酶偶联法-光酶耦合法不对称合成l-叔亮氨酸的研究

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1、酶偶联法/光酶耦合法不对称合成L-叔亮氨酸的研究AsymmetricsynthesisofL-tertleucinebyenzymecoupledsystem/light-enzymecoupledsystem学科专业：制药工程作者姓名：王艺媛指导教师：宋浩教授天津大学化工学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材

2、料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日我是爱天大的！！学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要L-叔亮氨酸在不对

3、称合成、手性助剂和配体的合成中具有广泛的应用，此外，L-叔亮氨酸也可作为药物中间体，例如，抗艾滋病药物阿扎那韦，在医药上也具有广泛应用。化学合成L-叔亮氨酸具有光学纯度低，产量低，繁琐的合成步骤等缺点。随着合成生物学、基因工程、分子生物学等发展，生物法催化合成L-叔亮氨酸被广泛研究。采用亮氨酸脱氢酶催化三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸的方式，具有很好的工业前景。但是该反应的发生要添加一定量的辅酶NADH，而辅酶NADH价格昂贵，大量的添加辅酶NADH不利于节约生产成本，所以常常采用亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶偶联的方法，为反应

4、提供NADH。光催化再生NADH是一种新型的NADH再生系统，同时，由于光催化具有清洁、便宜等优点，近年来也逐渐发展起来。本文表达纯化出6种不同来源的亮氨酸脱氢酶和4种不同来源的甲酸脱氢酶，并分别以三甲基丙酮酸和甲酸铵为底物，测定其比酶活，筛选出活力最高的酶，分别为来源于Alteromonasmediterranea的亮氨酸脱氢酶(AmLeuDH，比酶活7.6U/mg)和来源于Ogataeaparapolymorpha的甲酸脱氢酶(Op-FDH，比酶活11.54U/mg)。并且对这两种酶在不同温度、pH和金属离子条件下

5、的催化活性进行了研究，优化出酶的最佳催化条件。同时，我们构建了双酶胞外偶联体系，并且对双酶体系的底物浓度比、NAD+添加量、两个酶活的配比进行优化。得到的最佳反应体系为：三甲基丙酮酸与甲酸铵浓度比为1:2，NAD+的添加量为1mM，AmLeuDH与Op-FDH的酶活比为1:2。在该最佳反应条件下，底物转化率能够达到95%。本文初步构建了光再生NADH偶联亮氨酸脱氢酶催化体系。该体系以C3N4作为NADH再生的光催化剂，研究了不同条件下的NADH再生效率。并进一步2+将其与亮氨酸脱氢酶耦合，探索了不同光照距离、酶添加量、

6、[Cp*Rh(bpy)(H2O)]量和NAD+量等条件对酶催化活性的影响，底物的最大转化率为35%。关键词：L-叔亮氨酸，亮氨酸脱氢酶，NADHI万方数据ABSTRACTL-tertiaryleucinehasawiderangeofapplicationsinasymmetricsynthesis,thesynthesisofchiralauxiliariesandligand，inaddition,L-tertiaryleucineisakeyintermediateinthesynthesisofmanydrug

7、s,suchasZeneca,Sandoz,Atazanaviretc.ChemicalsynthesisofL-tertiaryleucinehaddisadvantagesoflowopticalpurity,lowyield,complicatedsyntheticstepsetc.Withthedevelopmentofsyntheticbiology,geneticengineering,molecularbiology,biologicalcatalyticsynthesisofL-tertiaryleuc

8、inebegantogrow.Thewaythatusetrimethylpyruvicacidasthesubstrate,leucinedehydrogenasecatalyticsynthesisofL-tertiaryleucinehasgreatindustrialprospects.Thereactionneedsto