补体c5a及其受体拮抗剂在阿尔茨海默病小胶质细胞病变模型中的作用

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文补体C5a及其受体拮抗剂在阿尔茨海默病小胶质细胞病变模型中的作用TheeffectofC5aandC5areceptorantagonistonthepathologicalchangesofMicroglialcellsinAlzheimer’Sdisease课题来源：广州市科技计划项目基金(2010Y1一C101)学位申请人杨帆导师专业培养所在姓名徐书雯名称神经病学类型学术型层次硕士研究生学院第二临床学院2013年3月18日广州硕士学位论文lHMMIPililiHHIMilllPiiY24

2、05636补体C5a及其受体拮抗剂在阿尔茨海默病小胶质细胞病变模型中的作用硕士研究生：杨帆指导教师：徐书雯摘要阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)以进行性认知功能障碍和神经元病理性丢失为特征，是当今世界老龄化趋势下出现的主要神经变性疾病之一。与AD病因机制相关的假说较多，如AB毒性学说、Tau蛋白假说、炎症机制、自由基损伤学说、胆碱能学说等等，尽管众说纷纭，但A13毒性学说仍是目前的主流学说。AD主要是由于AB(B．amyloidprotein)沉积形成的老年斑与高度磷酸化Tau蛋白聚集形成造成神经纤维缠绕和

3、神经元丢失。在神经变性疾病的相关研究中发现，AB以寡聚体或纤维体两种状态存在，这两种状态的A13对神经细胞功能损伤的强度不同，一般认为，A13寡聚体的毒性较纤维体更强，但由于寡聚体的稳定性较差，易向纤维体转化，体外研究操作时间窗相对较短，所以使用寡聚体进行实验之前，对其进行鉴定就显得尤为重要，否则容易导致试验药物有效的假阳性结果，但目前关于A13聚集状态的鉴定方法报道较少。为此，本实验先制备不同聚集状态的A131．42，然后通过原子力显微镜直观比较、鉴定两种AB1．42形态。在AD病理过程中，由于A13产生和清除的动态失衡，过

4、多的AB聚集沉积形成老年斑，在AD老年斑周围聚集了大量活化的小胶质细胞，AB可促进小胶质细胞产生如TNF-一Q、IL一113等炎症因子，从而对神经元在内的各种细胞造成损失甚至凋亡，本实验通过体外建立AD小胶质细胞模型，为AD的炎性机制研究提供体外实验依据。已有研究发现，补体系统在阿尔茨海默病的炎性发病机制中发挥重要作用。A13、小胶质细胞、星形细胞及异常上调表达的补体和细胞因子共同形成了复T摘要杂的炎性损伤网络，引起一系列炎症反应，最终导致神经细胞凋亡，补体系统介导的损害是AB细胞毒性作用机制中的重要环节之一，A13与经典补体

5、激活通路的Clq发生特异性结合，Clq经AB的激活而活化，活化的C1q随之活化C3、C4、C5因子，并使补体裂解生成多种生物活性片段，包括C3a、C4a、C5a，最终形成膜攻击复合物(MAC，C5b-9复合体)，具有神经毒性的MAC可直接溶解神经元，在AD脑内造成神经元凋亡。其中，补体系统的C5a在AD致病过程中的作用不详，最近研究发现，在C3基因敲除(C3．／．)小鼠中，IgG免疫复合物依然能够对小鼠产生C5a依赖的急性肺损伤，且损伤强度与野生型小鼠(C3+／+)的作用相当，这说明C5a的产生可以是非C3依赖性的，这是一条崭

6、新的补体激活途径，同时提示，C5a的产生同样会产生类似补体系统经传统途径激活后所导致的炎症损伤作用。C5a可吸引表达C5a受体的小胶质细胞和星形胶质细胞向活化部位聚集，然后与A13发挥协同作用，刺激胶质细胞产生细胞因子、趋化因子、黏附分子等，也可直接与小胶质细胞结合诱发氧化应激反应，导致邻近的神经细胞损伤或死亡。因此，本研究将验证补体C5a对AD小胶质细胞激活、炎性介质释放的可能作用及其机制，并进一步明确C5a受体拮抗剂PMX205对上述病变过程的干预作用。【目的】建立AB1-42寡聚体和纤维体的制备及其鉴定方法，利用AB卜4

7、2寡聚体刺激小胶质细胞建立阿尔茨海默病(AD)小胶质细胞病变模型：在此基础上，探讨补体C5a对AD小胶质细胞模型释放炎性因子的作用及其机制，明确C5a受体拮抗剂对上述病变过程的干预作用。【材料和方法】1材料：小鼠BV2小胶质细胞株购白武汉大学的中国典型培养物保藏中心，澳洲胎牛血清(GIBCO)，DMEM／F12高糖培养基(GIBCO)，胰酶(含EDTA，0．25％，吉泰生化公司)，人工合成的生物晶体A131．42(ENZ0公司)，六氟异丙醇(HFIP,Sigma)，二甲基亚砜(DMSO，MPBiomedicats)，补体C5a

8、(HBTⅡ硕士学位论文公司)，C5a受体拮抗剂(PMX205)hydrocinnamatc-[OP(D-Cha)WR](上海吉尔生化有限公司合成)，PE标记的抗小鼠CD88流式抗体(Biolcgcnd公司)，小鼠TNF．CtELLSA试剂盒(Biolcgcnd公司)，CCK-