鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化防治作用及其机制的研究

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1、第三军医大学硕士学位论文鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化的防治作用及其机制研究摘要目的：肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程，是慢性肝病发展到肝硬化的必经病理阶段，防治肝纤维化是攻克肝硬化的突破口，从中医药中寻求有效的治疗方法具有重要意义。转化生长因子β（transforminggrowthfactorbeta，TGF-β）是一类调节细胞生长和分化的多肽，具有活化肝星型细胞（hepaticstellatecells，HSC），促进肝脏胶原基因表达，促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）合成等作用，是最重要的促肝

2、纤维化因子之一。采用四氯化碳（carbontetrachloride4，CCl4）诱导大鼠肝纤维化模型，观察鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化（hepaticfibrosis，HF）的防治作用及对TGF-β1、smad3和smad7蛋白及mRNA表达情况，探讨其抗肝纤维化分子机制。方法：1．肝纤维化模型制备：SD雄性大鼠90只，随机取10只作为正常对照组（A），其余大鼠用皮下注射40%四氯化碳（CCl4）橄榄油油剂0.3mL/100g诱导大鼠肝纤维化模型8周，于第2周时随机处死5只证实HF形成后随机分为肝纤维化模型组（B）、鳖甲煎改良方高剂量组（C）

3、28.4g/（kg•d）、中剂量组（D）14.2g/（kg•d）、低剂量组（E）7.1g/（kg•d）、复方鳖甲软肝片对照组（F）0.6g/（kg•d），每组15只。鳖甲煎改良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组给予1mL/（100g•d）相应药液灌胃治疗，A、B组同时给予等剂量的生理盐水灌胃处理。2．标本收集及处理：8周后各组大鼠在3%戊巴比妥钠以1ml/kg体重腹腔注射麻醉，经股动脉采血测定血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase，ALT）、天门冬氨酸转移酶（aspartateaminotransferase，

4、AST）、白蛋白（albumin）和球蛋白（globulin）含量；并取同一部位肝组织用10%中性福尔马林固定，24小时后逐级酒精脱水，二甲苯透明，包埋、切片，作HE（hematoxylin-eosin）染色观察肝纤维化程度变化并且运用免疫组化方法分析转化生长因子β1（transforminggrowthfactorbetaone，TGF-β1）、Smad3及Smad7表达；取肝右叶组织二块放入液氮罐中保存用以提取组织RNA及蛋白质。7第三军医大学硕士学位论文3．主要观测指标与方法：试验中每天观察大鼠一般情况并称重，应用EX7全自动生化测定仪

5、检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT），天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白、球蛋白含量；HE染色观察肝纤维化程度，reversetranscriptasepolymerasechainreaction（RT-PCR）检测其转化生长因子TGF-β1、受体Ⅰ、受体Ⅱ、Smad3及Smad7mRNA基因表达变化，免疫组织化学方法和Western-blot方法检测各组组织中TGF-β1、smad3和smad7蛋白表达。结果：1．8周后，成功复制大鼠肝纤维化模型，模型组肝纤维化形成明显，肝小叶结构破坏，肝组织中胶原纤维含量和沉积明显增加。与模型组比较，

6、鳖甲煎改良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组肝小叶结构破坏明显减轻，肝纤维化程度分级较模型组明显好转，胶原纤维所占面积显著缩小（23、24、24、26vs50）；模型组、鳖甲煎改良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组ALT和AST含量显著高于正常对照组（P<0.01）且模型组最高，显著高于其他各组（P<0.01），白蛋白含量则明显低于正常对照组（P<0.01），模型组更低于其他各组（P<0.01）；鳖甲煎改良方高、中、低剂量组间比较无统计学意义，但与复方鳖甲软肝片组比较有显著差异（P<0.01）；各组球蛋白含量比较均无显著性差异。2.RT-

7、PCR结果显示，正常组大鼠肝组织三种基因都有较低水平的表达，而模型组大鼠肝组织TGF-β1、Smad3mRNA表达显著增强，smad7表达明显减弱，与模型组比较，鳖甲煎改良方高、中、低剂量组与复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织TGF-β1、Smad3表达减少（TGF-β1：0.3230±0.0039、0.3275±0.0057、0.3232±0.0035、0.3665±0.0158vs0.8761±0.0140；Smad3：0.1027±0.0043、0.0935±0.0046、0.1025±0.0019、0.1257±0.0030vs0.8105±

8、0.0070），smad7表达明显增强（0.5100±0.0009、0.5099±0.0070、0.5093±0.0023、0.4979±0.0093vs0.116