ampk激活剂metformin和aicar抑制紫外线辐射诱导皮肤癌机制的研究论文

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1、·中文论著摘要·AMPK激活剂AICAR和Metformin抑制紫外线辐射诱导皮肤癌的机制研究．▲』．—JL刖吾日光紫外线(ultravioletradiation，uv)照射可引起急性损伤如日晒伤和慢性累积性损伤如皮肤癌及光老化。目光中紫外线诱导的DNA损伤是导致皮肤癌发生的一个重要因素，同时在皮肤癌细胞中发现，调控细胞增殖、分化和凋亡的特异性基因出现与紫外线损伤相关的变异。根据日光中紫外线波长的不同，可将其分为3种：UVA，UVB和UVC，造成生物损害的紫外线主要是波长短，能量较高的uvB(波长290—320nm)，是导致DNA损伤的主要类型。目前已证实一些原癌基因和抑

2、癌基因由于紫外线引起的DNA损伤而发生变异。UV诱导产生皮肤癌是一个复杂的过程，涉及到许多细胞和分子水平上的变化，同时还与DNA的修复作用相关。肿瘤的发生、发展及远处转移是一个复杂的过程，事实上，恶性增生多数是由多种因素和多条信号转导通路失调促成的。磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是体内的能量调节器，AMPK激活后可促进葡萄糖重吸收、糖酵解和脂肪酸氧化，减少脂肪酸、胆固醇和蛋白质的合成，储存能量，被称为“细胞能量调节器"，近年来关于该通路在肿瘤的发生发展中的作用研究很多，发现其在多种肿瘤中表达缺失。AICAR和metformin是目前研究最多的AMPK通路激活剂，本文通过体

3、外细胞实验及构建SKH—l无毛小鼠紫外线致皮肤癌模型研究该药物对紫外线辐射诱导皮肤癌的预防和治疗作用，并阐明其机制。目的本实验拟观察AICAR和metformin处理的正常人上皮角化细胞(normalhumanepidermalkeratinocytes，NHEK)及AMPKwide—type(WT)和AMPKknockdown(KD)鼠胚胎成纤维细胞(m01lseemb删omcfibroblast，MEF)，经过紫外线(主要是UVB)辐射后AMPK通路相关分子改变，及DNA损伤修复改变，并通过构建紫外线致SKH．1无毛小鼠皮肤癌模型研究这两种药物对紫外线辐射诱导皮肤癌的预

4、防和治疗作用，并探讨其作用机制。材料与方法l、常规培养的MEF细胞WT和KO，加或不加AICAR及metformin处理24，48，72h后，MTS方法检测细胞存活曲线。2、常规培养的MEF细胞，WT和KD，照射UVB(10焦耳)，后O，6，24，48h提取DNA；常规培养的MEF细胞WT和KD分别加或不加AICAR及metformin培养24h后，照射UVB(10焦耳)，后O，6，24h提取DNA；SKH．1无毛小鼠，UVB照射前1h，后背涂或不涂丙酮配置的AICAR和metformin溶液，进行单次UVB照射后处死小鼠，剥离皮肤提取DNA；SlotBlot方法检测UVB

5、照射后不同时间DNA片段CPD及6．4PP修复情况。3、动物实验：动物培养遵守芝加哥大学动物保护和使用机构条例，分为2部分，第一部分，预防辐射致皮肤癌模型：SKH．1无毛小鼠，分为4组，对照组，单纯照射组，AICAR(1um01)处理组，Metformin(2um01)处理组，每周UVB照射(100rrd／cm2)三次，连续25周，实验组小鼠每次照射前后背照射区域皮肤涂AICAR或metformin。每周记录小鼠体重变化及皮肤变化，记录肿瘤发生时间，及肿瘤数目。第二部分，辐射致皮肤癌治疗模型：SKH．1无毛小鼠，每周UVB照射(100mJ／cm2)三次，至17周，按照生成肿

6、瘤大小及数目随机分为单纯照射组，metformin涂药治疗组，metformin灌胃治疗组，继续照射，每日照射前进行相应处理。继续每周记录肿瘤数目，大小变化。4、提取细胞蛋白，小鼠后背皮肤蛋白，采用Westernblot法检测ERK通路相关分子变化及DNA修复相关蛋白变化。5、HE染色观察照射后各组小鼠皮肤上皮增生增厚情况。6、免疫组化方法检测照射后小鼠正常皮肤及肿瘤组织增殖因子鼬67表达情况。7、采用Prism5(GraphPadsoRware，SanDiego，CA)统计软件分析，所有数2据用3次独立实验的均值4-标准误表示，采用t检验及方差分析，尸<0．05为有统计学

7、意义。结果1、为了证实AMPK信号通路在皮肤癌发生发展中的作用，我们用WesternBlot检测了P．AMPK，P．ACC，ACC在正常人皮肤上皮细胞，人皮肤癌细胞，紫外线诱导小鼠皮肤癌细胞，及紫外线照射后O．5，6，24h正常小鼠皮肤、未照射小鼠皮肤中的表达，我们发现AMPK信号通路在皮肤肿瘤中被抑制，紫外线照射短时间内0．5和6h时被激活，24h后被抑制。2、激活AMPK通路抑制紫外线诱导的小鼠皮肤肿瘤形成。我们用AMPK信号通路激活剂AICAR及metformin处理SIⅢ．1无毛小鼠，westernBlot