缺氧高糖预处理huc-mscs诱导分化为内皮样细胞的实验研究

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1、目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文缺氧高糖预处理hUC．MSCs诱导分化为内皮样细胞的实验研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOQO00⋯⋯⋯⋯⋯OOBOO。8一日O舌“⋯””“⋯”⋯⋯⋯”⋯””””⋯⋯⋯“”。材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果000⋯⋯⋯⋯OO00⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯00O025附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOO⋯⋯⋯⋯39讨论⋯0QOO

2、⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯···““⋯⋯““42结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯DOO⋯⋯⋯OO0Q⋯45参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45综述脐带间充质干细胞治疗糖尿病下肢血管病变的研究进展⋯47致谢000⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨·⋯⋯⋯⋯”61中文摘要缺氧高糖预处理hUC-MSCs诱导分化为内皮样细胞的实验研究摘要目的：对脐带问充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC．MSC

3、s)及脐静脉内皮细胞分离培养和体外传代扩增，探讨通过氯化钴模拟糖尿病下肢血管病变的缺氧环境及高糖培养基模拟糖尿病患者体内的高糖环境对脐带间充质干细胞进行干预，观察对其影响，并对其进行诱导分化为内皮样细胞，进一步进行内皮样细胞与脐静脉内皮细胞生物活性及形态的比较，以探索高糖缺氧预处理hUC．MSCs是否更易发挥内皮细胞功能，更有利于改善糖尿病下肢血管病变，有助于血管修复和重建。方法：1无菌条件下取剖宫产胎儿脐带(获得家属知情同意)，进行hUC．MSCs(自血管之间沿血管长轴剪开脐带被膜，去掉两根脐动脉及一根脐静脉，提取脐带中的W

4、harton’SJelly采用组织块贴壁培养法分离培养MSCs)及脐静脉内皮细胞(无菌条件下取足月剖宫产胎儿脐带，用胶原酶消化方法获取)分离培养与扩增，并在倒置显微镜下观察其形态变化，分别通过流式细胞仪及免疫组化进行鉴定。2选取状态良好的第二代或第三代hUC．MSCs，对其进行化学试剂氯化钴(COCL2)诱导缺氧，通过MTT法及台盼兰检测不同浓度(50umol／L、lOOumol／L、200umol／L、300umol／L、400umol／L、500umol／L)COCL2及不同培养时间(1d、2d、3d、4d、5d)对hUC

5、．MSCs活力及增殖影响，并取各浓度各时间点细胞上清通过ELISA方法检测VEGF、bFGF的水平，从而选取COCL2最适浓度。3选取P3代hUC．MSCs，予COCL2最适浓度进行培养，传代扩增，并再次通过流式细胞仪进行鉴定，比较COCL2干预前后各抗体阳性率的不同。并选取干预后P5代hUC．MSCs进行染色体鉴定，是否存在致癌性。4选取P3代hUC-MSCs，通过含有不同浓度葡萄糖(4mmol／L、8mmol／L、12mmol／L、16mmol／L、20mmol／L)的培养基进行培养，通过MTT法检测其对hUC-MSCs增

6、殖及活力的影响，选取最适最符合临床葡中文摘要萄糖浓度。5取生长状态良好的P2代脐静脉内皮细胞根据培养基不同分别进行培养，通过MTT绘制生长曲线，选取最适培养基进行培养。6取P3代hUC．MSCs进行氯化钴及高糖干预后，加入内皮细胞诱导培养液(DMEM／F12培养基、VEGFloug／L、bFGFloug／L、2％FBS)，倒置显微镜观察细胞形态。对诱导前后hUC．MSCs及脐静脉内皮细胞进行免疫组化检测内皮细胞表型CD31、VWF、苏木精一伊红染色进行形态学观察对比、细胞划痕试验检测细胞迁移能力、三维血管形成模型检测成血管性、

7、6一酮一前列腺素放免法检测细胞生物活性。结果：1利用组织块贴壁培养法从人脐带Wharton’sJelly中分离出的贴壁细胞及胶原酶消化法可分离出脐静脉内皮细胞，倒置显微镜下观察，脐带Wharton’sJelly组织块培养至5天左右，组织块周围爬出贴壁生长的梭形样细胞，培养至第12天左右，细胞融合达80％．90％；脐静脉经消化后于第二天隐约可见贴壁细胞，1周后出现明显贴壁细胞，多呈花瓣相互嵌合排列，于近2周细胞融合达80％左右。hUC-MSCs高表达与MSH相关的CDl05、CD29、CD44，低表达与造血干细胞相关的CDl4、

8、CD34、CD45，且随着传代次数增加，细胞表面标志物改变；脐静脉内皮细胞强表达CD31和VW。2经含不同浓度COCL2进行hUC．MSCs培养液培养后，细胞增殖与时间及缺氧程度呈正相关，且bFGF及VEGF基因水平与COCL2浓度呈“钟型”，细胞活性与COCL2浓度及时间呈