乙内酰脲酶基因分离和表达及结构和功能的研究

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1、洗辩药群太学论顿一卜学位论文：乙内酰腻辩肇闲盼分离与表达授臻鞫与功熊研究中文猜凝本磺究毽括一静舀．己蠢酝驻錾薪基嚣浆分离与表达秘一秘L-乙表醚踩窳解酶结构模建与定点突变分孝厅鼹个部分。BT81l是从土壤中筛选出的一株m忍内酰脲酶产生菌。以粘粒pKC505为载体构建了BTS01的基豳文庠，用功能筛选的方法从文库中筛选得到了具奄乙内蘸骤酶活性豹阳往竞窿，经过豫克陵获褥了编鹞乙内酸派承解酶(HyuH)帮N．爨甲酰氨基酸忒骐酶(I-I辨C)豹序列√序列分辑绩果表明，乙内酰黻水解酶的结构基因长1454bp，编码分子羹为

2、53，OkD的蛋白，蛋自等电点为4．82；N．氨甲酰乙内酰脲水懈酶的结构基因长1248b口，编码分子量为45_2kD静蛋舀，蛋白的等电焦为4．95。对所获褥的穰营酸浮剜进行阐源援索，结巢表鹗分囊褥戮熬棱营酸涛熨为一耱羲懿乙究酰骤酶基翟，岛该黟熨弱源性最高的序列是Brucellasuis的D．己内酰骤酶基因，瓶者己内黢脲水解酶基因和N．氨甲酰氨基酸水解酶熬因的核瞀酸序列一致性分别为85％和84％。用pQE表达载体对2个基因分潮进行了表达，活往检测结果表明，乙内酰藤承解酶籀鞯氨甲装氮萋酸承解辩豹灞往分鬟魄密发菌株

3、离1．8倍释1．6倍，SDS—PAGE结果擞示，墨戆蛋自约分子量与一级结搦预测结累翱符合。芦

4、耐B)8椭状结构域的侧面，由分子的N一端和C-端缀成。根据BT801乙内酰臊永解酶的三维络梅特征及薅活性部经麓缣守校，臻定了BTS01己内酸躲隶解酶瓣底携结会都位，羚扳了酶溪性申心的特征及与底物专一燃相关的爨基酸残基位点漶援分析结果设计了忍内酰脲水解酶突变体的构建方案，并通过熏叠延伸PCR方法构建了乙内醺滕水解酶突变体。／突变体活性检测结果表明，147位羧化的赖沈阳药科大学论碗：仁学位论文；乙内酰臊酶基瑚的分离与表选及结构q功能研究蘸酸(Kcx埘)楚维持懿活牲数努霉残蒺；72缎夔天冬聚氯瓤97垃约魏氨酸突变为

5、酪氨酸和苯丙氨酸(Asn72一Tyr豫，Ser97一Phe97)后，酶的活性降低，寒发现懿豹底狻选择性囊蘑改变。≯√关键词：乙内酰脲酶：基因分离；同源模建；定点突变7泷稻药辞夫学论硬莨掌谴论文：乙舞蕺鞭薅摹塔熟分离与表遮发结辫耘功畿秘巍AbstractThispapercomprisestheisolationandexpressionofD-hydantoinasefromBT81landthehomologymodelingofthespaeialstl'uetureandtheanalysisofsit

6、e-directedmutagenesisofL-hydantoinhydrolasefromArthrobacterBTS01．BT81tisaD-hydantoinaseproducingswainisolatedfromsoil，ThegenomiclibraryofBTSl1wasconstructedwithashuttlecosmi建pKC505，andapositivecloneWaSselectedbydetectiorlofbiologicalactivityofthetransforman

7、ts．Asequenceof4．5kbencodinghydantoinutilityoperonWaSdetectedbysubclone训tllpUCl8．Twoopenreadingframeswasconfirmed，all如“Hgeneencodedahydamoinhydrotase，aproteinof53kDwithisoelectric羚殛越霹。82}all毋撼geneencodedN-carbamoytase，aproteinof45．2kDwithisoeleetricpointat4。

8、95．TheBLASTsearchOndatabaseofGenBankrevealedthathydantoinasegeneismosthomologoustoaD-hydanminasegenefromBrucellasuis。、Ⅳimahomologyof85％inN-carabmoylaminoacidshydrolasesequenceand84％inhydantoinhydrolyas