP的空白对照质粒感染细胞结果显示，细胞在48h后同样变为圆球状，但是荧光信号在细胞内分布均匀，核质信号稍有差异，细胞表面也未见明显的管状结构出现(图4．3E，图4．4F)。 Aj翠f．：盈一j【：0l,Jrn250匐0umCD0uE]F0urnl 浙江大学硕士学位论文第四章TSwv和TT_．SV运动蛋白在昆虫细胞内的表达图4．4Bacmid．TZ．NSm在Tn细胞内的表达Fig．4．4ExpressionofGFP-NSm—TZfusionproteininTncells．A：About30％oftheinoculatedcellsexpressedGFP．NSmat48hpi；B：About80％oftheinoculatedcellsexpressedGFP—NSmat72hpi；C、D：LocalizationinthecytoplasmandthesurfaceofnucleusofNSmat48hpi；E：SubceilularlocalizationofNSmat72hpi；F：Mock·inoculatedwithGFP．43 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和TZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达4．2．3Tswv和TZSV序列比对结果我们将克隆的TswV和TZSVNSm序列送上海英潍捷基生物公司测序，所得结果同网上的序列进行比对，其中TswV网上序列为云南分离种(GenBank：JF960236．1)，TZSV也为云南分布种(GenBank：EF552434．1)。对比结果显示，两种病毒NSm蛋白的同源性较低，大约为39％左右。经过第三章、第四章的研究我们发现，Tswv、TZSV的NSm蛋白ts—yn—ncbi：t暑一pr0：tz—11cbi．p‘；tz—pr0：ts。-,in‘。ncbits。proLz—ncbi．‘Jztz。prOSHS^R嚣DESKS^R曩DEFz—TNN3NFIPoNNSNlii弱ilit!iliiiitilliLV6N6吗SD^L3GK1BO。200‘220·2曩06霭濯_疆霎瓤溺ii|柏￡I—一：302FDEI一一：302TLD一一一：309TLD鼻GS：31l图4．5TswV和TZSVNSm蛋白的比对Fi94．5AlignmentofNSmproteinsofTSWVandTZSV23哼23弓2362e8288Z95295在本氏烟表皮细胞的定位结果相似，都是在胞间连丝处特异性聚集，符合植物病毒运动蛋白的普遍特征。有研究报道，TSWVNSm蛋白的D154氨基酸区域对于病毒的cell-to．ceII运动和原生质体中管状结构的产生是必不可少的(Li，eta1．，2009)，TZSV运动蛋白的植物嚯嚯警，觫照ⅫⅫ毫嘉一pp耋GHN嚯董sKK’{．√NN-，YGNFF【．【I可吨．蓬t■L3S膏■区■臣■lM．●JZbPC．n．1．ObOnrCrypnp．1rbPC．ni—obonrCrypnp一-3SZt■一陲刖刚曰。’_j趸．1rbpC．ni．obonrCrypnp-一-_SZCtCt．1r．bpC．ni—ObonrCrypnp-一-_SZCtC七 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和T25V运动蛋白在昆虫细胞内的表达表皮细胞定位结果符合这一研究结果。但是，我们将TZSV运动蛋白在昆虫细胞内定位在细胞质和细胞核，不能够产生管状结构的结果却难以验证该结论。关于这两个运动蛋白在昆虫细胞内定位的差异原因有待进一步的研究。4．3小结与讨论TswV的GFP．NSm融合蛋白能够在昆虫Tn细胞表面诱导产生管状结构，表明在去除植物细胞壁因素和TSwV其它蛋白的情况下，单独表达NSm蛋白仍可有效地形成这些运动蛋白小管，由于昆虫细胞没有细胞壁，类似于原生质体结构，NSm在细胞表面产生的管子较多且杂乱无章，长度远长于在胞间连丝处形成的NSm蛋白小管(Kormelink，eta1．，1994)。植物表皮细胞有一层较厚的细胞壁包裹，细胞内部主要通过胞间连丝与外界进行大分子物质的流动和交换，NSm在本氏烟表皮细胞的定位已经表明NSm的定位与胞间连丝有关，因此我们认为NSm在细胞表面产生的管状结构应该是等同于在植物细胞内穿过胞间连丝沟通相邻两个细胞的运输通道，但是野生型病毒感染后具体通过该管状结构移动的病毒物质尚在研究之中。TswV可通过蓟马传播扩散，研究其NSm在昆虫细胞内的表达定位情况对于研究蓟马体内TswV的持久性传毒也具有一定的意义。在同样条件下TZSV的GFP-NSm融合蛋白也能在昆虫Tn细胞内表达，但是不能产生管状结构，主要分布在细胞质内，成团块状聚集，可能该运动蛋白在Tn细胞内的移动依靠某些细胞器的帮助，但是具体和哪些细胞器有关还不清楚。该蛋白也能在细胞核表面定位，呈网刺状，围绕着细胞核形成环形，究竟该蛋白为什么会定位在细胞核表面还有待进一步研究，呈网刺状分布可能是与细胞核的表面形态有关。两种蛋白在本氏烟表皮细胞定位结果相似，但是在昆虫Tn细胞内的定位情况存在较大差异。重复TZSVNSm蛋白在昆虫Tn的定位，两次结果一致，说明该定位情况确为TZSV在昆虫Tn细胞内的正常表达结果。造成两种蛋白如此明显的定位差异原因尚未明确，因此我们推测造成该定位结果可能是由以下一种或几种原因造成的：一、两种病毒基因组同源性较低，NSm同源性仅为39％左右，基因组结构的差异有可能导致编码蛋白构象上存在差异，从而诱使功能变化；二、两种蛋白与寄主因素的互作可能存在不同，受寄主体内各种蛋白或离子的调节，病毒在细胞内的移动可能存在不同的机制，则运动蛋白的 浙江大学硕士学位论文第四章TSWV和TZSV运动蛋白在昆虫细胞内的表达定位功能受到影响；三、TZSV的MP形成管子的过程中需要植物寄主某种因素的参与，而Tn昆虫细胞内该因素不存在或与在植物细胞内的特性差异较大。对于Tospovirus的不同种来说，运动蛋白NSm的种间同源性较低，我们发现不同种之间的NSm细胞表达情况存在着差异，这可能意味着该属病毒的NSm功能及细胞间运动的机理较为复杂。究竟TSwV在其生命周期中是怎样从侵染细胞到达周围健康细胞?是病毒整个颗粒通过管状结构穿过胞间连丝?还是以核衣壳的形式?Tswv在胞间运动过程中是否还有其它蛋白的参与?大颗粒病毒的胞间运动是否存在新的机制?这些都有待进一步的研究。 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和TZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备第五章TswV和TZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备关于植物病毒的运动研究方法，大多数研究者都应用p．葡萄糖苷酸酶(GUS)基因(gus)和绿色荧光蛋白(GFP)基因(加)作为报告基因，将其重组入植物病毒基因组或运动缺陷型病毒研究病毒的胞间运动和长距离运动，对运动相关蛋白的鉴定则采用分离相关基因和构建突变体并进行重组的方法(LawrenceandJackson，2001；Li，eta1．，2009；Li，eta1．，2004)。也有部分研究者则根据运动蛋白会定位在胞间连丝处的特性，应用免疫胶体金技术进行亚细胞定位的方法研究运动相关蛋白的结合位．ff,(Kormelink，eta1．，1994；Xiong，eta1．，2008)。目前国内已有实验室利用原核表达的方法获得了马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)等病毒的运功蛋白的纯化蛋白以及抗血清用于田间发病植物的检测(刘秀君等，2008；张正坤等，2008)。通过之前的研究结果，我们获得TswV、TZSV在单独表达状况下在本氏烟表皮细胞和昆虫Tn细胞内的表达和定位情况，为了进一步研究NSm蛋白对TswV、TZSV病毒细胞间运动的调节作用，以及在野生情况下的确切分布情况，我们利用原核表达方式获得TsWV、TZSV运动蛋白的多克隆抗血清，目的主要用于免疫胶体金标记染病的植物叶片，以便获得这两种运动蛋白在自然状况下植物体内的亚细胞分布情况以及了解该种蛋白主要协助病毒运动的方式。5．1材料与方法5．1．1材料大肠杆菌DH50【|、BL21(DE3)pLysS由本实验室保存，克隆载体pMDl8一T载体购自Takara公司，原核表达载体pET-32a(+)为Novagen公司产品。1kbDNAMarker、中等分子量标准蛋白Marker购自FermentasMBI公司；TaqDNA聚合酶购自上海申能博彩公司；Ni+-NTA亲和层析柱购自Qiagen公司；硝酸纤维素膜购自AmershamPharmacia公司；RPMI．1640培养基、HT、HAT、抗体类型及亚类鉴定试剂盒、碱性磷酸酶标记的抗鼠IgG二抗、6×His单克隆抗体和IPTG均购自Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。5．1．2方法5．1．2．1常规PCR反应同4．1．2．1PCR扩增目的基因TswV、TZSV的NSm基因，两反应的特异性引物相同。47 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和rzsv运动蛋白的原核表达及抗体制各5．1．2．2原核表达载体的构建1、载体构建利用特异性引物从PMD．18．TVector上分别扩增TsWV、TZSV的NSm片段，PCR产物用BamHI和SalI限制性内切酶酶切，插入原核表达载体pET-32a(+)的BamHI／SalI位点。提取该重组质粒DNA，标记为PET．TS、PET．TZ，-9不含目的片段的空白pET-32a(+)对照质粒分别转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在麦康凯培养基(含100Ltg／mL氨苄青霉素)，37*(2倒置培养至红、白斑区分明显为止。筛选PCR阳性克隆，摇菌用于质粒提取。2、重组质粒的提取与鉴定1)质粒提取参照质粒微量提取试剂盒说明书。2)PCR鉴定取1止质粒溶液稀释50倍后作为反应模板，PCR反应条件同上，鉴定臌因是否插入表达载体中。3)酶切鉴定提取的重组质粒用BaotdI和SalI限制性内切酶，37℃酶切消化5h后琼脂糖凝胶电泳检查重组结果。4)序列测定PCR、酶切鉴定阳性的重组表达载体送去博尚公司进行基因序列测定，验证其基因序列及ORF的正确性。5．1．2．3目的基因在大肠杆菌中的表达1、诱导表达(1)将pET．32a重组质粒和相对应的空载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，茵落PCR、酶切筛选阳性克隆。(2)挑取5个阳性单菌落于含氨苄青霉素(Amp，100lag／mL)的液体LB培养基中，37*(2220rpm／min振荡的条件培养过夜。(3)保存甘油菌。将菌液以1：100转接于6mL含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，370C220rpm／min培养至OD600为0．6—0．8。 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和TZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备(4)取1mL菌液，12000r／min离心1min后弃上清，沉淀用1009L2xSDS上样缓冲液悬浮，水浴锅煮沸5—10分钟，4"C保存。(5)剩余5mL菌液加入1MIPTG至终浓度为0．5mmol／L，37*(2220rpm／min诱导表达4h。(6)同步骤4。将上述两部分进行SDS．PAGE电泳分析。(7)比对目的蛋白与标签蛋白的大小，筛选出大小正确，条带较亮的，进行大量表达。2、大量表达(1)取70gL甘油菌于含氨苄青霉素(Amp，100p,g／mL)ff-,J液体LB培养基中，37*(2220rpm／min振荡的条件培养过夜。(2)将过夜菌以l：100的比例接种到200mLLB液体培养基中，37"C摇床培养至OD600达0．6～O．8。(3)取1mL菌液，12000r／min离心lmin后弃上清，沉淀用1009L2xSDS上样缓冲液悬浮，水浴锅煮沸5—10分钟，4。C保存。(4)加入IPTG至终浓度为o．1mM，37。C220rpm／min诱导表达4h。(5)取1mL菌液，12000r／min离心1min后弃上清，沉淀用1009L2xSDS上样缓冲液悬浮，水浴锅煮沸5～10分钟，4。C保存。(6)剩余菌液8000r／min低温离心20min后弃上清，沉淀用30mLlysisbuffer悬浮。(7)超声波破碎，破碎2s停8s破碎99次重复一个循环。(8)将破碎后的样品，取1mL12000r／min离心1min，取50¨L上清，用50gL2xSDS上样缓冲液混匀，沉淀用100gL2xSDS上样缓冲液悬浮，水浴锅煮沸5～10分钟，4。C保存。(9)将上述四部分进行SDS．PAGE电泳分析。(10)若上清中出现目的条带，则可以进行进一步纯化。5．1．2．4表达产物在变性条件下的纯化1)取破碎后的上清液，加入200¨LNi2+-NTAAgarose，混匀后ff-4oc在摇床上振摇3h或过夜；2)将混合液装入小柱，室温下让其缓慢下流，直至无蛋白流出；3)分别用含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，每个阶49 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和I'ZSV运动蛋白的原核表达及抗体制各段至少洗1个柱体积(视具体情况而定)，收集各阶段洗脱峰；4)将各浓度的咪唑洗脱液进行SDS．PAGEdL泳检查蛋白纯化情况。5．1．2．5重组蛋白的SDS．PAGE分析1、分离胶的制备根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度，制备不同浓度的凝胶所需的储备液可参考下表。该配方可配制o．75mm厚、10cmx7cm的凝胶两块。按比例配置分离胶，将混合液充分混合后，平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中。置于室温下30．60mir,，使凝胶聚合完全(在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线)。除去上层水相，然后再用水或浓缩胶缓冲液(0．125MTris．HCI，pH6．8，O．1％SDS)洗凝胶表面，准备灌制浓缩胶。2、浓缩胶的制备将30％丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液0．6mL，浓缩胶缓冲液888p,L、水2mL、10％过硫酸铵48lxL、TEMED8此混合均匀后，吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静置20min以上以保证完全聚合。表5．1．21不同浓度变性聚丙烯酰氨凝胶的配方Table5．1．2lComponentsofdifferentconcentrationofdenaturingpolyacrylamidegels蠢芬—、—、逛壁鎏璺8．5％10％12．5％15％17．5％ 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和"I-ZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备3、样品制备及电泳蛋白质样品在上样电泳前需变性。通常是将样品蛋白质溶液与等体积的2×上样缓冲液混合后置于eppendorf管中，将混合物置于100℃加热煮5～10min，立即置于冰上。样品制备好以后，离心即可上样电泳。先将样品梳移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液。根据实验的需要加样电泳。通常使用恒压的方式进行电泳，电压一般为70～80v，待溴酚蓝带移至凝胶末端处即可结束电泳(约需2—3h)。4、凝胶的染色和脱色电泳完毕后，倒去电泳缓冲液，取出夹心槽。小心地取出凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中，以浸没凝胶为宜，在水平摇床上摇动，直至凝胶上出现明显的条带为止，一般需要3～6h或者4℃过夜。染色完毕后，用少量水淋洗凝胶，然后置于脱色液中脱色，脱色至蓝色背景消失为止。此凝胶即可用于观察、分析、拍片。5．1．2．6多克隆抗体的制备将纯化的NSm蛋白作为抗原以常规的方法免疫家兔获得相应的抗血清为多克隆抗体。不同的抗原和不同的动物，其免疫途径及抗原用量和免疫程序存在一定的差异，但步骤及方法大致类似。其具体过程如下：纯化的NSm蛋白以生理盐水稀释，与等量的弗氏完全佐剂(Freund’Scompleteadjuvant，FCA)进行乳化使之形成油包水乳剂；再次免疫使用弗氏不完全佐剂(Freund’Sincompleteadjuvant，FIA)乳化，最后一次静脉加强免疫时则不用佐剂。免疫抗原量每只家兔每次为400～500lag，注射剂量一次为1mL左右，采用皮下、皮内和肌肉注射的方法。最后一次加强免疫一周后呆血。用琼脂双扩散的方法测定抗血清效价。'-3效价达到1：32以上时大量采血。将所采血在室温下放置1h，4℃凝结过夜，收集血清于一20℃保存。家兔免疫程序如下：初次免疫免疫加强l免疫加强2免疫加强3l三周I三周l三周l7．，。天L·——L———L———J一——一I采血FCAFIA 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和TZSV运动蛋白的原核表达及抗体制各5．1．2．7Western印迹分析1、半干式电转移电泳结束后，取下凝胶，切除浓缩胶，用蒸馏水稍作淋洗后置于转移缓冲液中。取与PAGE胶相同大小的硝酸纤维素滤膜和2张Whatman滤纸，置于转移缓冲液中浸湿，然后将滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶、滤纸依次叠放在半干转移仪载物台上，间隙之间不能留有气泡，接通电源，15V转移15min(图5．1)。图5．1蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜示意图Fig5．1Diagramshowingproteintransferfromgeltoanitrocellulosemembrane2、Westernblot1)电转移后的硝酸纤维素膜漂于TBST缓冲液，直至完全湿润、浸泡，稍作淋洗；2)将膜浸于5％脱脂奶粉的TBST封闭液，4℃过夜，以封闭非特异性蛋白结合位点；3)将膜分别浸入抗TSWV、TZSVNSm蛋白多克隆抗体的稀释液中(1：5000)，室温下在水平摇床上轻轻振荡反应lh；4)用TBST淋洗3～5次，每次约3min；5)将膜转移至用TBST作1：8000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG二抗，室温下轻轻振荡反应1h；6)用TBST淋洗4～5次，每次约3min； 浙江大学硕士学位论文第五章TswV和]-ZSV运动蛋白的原核表达及抗体制各7)膜用TBS短暂淋洗，以去除膜表面的吐温．20；8)取10mL底物缓冲液，加入66p,LNBT和33p．LBCIP配成显色液；9)将膜浸入显色液室温或37℃中避光反应，至特异性条带明晰，而背景较低为止，约需5～10min；10)将显色反应完全后的膜迅速至去离子水中，以终止颜色反应；11)室温干燥，拍照记录结果后将膜避光保存。5．2结果与分析5。2．1Ts、／＼Ⅳ、TZSVNSm基因的克隆和原核表达载体的构建利用设计的基因全长序列特异性引物，进行高保真PCR扩增，得到全长基因片段。胶回收试剂盒回收纯化PCR得到的基因，与T载体连接。双酶切连接产物，与同样酶切开的pET32a表达载体连接。构建成pET．32a重组质粒，将这两种病毒的连接产物PET-TS、PET．TZ，转化大肠杆菌DH5a，PCR和酶切筛选阳性克隆，均证明重组质粒的构建是正确的，经上海英潍捷基生物公司测序鉴定外源插入片段的方向和序列均正确，确定基因片段的读码框正确，没有发生碱基突变。喜喜枣专图5．2TsWV、TZSVNSm基因PCR克隆产物琼脂糖凝胶电泳Fig5．2AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsofTSWV、TZSVNSmgene5．2。2TSⅥⅣ、TZSV运动蛋白的原核表达将重组质粒PET．TS、PET．TZ导入大肠杆菌BL21(DE3)，每种挑取5个PCR阳性单菌落于LB含氨苄青霉素(100pg／mL)液体培养基中培养，经0．5mMIPTG诱导4h蛋白表达后进行SDS．PAGE电泳分析表达蛋白的情况。‘≈ 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和TZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备结果发现，在37"C条件下诱导TsWV的5个单菌落均有蛋白表达，蛋白表达量相差不大，表达量比较多(图5．3)。而不加IPTG诱导的条件下，则没有该蛋白条带的产生。为了进一步分析温度对TSwV运动蛋白表达量的影响，相同的菌落，在其余条件相同的情况下，本实验将该组5个菌落在加入IPTG后，16"C下诱导过夜，所得结果如图5．4。结果发现，在16"C条件下诱导的蛋白量明显低于37"C下的诱导量，5个菌落的各自诱导量也相差不是很大。37"C条件下TswV运动蛋白的诱导明显优于16"C条件。因此，我们采用37"C条件进行该蛋白的大量诱导，因5个单菌落的表达量相差不大，随机选取一个进行实验。1234567891OM图5．3用pET·32a载体在大肠杆菌中37"C表达PET．TS的SDS．PAGE检测；1-5：37"{2+IPTG诱导；6-10：37"Cp；巳IPTG诱导；M：蛋白分子量markerFig5．3SDS-PAGEanalysesofPET—TSrecombinantproteinexpressedinEcoliusingpET．32avector(37"C)．1-5：37"C，induced；6—10：37"C，uninduced；M：Proteinmolecularweightmarker．1234567M蠲麟瓣磅强自曩夏!≥j篷一翠图5．4用pET一32a载体在大肠杆菌中16"C表达PET-TS的SDS．PAGE检测；1-5：16。C+IPTG诱导；6—7：16"C无IPTG诱导；M：蛋白分子量markerFig5．4SDS-PAGEanalysesofPET-TSrecombinantproteinexpressedinEcoliusingpET-32avector(16"C)．1-5：16"C，induced；6-7：16"(2，uninduced；M：Proteinmolecularweightmarker． 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和"I-ZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备由于在TswVNSm诱导的实验中，我们已经确定37。C对该蛋白的诱导表达更好，而TZSV与TswV隶属于同一病毒属且两者NSm基因的位置和大小也相仿，因此PET．TZ载体我们只进行了37"(2条件下的诱导。对PET．TZ筛选的5个阳性菌株，在37。C温度下用IPTG诱导4h发现，5个菌株都有目的蛋白表达，但是l、2、3号菌株的表达量不及4、5号菌株，4号菌株的表达效果最好，因此我们选取4号菌株进行该蛋白的大量表达。图5．5用pET·32a载体在大肠杆菌中37"C表达PET-TZ的SDS-PAGE检测；1-5：37"C+IPTG诱导；6-9：37"C无IPTG诱导；M：蛋白分子量markerFig5．5SDS·PAGEanalysesofPET—TZrecombinantproteinexpressedinEcoliusingpET-32avector(37"C)．1-5：37"C，induced；6·9：37"C，uninduced；M：Proteinmolecularweightmarker．5．2．3Ts、^Ⅳ、TZSV运动蛋白的大量表达及纯化将选取的PET．TS、PET．TZ两个最适菌株用200mLLB液体培养基进行大量表达，破碎后取上清和沉淀进行SDS．PAGE检测，发现两个NSm蛋白都主要存在于沉淀里，上清液也有少量蛋白存在(图5．6)。上清液用Ni+-NTA亲和层析柱纯化回收，用10、20、50、100、200、300、400mM咪唑梯度洗脱，在200mM浓度时可成功得到高含量高纯度的NSm蛋白，与预期的重组融合蛋白大小一致，而含pET．32a空载体的菌液无论是否经IPTG诱导均无此条带。通过WesternBlot并0用TSwVNSm蛋白多克隆抗体检测原核表达的NSm蛋白，表达蛋白在相应的大小处与多克隆抗血清发生特异性发应。由于TZSV多克隆抗血清正在制备过程中，该结果暂时未予显示。 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和TZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备123456M图5．6PET．TS重组蛋白SDS．PAGEl：PET—TS上清；2：PET．TS沉淀；3：PET-TS全蛋白加IPTG；4：PET．TS全蛋白不加IPTG；5：pET．32a空载体加IPTG；6：pET．32a空载体不加IPTG；M：蛋白分子量marker。Fig5．6SDS—PAGEanalysesofPET-TSrecombinantprotein．1：ThesupematantsofPET·TS；2：TheprecipitationsofPET-TS；3：TotalproteinsofPET-TSwithIPTG；4：TotalproteinsofPET．TSwithoutIPTG；5：TotalproteinsofpET．32awithIPTG；6：TotalproteinsofpET·32awithoutIPTG；M：Proteinmolecularweightmarker．1234567M图5．7PET．TZ重组蛋白SDS．PAGE1：PET．Tz全蛋白不加IPTG；2：PET．Tz全蛋白加IPTG；3、4：PET．TZ上清；5：PET．Tz沉淀；6：pET．32a空载体不加IPTG；7：pET．32a空载体加IPTG；M：蛋白分子量marker。Fig5．7SDS·-PAGEanalysesofPET--TZrecombinantprotein1：TotalproteinsofPET-TZwithoutIPTG：2：TotalproteinsofPET．TZwithIPTG：3、4：ThesupematantsofPET-TZ；5：TheprecipitationsofPET-TZ；6：TotalproteinsofpET一32awithoutIPTG；7：TotalproteinsofpET-32awithIPTG；M：Proteinmolecularweightmarker． 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和TzSV运动蛋白的原核表达及抗体制各图5．8Tswv重组NSm蛋白纯化洗脱SDS．PAGE和Westernblot分析l：lOOmM咪唑浓度洗脱的蛋白；2：200mM咪唑浓度洗脱的蛋白；3：对纯化后NSm重组蛋白的Westernblot检测；M：蛋白分子量marker。Fig5．8SDS-PAGEandWesternblotanalysisofpurifedrecombinantNSmproteinofTSWV．1：TSWVNSmproteinelutedbyimidazolefinalconcentrationof100mM；2：200mM；3：WesternblotanalysisofthepurifiedTSWVNSmprotein；M：proteinmolecularweightmarker．7654321M鬻鬟图5．9TZSV重组NSm蛋白纯化洗脱SDS．PAGE1．7：不同咪唑浓度洗脱的蛋白(10mM，20mM，50mM，100mM，200mM，300mM，400mM)；M：蛋白分子量marker。Fig5．9SDS．PAGEanalysisofpurifedrecombinantNSmproteinofTZSV．1．7：TSWVNSmproteinelutedbyimidazolefinalconcentrationof10mM，20mM，50mM，lOOmM，200mM，300mM，400mM，respectively；M：proteinmolecularweightmarker．57蘩 浙江大学硕士学位论文第五章TSWV和"IZSV运动蛋白的原核表达及抗体制备5．3小结与讨论本实验通过克隆Tswv和TZSV的NSm基因，构建到表达载体pET-32a上，在大肠杆菌内成功的表达了这两种蛋白，为体外研究这两种病毒的运动蛋白的功能提供了条件。由实验结果可知无论是TSWV还是TZSV，NSm蛋白都主要存在于破碎细胞后的沉淀里，说明在原核表达过程中，这两种蛋白主要是以包涵体的形式存在，该现象可能与NSm蛋白的特性有关。根据国内外的研究，NSm蛋白为TsWV的运动蛋白，我们之前的实验也证明TZSV的NSm蛋白也是该病毒的运动蛋白，这两种蛋白都具有胞间连丝定位的特性，而胞问连丝的连接孔内富含质膜结构穿过细胞壁(Maule，2008)，与细胞壁联系密切，由于NSm蛋白能与胞间连丝内的蛋白相互作用，说明两者具有一定的亲和性，容易随着细胞壁沉淀下来。对于植物病毒的检测，以往的研究大部分是利用病毒颗粒及用病毒体内的外壳蛋白作为抗原制取病毒的抗血清进行检测。而植物病毒的运动蛋白大多在病毒侵染的早期阶段表达量较高，因此，制备病毒运动蛋白的抗血清对于植物病毒侵染早期阶段的检测具有十分重要的意义。我们下一步实验将对这两个蛋白的病毒检测效用方面进行进一步的探索。自1971年Faulk和Taylor建立了免疫胶体金电镜-#．_后(FaulkandTaylor，1971)，该技术被广泛的应用于各类蛋白的亚细胞定位研究(MacQuillan，eta1．，2009)(LeHoux，eta1．，1996)，目前还有研究者将该技术应用到了细胞的三维亚细胞定位研究(Ziese，etal．，2002)，因此该方法对生物体蛋白的功能研究具有十分重要的意义。本实验通过纯化表达该属两种蛋白的NSm蛋白，制备该种蛋白的抗血清，为进一步利用胶体金技术研究该蛋白在细胞内的功能定位提供材料。 浙江大学硕士学位论文全文小结1、TswV、TZSV为同一个属的病毒，侵染植物症状差异明显，基因组结构和编码策略相似，同源性较低。观察常温固定包埋和高压冷冻固定包埋两种方法处理的感病植物叶片发现，两种病毒的病毒形态及细胞病理变化大致相似，但细胞器病理变化差异较明显。与TSWV相比，TZSV对细胞器的影响更大。TZSV侵染的叶片在叶绿体处产生的囊泡几乎占据整个叶绿体，片层结构破坏更加严重。在线粒体中也能够产生与叶绿体内相似的囊泡结构，这种现象在TSWV侵染的叶片内难以观察到，相比之下，TSWV侵染的叶片线粒体保存的更加完好。推测两种病毒侵染植物的途径和在细胞内的转移有一定的联系，但也可能会存在差异。2、为了研究两种病毒在细胞间运动的机制，将Ts、w、TZSV运动蛋白NSm融合GFP蛋白观察其定位情况。利用植物双元表达载体pCHF3，将目的蛋白基因与∞P基因一起插入该载体内构建重组质粒，农杆菌介导浸润本氏烟叶片，发现TswV、TZSVNSm．GFP融合蛋白会在植物细胞内扩散，能够在细胞壁胞间连丝处定位，植物表皮细胞定位结果一致，说明NSm蛋白为这两种病毒的运动蛋白。3、利用Bac．to．Bac杆状病毒表达体系转染昆虫Tn细胞。观察发现与单独表达GFP在细胞壁周围和细胞核处均匀分布不同，TSwV的GFP-NSm融合蛋白能够在昆虫Tn细胞表面诱导产生数量众多的管状结构并向外延伸，长度远长于在胞间连丝处形成的NSm蛋白小管。TZSV的GFP-NSm融合蛋白也能在昆虫Tn细胞内表达，但是不能产生管状结构，主要分布在细胞质内，成团块状聚集；该蛋白也能在细胞核表面定位，呈网刺状，围绕着细胞核形成圆环形。两者在昆虫Tn细胞内的定位情况存在差异，推测造成该结果原因：一是两者基因组同源性较低，NSm同源性仅为39％左右，基因组结构的差异有可能导致编码蛋白构象上存在差异，从而诱使功能变化；二是两种蛋白与寄主因素的互作可能存在不同，受寄主体内各种蛋白或离子的调节，病毒在细胞内的移动可能存在不同的机制，则运动蛋白的定位功能受到影响；三是TZSV的MP形成管子的过程中需要植物寄主某种因素的参与，而Tn昆虫细胞内该因素不存在或与植物细胞的特性差异较大。4、通过原核表达方式获得了TsWV、TZSVNSm高度纯化蛋白，制备两种蛋白的多克隆抗血清用于免疫胶体金标记定位两种蛋白的亚细胞定位情况。虽然结果还需进一步的 浙江大学硕士学位论文全文小结实验，但是根据之前的实验结果，推测两种蛋白在植物亚细胞内的定位也应存在一定的差异。综上所述，TswV、TZSV虽同属于同一属的病毒，但是侵染植物症状、细胞器病理变化、运动蛋白昆虫Tn细胞定位情况等都存在差异，推测两种病毒的细胞间运动方式有可能不同。本研究结果为进一步研究植物病毒的胞间运动机制尤其是大颗粒病毒的胞间运动机制提供帮助。60 浙江大学硕士学位论文参考文献1．Bassham，D．C．，Brandizzi，F．，Otegui，M．S．，andSanderfoot，A．A．(2008)．ThesecretorysystemofArabidopsis．TheArabidopsisbook／AmericanSocietyofPlantBiologists6，e016．2．Benitez-Alfonso，Y．，Faulkner,C．，Ritzenthaler,C．，andMaule，A．J．(20LO)．Plasmodesmata：gatewaystolocalandsystemicvirusinfection．MolPlantMicrobeInteract23，1403-1412．3．Berling，A．，W，L．-B．，andK，M．S．G．S．(1990)．Tomatosporedwiltvirus．Connaltreleprobl6mepourenrayerl’6pid6mie．Phytoma422，46-50．4．Carrington，J．C．，Kasschau，K．D．，Mahajan，S．K．，andSchaad，M．C．(1996)．Cell-to-CellandLong-DistanceTransportofVirusesinPlants．ThePlantcell8，1669-1681．5．Carvalho，C．M．，Pouwels，J．，vanLenLJ．W．M．，Bisseling，T．，Goldbach，R．W．，etaL(2004)．ThemovementproteinofCowpeamosaicvirusbindsGTPandsingle—s订andednucleicacidinvitro．JVirol78，1591·1594．6．Chen，C．C．，Chen，T．C．，Lin，Y．H．，Yeh，S．D．，andHsu，H．T．(2005)．Achloroticspotdiseaseoncallalilies(Zantedeschiaspp．)iscausedbyatospovirusserologicallybutdistantlyrelatedtoWatermelonsilvermottlevirus．PlantDis89，440-445．，7．Chen，C．C．，andChiu，R．(1996)．AtospovirusinfectingpeanutinTaiwan．．ActaHortic431，57-67．8．Chen，M．H．，Tian，G．W．，Gafni，Y．，andCitovsky，V．(2005)．Effectsofcalreticulinonviralcell-to-cellmovement．PlantPhysiol138，1866-1876．9．Ciuffo，M．，Kurowski，C．，Vivoda，E．，Copes，B．，Masenga，V．，eta1．(2009)．ANewTospovirusspinCucurbitCropsinMexico．PlantDis93，467—474．10．Ciuffo，M．，Tavella，L．，Pacifico，D．，Masenga，V．，andTurina，M．(2008)．AmemberofanewTospovirusspeciesisolatedinItalyfromwildbuckwheat(Polygonumconvolvulus)．ArchVirol153，2059-2068．11．Cortez，I．，Saaijer，J．，Wongikaew，K．S．，Pereira，A．M．，Goldbach，R．，etal．(2001)．IdentificationandcharacterizationofanoveltospovirusspeciesusinganewRT-PCRapproach．ArchVirol146，265-278．12．Cowan，G．H．，Lioliopoulou，F．，Ziegler，A．，andTorrance，L．(2002)．Subcellularlocalisation，proteininteractions，andRNAbindingofPotatomop-topvirustriplegeneblockproteins．Virology298，106-115．13．DeHaan，P．，Kormelink，R．，deOliveiraResende，R．，vanPoelwijk，F．，Peters，D．，eta1．(1991)．TomatospoaedwiltvirusLRNAencodesaputativeRNApolymerase．JournalofGeneralVirology72(Pt9)，2207·2216．14．Deavila,A．C．，Dehaan，P．，Kormelink，R．，Resende，R．D．，Goldbach，R．W．，eta1．(1993)．ClassificationofTospovirusesBasedonPhylogenyofNucleoproteinGene-Sequences．JGenVirol74，153-159．15．Donald，R．G．K．，Lawrence，D．M．，andJackson，A．O．(1997)．Thebarleystripemosaicvirus58一KilodaltonbetabproteinisamultifunctionalRNAbindingprotein．JVirol71，1538-1546．16．Dong，J．H．，Cheng，X⋯FYin，Y．Y．，Fang，Q．，Ding，M．，etaL(2008)．Characterizationoftomatozonatespotvirus，anewtospovirusinChina．ArchVirol153，855—864．17．Faulk，W．P．，andTaylor，G．M．(1971)．Animmunocolloidmethodfortheelectronmicroscope．Immunochemistry8，1081-1083．18．Fernandez-Moran，H．，andDahl，A．O．(1952)．Electronmicroscopyofultrathinfrozensectionsofpollengrains．Science16，465-467．19．Ghanekar，A．M．，Reddy，D．V．R．，Iizuka,N．，Amin，P．W．，andGibbons，R．W．(1979)．BUDNECROSISOFGROUNDNUTrARACHIS．HYPOGAEA)ININDIACAUSEDBYT(3lMATOSPOTTEDWILTVIRUS．AnnApplBioi93．173-&．20．Giesman-Cookmeyer，D．，andLommel，S．A．(1993)．Alaninescanningmutagenesisofaplantvirusmovementproteinidentifiesthreefunctionaldomains．ThePlantcell5．973—982．61 浙江大学硕士学位论文参考文献21．Hassani—Mehraban，A．，Botermans，M．，Verhoeven，J．T．，Meekes，E．，Saaijer，J．，etaL(2010)．AdistincttospoviruscausingnecroticstreakonAlstroemeriasp．inColombia．ArchViroll55，423-428．22．Hassani·Mehraban，A．，Saaijer，J．，Peters，D．，Goldbach，R．，andKormelink，R．(2005)．Anewtomato-infectingtospovirusfromIran．Phytopathology95，852-858．23．Hofmann，C．，Sambade，A．，andHeinlein，M．(2007)．PlasmodesmataandintercellulartransportofviralI州A．BiochemicalSocietytransactions35，142-145．24．IM，K．，andVC，E．(1993)．neuseofbaculovirusesasexpressionvectors．pdf．AppliedBiochemBiotechnol42．137—159．25．Jain，R．K．，Pappu，H．R．，Pappu，S．S．，Reddy，M．K．，andVani，A．(1998)．WatermelonbudnecrosistospovirusisadistinctvirusspeciesbelongingtoserogroupIV．ArchVirol143．1637—1644．26．Kalinina,N．O．，Rakitina,D．V．，Solovyev，A．G．，Schiemann，J．，andMorozov，S．Y．(2002)．RNAhelicaseactivityoftheplantvirusmovementproteinsencodedbythefirstgeneofthetriplegeneblock．Virology296，32l-329．27．Kasteel，D⋯TPerbal，M⋯CBoyer,J．C．，Wellinl(，J．，Goldbach，R．W．，eta1．(1996)．1nhemovementproteinsofcowpeamosaicvirusandcauliflowermosaicvirusinducetubularstructuresinplantandinsectcells．JGenVirol77(Pt11)，2857-2864．28．Kato，K．，Handa,K．，andKameya—1waki，M．(2000)．Melonyellowspotvirus：ADistinctSpeciesoftheGenusTospovirusIsolatedfromMelon．Phytopathoiogy90，422-426．29．Kikkert，M．，VanLent，J．，Storms，M．，Bodegom，P．，Kormelink，R．，etaL(1999)．Tomatospottedwiltvirusparticlemorphogenesisinplantcells．JVirol73，2288-2297．30．Kikkert,M．，vanPoelwijk，F．，Storms，M．，Kassies，W．，Bloksma，H．，eta1．(1997)．Aprotoplastsystemforstudyingtomatospottedwiltvirusinfection．JGenVirol78(Pt7)，1755-1763．31．Kormelink，R．，deHaan，P．，Meurs，C．，Peters，D．，andGoldbach，R．(1992)．111enucleotidesequenceoftheMRNAsegmentoftomatospottedwiltvirus．abunyaviruswithtwoambisenseRNAsegments．JGenVirol73(R11)，2795-2804．32．Kormelink，R．，Storms，M．，VanLent,J．，Peters，D．，andGoldbach，R．(1994)．ExpressionandsubcellularlocationoftheNSMproteinoftomatospottedwiltvirus(TSWV)，aputativeviralmovementprotein．Virology200，56-65．33．Laporte，C．，Vetter，G．，Loudes，A．M．，Robinson，D．G．，Hillmer，S．，eta1．(2003)．InvolvementofthesecretorypathwayandthecytoskeletoninintracellulartargetingandtubuleassemblyofGrapevinefanleafvirusmovementproteinintobaccoBY-2cells．nePlantcelll5．2058-2075．34．Law，M．D．，Speck，J．，andMoyer，J．W．(1991)．Nucleotidesequenceofthe3’non-codingregionandNgeneoftheSRNAofaserologicallydistincttospovirus．JGenViml72(Pt10)，2597·2601．35．Lawrence，D．M．，andJackson，A．O．(2001)．Requirementsforcell—to—cellmovementofBarleystripemosaicvirusinmonocotanddicothosts．MolPlantPathol2，65-75．36．Lee，J．Y．，Taoka,K．，Yoo，B．C．，Ben-Nissan，G．，Kim，D．J．，甜a1．(2005)．Plasmodesmal-associatedproteinkinaseintobaccoandArabidopsisrecognizesasubsetofnon-cell-autonomousproteins．11hePlantcell17．2817．2831．37．LeHoux，J．G．，Lefebvre，A．，Ducharme，L．，Lehoux，J．，Martel，D．，eta1．(1996)．SomeeffectsofalowsodiumintakeontheexpressionofP450aldosteronesynthaseinthehamsteradrenalcortex：immunoblotting，immunofluorescentandimmuno-goldelectronmicroscopicstudies．111eJournalofendocrinology149．341-349．38．Lent，J．W．M．v．，andSchmitt-Keichinger，C．(2006)．ViralMovementProteinsInduceTubuleFormationInPlantandInsectCells62 浙江大学硕士学位论文参考文献39．Leshchiner,A．D．，Solovyev，A．G．，Morozov，S．Y．，andKalinina，N．O．(2006)．AminimalregionintheNTPase／helicasedomainoftheTGBplplantvirusmovementproteinisresponsibleforATPaseactivityandcooperative砌NAbinding．JGenVirol87．3087-3095．40．Lewandowski，D⋯JandAdkins，S．(2005)．111etubule·formingNSmproteinfromTomatospottedwiltviruscomplementscell—to-cellandlong-distancemovementofTobaccomosaicvirushybrids．Virology342，26·37．41．Li，Q．，andPalukaitis，P．(1996)．Comparisonofthenucleicacid-andNTP-bindingpropertiesofthemovementproteinofcucumbermosaiccucumovirusandtobaccomosaictobamovirus．Virology216，71—79。42．Li，W．，Lewandowski，D⋯JHilf,M．E．，andAdkins，S．(2009)．IdentificationofdomainsoftheTomatospottedwiltvirusNSmproteininvolvedintubuleformation，movementandsymptomatology．Virology390，l10·121．43．Li，Y．，Bao，Y．M．，Wei，C．H．，Kang，Z．S．，Zhong，Y．W．，eta1．(2004)．RiceDwarfPhytoreovirusSegmentS6-EncodedNonstructuralProteinHasaCell-to-CellMovementFunction．JVirol78．5382-5389．44．Lim，H．S．，Bragg，J．N．，Ganesan，U．，Lawrence，D．M．，Yu，J．，甜a1．(2008)．TriplegeneblockproteininteractionsinvolvedinmovementofBarleystripemosaicvirus．JVirol82，4991-5006．45．Liu，C．，Ye，L．，Lang，G．，Zhang，C．，Hong，J．，eta1．(2011)．TheVP37proteinofBroadbeanwiltvirus2inducestubule-likestructuresinbothplantandinsectcells．VirusRes155，42-47．46．Luckow，V。A．，Lee，S．C．，Barry，G。F．，andOlins，P．O．(1993)。EFFICIENTGENERATIONOFINFECT／OUSRECOMBINANTBACULOVIRUSESBYSITE．SPECIFICTRANSPOSON—MEDIATEDrNSERTIONOFFOREIGNGENESINTOABACULOVIRUSGENOMEPROPAGATEDINESCHERICHIA．COLI．JVirol67，4566-4579．47．MacQuillan，G．C．，Caterina,P．，deBoer，B．，Allan，J．E．，Platten，M．A．，eta1．(2009)．Ultra·structuralIocalisationofhepatocellularPKRproteinusingimmuno-goldlabellinginchronichepatitisCvirusdisease．Journalofmolecularhistology40，171—176．48．Makarov，V．V．，Rybakova,E．N．，Efimov，A．V．，Dobrov，E．N．，Serebryakova,M．V．，eta1．(2009)．DomainorganizationoftheN-terminalportionofhordeivirusmovementproteinTGBpl．JGenVirol90．3022-3032。49．Matsushita,Y．，Ohshima,M．，Yoshioka，K．，Nishiguchi，M。，andNyunoya，H。(2003)．ThecatalyticsubunitofproteinkinaseCK2phosphorylatesinvitrothemovementproteinofTomatomosaicvirus．JGenVirol84，497．505．50．Maule，A．J．(2008)．Plasmodesmata：structure，functionandbiogenesis．Currentopinioninplantbiology11，680．686．51．McMichael，L．A．，Persley，D．M．，andThomas，J．E．(2002)．AnewtospovirusserogroupIVspeciesinfectingcapsicumandtomatoinQueensland，Australia．AustralasPlantPath31，231-239．52．Melcher，U．(2000)．111e’30K’superfamilyofviralmovementproteins．JGenVirol81，257·266．53．Neo，K．K．，Wong，S．M．，andWu，M．(1993)．Nucleotidesequenceandinvitrotranslationofthecoatproteingeneofcymbidiummosaicvirus．VirusGenes7，157—170。54．Niehl，A．，andHeinlein，M．(2011)．Cellularpathwaysforviraltransportthroughplasmodesmata．Protoplasma248，75-99．55．Noueiry，A．0．，Lucas，WJ．，andGilbertson，R．L．(1994)．TwoproteinsofaplantDNAviruscoordinatenuclearandplasmodesmaltransport．Cell76，925—932．56．Okazaki，S．，Okuda，M．，Komi，K．，Yoshimatsu，H．，and1wanami，T．(2007)．OverwinteringViruliferousFrankliniellaoccidentalis(Thysanoptera：Thripidae)asanInfectionSourceotTomatosporedwiltvirusinGreenPepperFields．PlantDis91，842-846．57．Padidam，M．，Beachy，R．N．，andFauquet，C．M．(1995)．TOMATOLEAFCURLGEMINIVIRuSFROMINDIAHASABIPAR-1、ITEGENOMEANDCOATPROTEINISNoTESSENTIALFORINFECTIVITY．JGenVirol76，25-35．63 浙江大学硕士学位论文参考文献58．Parrella,G。，Gognalons，P．，Gebre—Selassi6,K。，Vovlas，C．，andMarchoux，G．(2003)．AnupdateofthehostrangeofTomatospottedwiltvirus【LycopersiconesculentumMill．】．JoumalofPlantPathology85，227-264．59．Pascal，E．，Sanderfoot，A．A．，Ward，B．M．，Medville，R．，Turgeon，R．，eta1．(1994)．ThegeminivirusBRlmovementproteinbindssingle-strandedDNAandlocalizestothecellnucleus．111ePlantcell6，995·1006．60．Pouwels，J．，Kornet，N．，vanBers，N．，Guighelaar，T．，vanLent，J．，eta1．(2003)．IdentificationofdistinctstepsduringtubuleformationbythemovementproteinofCowpeamosaicvirus．JGenVirol84．3485-3494．61．Pouwels，J．，VanDerKrogt，G．N．，VanLent,J．，Bisseling，T．，andWellink，J．(2002)。nlecytoskeletonandthesecretorypathwayarenotinvolvedintargetingthecowpeamosaicvirusmovementproteintothecellperiphery．Virology297，48—56．62．Pouwels，J．，vanderVelden，T．，Willemse，J．，Borst,J．W．，vanLent，J，eta1．(2004)．StudiesontheoriginandstructureoftubulesmadebythemovementproteinofCowpeamosaicvirus．JGenVirol85，3787-3796．63．Reddy，D．V．R．，Patna,A．S．，Sudarshana,M．R．，Poul，F．，andKumar，I．K．(1992)．SerologicalRelationshipsandPurificationofBudNecrosisVirus，aTospovirusOccurringinPeanut(Arachis·HypogaeaL)inIndia。AnnApplBiol120，279-286．64．ResendeRO，PosserL，NagataI，BezzeraC，LimaMI，甜a1．(1996)．NEWTOSPOVIRUSESFOUNDINBRAZIL．AcreHort(ISHS)43l，78—89．65．Rigden，J．E．，Krake，L．R．，Rezaian，M．A．，andDry，I．B．(1994)．ORFC4oftomatoleafcurlgeminivirusisadeterminantofsymptomseverity．Virology204，847-850．66．Ritzenthaler,C．，andHofmann，C．(2007)．Tubule-GuidedMovementofPlantViruses。PlantCellMonographs7．63—83．67．Rojas，M．R．，Jiang，H．，Salati，R．，Xoconostle-Cazares，B．，Sudarshana，M．R．，eta1．(2001)．Functionalanalysisofproteinsinvolvedinmovementofthemonopartitebegomovirus，Tomatoyellowleafcurlvirus．Virology291，110-125．68．Satyanarayana，T．，Gowda，S．，Reddy，K．L．，Mitchell，S．E．，Dawson，W．0．，eta1．(1998)．PeanutyellowspotvirusisamemberofanewserogroupofTospovirusgenusbasedonsmall(S)RNAsequenceandorganization．ArchVirol143，353-364．69．Satyanarayana,T．，Mitchell，S．E．，Reddy，D．V．R．，Brown，S．，Kresovich，S．，eta1．(1996)．PeanutbudnecrosistospovirusSRNA：Completenucleotidesequence，genomeorganizationandhomologytoothertospoviruses．ArchVirol141，85·98．70．Schoelz,J．E．，Harries，P．A．，andNelson，R．S．(2011)．IntracellularTransportofPlantViruses：FindingtheDooroutoftheCell．Molecularplant4，813—831．71．ScholthoeH．B．(2005)．Plantvirustransport：motionsoffunctionalequivalence．Trendsinplantscience10，376-382．72．Seepiban，C，，Gajanandana，0．，Attathom，T．，andAttathom，S．(2011)．Tomatonecroticringspotvirus，anewtospovirusisolatedinThailand．ArchVirol156，263-274．73．Sin，S．H．，McNulty，B．C．，Kennedy，G．G．，andMoyer,J．W．(2005)．ViralgeneticdeterminantsforthripstransmissionofTomatospottedwiltvirus．ProcNatlAcadSciUSA102，5168-5173．74．Storms，M．M．，Kormelink，R．，Peters，D．，VanLent，J．W．，andGoldbach，R．W．(1995)．ThenonstmcturalNSmproteinoftomatospottedwiltvirusinducestubularstructuresinplantandinsectcells．Virology214，485-493．75．Su，S．，Liu，Z．，Chert，C．，Zhang，Y．，Wang，X．，eta1．(2010)．Cucumbermosaicvirusmovementproteinseversactinfilamentstoincreasetheplasmodesmalsizeexclusionlimitintobacco．ThePlanteell22．1373．1387．76．Ueki，S．，Spektor，R．，Natale，D．M．，andCitovsky，V．(2010)．ANK，aHostCytoplasmicReceptorfortheTobaccomosaicvirusCell-to-CellMovementProtein，FacilitatesIntercellularTransportthroughPlasmodesmata．PlosPathogens6．64 浙江大学硕士学位论文参考文献77．Verchot-Lubicz，J．，Torrance，L．，Solovyev，A．G．，Morozov，S．Y．，Jackson，A．0．，eta1．(2010)．VariedMovementStrategiesEmployedbyTripleGeneBlock-EncodingViruses．MolPlantMicrobeIn23，1231．1247．78．Wei，T．Y．，Zhang，C．W．，Hong，J．A．，Xiong，R．Y．，Kasschau，K．D．，eta1．(2010)．FormationofComplexesatPlasmodesmataforPotyvirusIntercellularMovementIsMediatedbytheViralProteinP3N·PIPO．PlosPathogens6．79．Wolf,S。，Deom，C。M。，Beachy，R．N．，andLucas，W．J。(1989)．Movementproteinoftobaccomosaicvirusmodifiesplasmodesmatalsizeexclusionlimit．Science246，377-379．80．Xiang，X．，Yang，R．，Yu，S．，Cao，C．，Guo，A．，eta1．(2010)．ConstructionofaBmNPVpolyhedrin-plusBac-to-Bacbaculovirusexpressionsystemforapplicationinsilkworm，Bombyxmori．ApplMicrobiolBiotechnol87，289·295．81．Xiong，R．，Wu，J．，Zhou，Y．，andZhou，X．(2008)．Identificationofamovementproteinofthetenuivirusricestripevirus．JViroi82，12304—12311．82．Ziese，U．，Kubel，C．，Verkleij，A．，andKoster，A．J．(2002)．Three—dimensionallocalizationofultrasmallimmuno-goldlabelsbyHAADF-STEMtomography．Journalofstructuralbiology138，58-62．83．陈坤荣，许泽永，晏立英，and王国平(2005)．番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒研究进展．中国油料作物学报27，91．96．84．洪健，李德葆，and周雪平(2001)．植物病毒分类图谱，Vol12(北京：科学出版社)．85．刘秀君，张献军，刘兰伟，孙燕霞，and刘红梅(2008)．马铃薯x病毒运动蛋白基因的原核表达、抗血清制各及应用．植物保护学报35，307．310．86．刘艳荷，陈艳霞，章亦卿，徐海君，and张传溪(2007)．棉铃虫核型多角体病毒off27基因的表达和细胞内定位．农业生物技术学报15，503～507．87．吴鸿，陈月琴，杨秉耀，andMUller，M．(2000)．低温电镜技术制备的树脂道细胞的超微结构．中山大学学报5，82-86．88．尹跃艳，董家红，程晓非，李婷婷，铭，丁．，ela1．(2011)．番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白抗血清制各及其血清学特性分析．植物病理学报41，482．485．89．于翠，邓风林，杨翠云，and吴建祥(2008)．番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及Dot．blotELISA检测方法的建立．浙江大学学报(农业与生命科学版)34，597—601．90．张正坤，吴祖建，沈建国，谢联辉，and林奇英(2008)．烟草花叶病毒运动蛋白的表达及特异性抗体制备．福建农林大学学报(自然科学版)37，265．268．91．祝建，and胡正海(1999)．低温电镜技术及其在植物(动物)材料研究中的应用．西北植物学报19，97．】03．65 附录A本论文中所用缩写与中英文对照缩写英文名中文名AcMNPVAutographacalifornicamultiplenucIeopolyhedrovirus苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ACrAmpANKANSVAPBDMVBisBmNPVBMVbpBSABSMVCaCVCaLCuVCaMVCCSVCLsMCMVCPCPMVCSNVDEVDMSOdNTPdsDNAdsRNADTTEBlEDTAERFCAFIAacrylamideampicillinankyrinrepeatcontainingproteinAlstroemerianecroticstreakvirusammoniumpersulfateBeandwarfmosaicvirusbisacrylamideBombyxmorinucIeop0Iyhedr0VirusBromemosaicvirusbasepairsbovineserumalbuminBarleystripemosaicvirusCapsicumchlorosisvirusCabbagelea／curlvirusCauliflowermosaicvirusCallalilychloroticspotvirusConfocallaserscanningmicroscopeCucumbermosaicviruscoatproteinCowpeamosaicvirusChrysanthemumstemnecrosisvirusdimethylsulfoxidedeoxyribonucleosidetriphosphateDoublestrandedDNAdouble．strandedDNAdouble—strandedRNAdithiothreitoIMicrotubuleend-bindingprotein1ethlenediaminetetraaceticacidendoplasmicreticulumFreund’scompleteadjuvantFreund’Sincompleteadjuvant66丙烯酰胺氨苄青霉素锚蛋白重复包含蛋白六出花坏死条纹病毒过硫酸铵菜豆矮缩花叶病毒N，N7-亚甲双丙烯酰胺家蚕核型多角体病毒雀麦花叶病毒碱基对牛血清白蛋白大麦条斑花叶病毒辣椒萎黄病毒大白菜曲叶病毒花椰菜花叶病毒马蹄莲褪绿斑病毒激光共聚焦显微镜黄瓜花叶病毒外壳蛋白豇豆花叶病毒菊花茎坏死病毒病毒的双层膜二甲亚砜脱氧核糖核苷三磷酸双链DNA双链RNA二硫苏糖醇微管末端结合蛋白1乙二胺四乙酸内质网弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂 GBNVGFWGFPGRSVGUSHPF．FSICTvINSVlPTGIYSVkbKmLBMeSMVmInMPMYSVNNSmNSP(BRl)nt0RFPAGEPBSPCFSVPCRPDPEGPRSVPSMVPVXPYSVRdRpRifSDSSELGroundnutbudnecrosisvirusGrapevinefanleafvirusgreenfluorescentproteinGroundnutringspotvirus6一glucuronidaseInternationalCommitteeonTaxonomyofVirusesImpatiensnecroticspotvirusisopropylthio-6一galactosidebovineIrisyellowspotviruskilobasekanamycinturia—BertanimediumMelonseveremosaicvirusminutemovementproteinmovementproteinMelonyellowspotvirusnucle—oproteinnon-structuralproteinnucleotideopenreadingframepolyacrylamidegeleletrophoresisphosphate-bufteredsolutionPeanutchloroticfanspotviruspolymerasechainreactionPlasmodesmatapOJyethyJenegIycoIPolygonumringspotvirusPhysalisseveremottlevirusPotatovirusXGroundnutyellowspotvirusRNA-dependentRNApolymeraseRifampicinsodiumdodecylsulfatesizeexclusionlimit67花生芽枯病毒葡萄扇叶病毒绿色荧光蛋白花生环斑病毒6．葡糖苷酸酶高压冷冻．冷冻置换技术国际病毒委员会凤仙花坏死斑病毒异丙基硫代．D．半乳糖苷鸢尾花黄斑病毒千碱基卡那霉素LB培养基甜瓜重型花叶病毒分钟运动蛋白移动蛋白甜瓜黄斑病毒核衣壳蛋白非结构蛋白核穿梭蛋白核苷酸开放阅读框聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液花生褪绿扇型斑病毒聚合酶链式反应胞间连丝聚乙二醇蓼环斑病毒酸浆重型斑驳病毒马铃薯X病毒花生黄斑病毒依赖于RNA的RNA复制酶利福平十二烷基磺酸钠分子扩散上限 SEVSqLCVSquashleQlcurlvirusTCSVTomatochIoroticspotvirusTEMEDN，N，N’，N’-tetralmethylethylenediamineTMVTobaccomosaicvirusTristrishydroxymethylaminomethaneTSWVTomatospottedwiltvirusTYRVTomatoyellowringvirusTzSVT0matozonatespotvirusVRCviralreplicationcomplexvRNPsviralribonucleoproteincomplexesWBNVWatermelonbudnecrosisvirusWSMoVWatermelo疗silvermottlevirusX—Gluc5-bromo一4一chloro一3-indolyl-8-glucuronicacidZLCVZucchini|ethalchlorosisV{rusp—MED-mercaptoethanoI病毒的单层膜南瓜曲叶病毒番茄褪绿斑病毒N，N，N，，N’．四甲基乙二胺烟草花叶病毒三羟甲基氨基甲烷番茄斑萎病毒番茄黄斑病毒番茄环纹斑点病毒病毒复制复合体蛋白．核酸复合物西瓜芽枯病毒西瓜银色斑驳病毒5一溴一4一氯一3．吲哚．p—D．葡糖苷酸南瓜致死褪绿病毒D．巯基乙醇 浙江大学硕士学位论文附录B：常用试剂的配制30％丙烯酰胺溶液丙烯酰胺87g二亚甲双丙烯酰胺3g用水溶解后定容至300ml，4。C保存。6xDNA上样缓冲液：溴酚蓝二甲苯青FF甘油蛋白变性提纯缓冲液母液配置：500mMNaH2P043MNaCl1MimidazoleLysisbuffer(40mL)50mMNail2P04300mMNaCll0mMimidazole用NaOH调pH至8．0TBST：TBS中加Tween20至O．05％0．25％30％78g／L1749／L68g,m母液4mL母液4mL母液400uL4×分离胶缓冲液Tris90．83gSDS2g加水溶解，用浓盐酸调pHi8．8，定容至500ml。 浙江大学硕士学位论文附录B：常用试剂的配制4x浓缩胶缓冲液Tris12．11gSDS0．8g加水溶解，用浓盐酸调pH至6．8。定容至200ml。3％甲醛固定液甲醛lml0．1M磷酸缓冲液(PH7．2)99ml碱性磷酸酶(AP)底物缓冲液Tris-HCI(PH9．5)NaClMgCl2碱性磷酸酶(AP)显色液AP底物缓冲液NBTBCIP0．2mol／LPB缓冲液(pH7．5)Na2HP04·12H20NaH2P04·2H20定容至1000ml。0．01mol／LPB接种缓冲液(pH7．5)0．2mol／LPB缓冲液稀释20倍。100mM5mM10ml66山339l42．40g4．42g70 浙江大学硕士学位论文附录B：常用试剂的配制0．01mol／LPBS缓冲液Na2HP04’12H2015gKH2P041gNaCI40g定容至5000ml，调pH至7．2。LB液体培养基Bacto一蛋白胨109酵母抽提物59NaCl10975口950ml水溶解，用5NNaOH调pHi7．0。定容至1000ml，高压灭菌后保存。YEP液体培养基Bacto．蛋白胨lOg酵母抽提物10gNaCl5g加950mLH20溶解，用5MNaOH调pH至7．0。定容至1000mL，高压灭菌后4。C保存。5×TBE缓冲液Tris54g硼酸27．5mLO．5MEDTA(pH8．0)20mL用水定容至1000mL，用时稀释10倍。o．1M磷酸盐缓冲液(PH7．0)Na2HP04·12H20NaH2P04’2H20218．5lg60．84971 浙江大学硕士学位论文附录B：常用试剂的配制o．1M磷酸盐缓冲液(PH7．2)Na2HP04·l2H20NaH2P04·2H20257．92943．68910mg／mLEB在10mLddH20中加入100mgEB，混匀溶解后用铝箔包裹，保存于室温。1．0kbMarker(Sangon)100L1．0kbMarker原液加入200L6xLoadingBuffer，700LddH20，混匀保存于40C。麦康凯固体培养基每1000ml水中7汩489培养基粉，煮沸溶解后分装三角瓶，高压灭菌后保存。柠檬酸铅染色液硝酸铅1．339柠檬酸三钠1．769ddH2030ml用力振荡30min，使溶液呈乳白色。加入1MNaOH8ml，溶液变透明，然后ddH20定容至50ml。浸润buffer母液配制1mol／LMgCl2；100mMMES(pH5．6)；2mM乙酰丁香酮(Ace)MgCl2(1M)10皿MES(100mM)100此Ace(2mM)50此无菌水840山至终体积1mL。 塑垩奎兰堡主兰位论文附录B：常用试剂的配制1％四氧化锇固定液四氧化锇0．1M磷酸缓冲液Western转移缓冲液甘氨酸TrisSDS甲醇加水定容至1000ml。1ml99ml2．9g5．8gO．37g200mlWestem印迹底物缓冲液Tris12．14gNaCI5．84gMgCl20．475gHCI调pH至9．5，加水至1000mL3％戊二醛固定液戊二醛3mlO．1M磷酸缓冲液(pH7．0)97ml1％戊二醛固定液戊二醛lmlO．1M磷酸缓冲液(pH7．2)99ml50％乙醇的醋酸双氧铀饱和溶液醋酸双氧铀50％乙醇29100ml 浙江大学硕士学位论文一一堕墨竺!堂里垡兰蔓型：坌王生望堂蔓型垄塑附录c：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器1、常用化学试剂十二烷基硫酸钠(SDS)丙烯酰胺(Acrylamide)甲又双丙烯酰胺(Bisacrylamide)过硫酸铵N，N，N’，N’．四甲基乙二胺(TEMED)TritonX-100p．巯基乙醇(p-mercaptoethan01)三羟甲基氨基甲烷(Tris)牛血清白蛋白[BSA)琼脂糖(Agarose)聚乙二醇(PEGS000)其它常用化学试剂均为国产分析纯。2、分子生物学试剂多种限制性内切酶碱性磷酸酶(AP)TRIzolRegeantTaqDNA聚合酶Western．blotkitQIAprepSpinMiniprepKitQIAquickGelExtractionKit3、仪器高速台式离心机5417C高速离心机J2-HS高速台式离心机5417CBio．radPCR仪进口分装PromegaSigmaBRLInvitrogenSangonPromegaTakaraSigmaInvitrogenSangonPromegaAxygenEppendorfBeckmanEppendorfBio．Rad74 浙江大学硕士学位论文附录c：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器紫外分光光度计UV-2201杂交炉UV交联仪H．7650电镜平板、垂直板电泳仪其它小型仪器均为国产EppendorfPharmacia日本Hitachi公司Bio．Rad75