益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用以及对肾组织nephrin mrna、podocin mrna表达的影响

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；．-IjL医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。!本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：簪簇荔导师签章：≮以、、7二级学院领导盖章：≯l3年弓月竭日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人己发表或撰写的研究-；．成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：饭：龋导师签章：I镌、’1弘7弓年弓月>7日 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用以及对肾组织NephrinmRNA、PodocinmRNA表达的影响前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8日IJ吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．15ja日；7f≮⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1)附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．34结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43综述Nephfin、Podocin与肾脏疾病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59 中文摘要益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用以及对肾组织NephrinmRNA、PodocinmRNA表达的影响摘要目的：本研究通过阳离子化牛血清白蛋白的方法建立膜性肾病大鼠模型，并应用益肾通络方对模型进行干预性治疗，通过观察大鼠的24小时尿蛋白定量、血清总蛋白、白蛋白、血脂、血肌酐、尿素氮等生化指标以及肾组织NephrinmRNA、PodoeinmRNA的表达，探讨益肾通络方对膜性肾病的治疗作用及其可能机制，从而为临床上治疗膜性肾病提供实验基础和理论依据。方法：选用清洁级健康雄性Wistar大鼠60只，普通饲料适应性喂养一周后留取大鼠尿液，测24小时尿蛋白定量均为正常。采用随机法将大鼠分为正常组15只，造模组45只。除正常组外，其余造模组大鼠预免疫一周后，隔日一次尾静脉注射C．BSA复制膜性肾病大鼠模型。连续注射4周后测24小时尿蛋白定量。确认造模成功后将造模组大鼠随机分为三组：模型组、盐酸贝那普利组及中药组。盐酸贝那普利组给予盐酸贝那普利10mg／kg／d灌胃，中药组予以益肾通络方3ml／d灌胃，正常组及模型组灌服相当量的生理盐水，各组共给药四周。给药结束后，禁食不禁水留取各组大鼠24小时尿液测定24小时尿蛋白定量，随后将大鼠处死，取血检测实验末血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素氮(B㈣、血肌酐(Scr)，留取肾组织，免疫荧光、光镜、电镜观察大鼠肾组织病理变化，Real．timePCR法检测NephrinmRNA、PodoeinmRNA在肾组织中的表达情况。结果：l实验大鼠的一般状况正常组大鼠饮食及尿量正常，眼睛有神，反应敏捷，肌肉丰满。造模的大鼠尾静脉注射C．BSA后，均出现明显的纳食少、精神萎靡，毛发脱落，少动抱团，部分大鼠出现腹水及阴囊水肿。实验最后一周，与正常组相比，造模各组大鼠明显体型瘦小，毛发脱落，模型组的症状最为显著。造模期间除正常组外，造模组有三只大鼠死亡，死亡原因估计为注射 ±查塑墨C．BSA后的过敏反应以及严重感染，最终导致脏器衰竭。224小时尿蛋白定量的比较24小时尿蛋白定量，在连续尾静脉注射C．BSA4周后，造模组与正常组比较显著升高俨<0．05)；给药4周后，盐酸贝那普利组及中药组与模型组相比明显降低俨<0．05)，而盐酸贝那普利组与中药组比较无明显差异pO．05)。3实验结束后各组大鼠血液生化指标的检测模型组、盐酸贝那普利组、中药组与正常组相比血清TP、ALB均明显降低而TC、TG均明显升高，有显著性差异伙0．05)；盐酸贝那普利组、中药组与模型组相比，血清TP、ALB均明显升高而TC、TG均明显降低，有显著性差异衅0．05)；中药组与盐酸贝那普利组相比差异性不明显，无统计学意义(胗O．05)；各组大鼠血清BUN、Scr比较，无统计学意义pO．05)；4肾组织病理形态学观察免疫荧光观察显示：正常组大鼠无明显变化；模型组大鼠可见kG、C3呈弥漫性的颗粒状沿肾小球毛细血管袢沉积；中药组与盐酸贝那普利组大鼠肾组织中IgG、C3呈颗粒状沿肾小球毛细血管袢呈现少量沉积。光镜下观察显示：正常组无明显异常改变，模型组可见肾小球毛细血管袢基底膜明显增厚，内皮细胞核显著增大，“钉突’’较大；盐酸贝那普利组及中药组毛细血管袢基底膜增厚较模型组减轻，内皮细胞核轻微增大，可见少量“钉突”形成。电镜下观察显示：正常组大鼠肾组织足细胞结构清楚，足突排列整齐；模型组可见肾小球毛细血管基底膜增厚明显，肾小球上皮下有大量类似电子致密物沉积，足突相互融合，可见钉突形成；中药组与盐酸贝那普利组大鼠肾小球毛细血管基底膜轻度增厚，肾小球上皮下有少量的电子致密物沉积，部分足细胞足突开始出现融合。5肾组织中NephrinmRNA、PodocinmRNA的表达情况统计学分析结果显示，与正常组相比，模型组NephrinmRNA、PodocinmRNA的表达明显降低，有显著性差异僻O．05)，与模型组相比，中药组与盐酸贝那普利组中NephrinmRNA、PodocinmRNA的表达有所升高，统计学差异显著职O．05)，两治疗组之间比较无明显差异pO．05)。 中文摘要结论：1益肾通络方可以明显降低膜性肾病大鼠的尿蛋白、提高血清白蛋白、改善血脂代谢。2益肾通络方能够抑制膜性肾病大鼠肾小球基底膜免疫复合物的沉积及基底膜的增厚，减轻肾脏病理损伤，延缓膜性肾病进一步发展。3益肾通络方能够上调膜性肾病大鼠肾组织NephrinmRNA、PodocinmRNA的表达，其治疗膜性肾病的作用可能与保护足细胞，维持足细胞裂孔膜结构和肾小球滤过功能的完整有关。关键词：益肾通络方；膜性肾病；NephrimPodocin；Real．timePCR 英文摘要TheprotectiveeffectofYishenTongluodecoctiononrenaltissueofratswithmembranousnephropathyandeffectinthe。ofalNephrinmRNAdPodocinmRNAexpressmnolrenalephrinandPodocinABSTRACTObjective：ThisresearchbuildsMembranousNephropathy(MN)modelofratsbyCationicBovineSerumAlbumin(C—BSA)，andappliesYishenTongluodecoctiontothemodelforinterventionaltreatment，thoughtheobservationofbiochemicalfactorsofrats(suchas24-hoururineprotein，serumtotalprotein，albumin，bloodfat，creatinine，ureanitrogenandSOon)andtheexpressionofrenalNephrin、Podocin，discussingtheeffectandprobablemechanismofYishenTongluodecoctiononMN，inordertoprovideexperimentalandtheoreticalbasisforclinicaltreatmentofMN．Methods：60healthymaleWistarratswererandomlydividedinto2groups，asfollows，normalgroup(NG)of15，modelgroup(MG)of45．ExceptNG，after1weekofthepre-immunizationthemodelgrouponceeveryotherdayinjectedC-BSAviacaudalveintocopyMNratsmodel．The24．hoururineproteinweretestedaftercontinuousinjectionfor4weeks．AfterconfirmingtheSUCCESSofmodeling，theratsofmodelgroupweredividedinto3groups，asfloolws，modelgroup(MG)，Benazepriltreatmentgroup(BG)，andYishenTongluodecoctiontreatmentgroup(TCMG)．TheratsofBGweregivenBenazeprilatadosageoflOmg／kg／dbygavageadministration．TheratsofZGweregivenYishenTongluodecoctionbygavageatadosageof3ml／d．TheratsofNGandMGwerefedthesamedoseofnormalsaline．Allofthe4groupscontinueddosingfor4weeks．Afterthat，24一hoururineand24一hoururineproteinofallratswhichwerekeepingabrosiaandfreelydrinkingwasdetermined．Andthen，puttingallratstodeath，serumtotalprotein(TP)，albumin(ALB)，totalcholesterol(TC)，triglyceride(TG)，ureanitrogen(BUN)，creatinine(Scr)wereassayed．Pathologicalchangesofrenaltissuesofratswereobservedbyimmunofluorescence，lightmicroscopyand4 英文摘要———————————————————————————————————————————————————一_一electronmicroscopy．TheexpressionofNephrinmRNAandPodocinmRNAintherenaltissuesweretestedbyReal．timePCR．Results：1Generalconditionofexperimentalrats111eratsofNGwerenormaldietandurinevolume，bri出eyes，promptresponse，andplumpmuscle．AfterinjectingC—BSAviacaudalvein，theratsofMGallshowedobviousanorexia，lassitude，baldness，andlessactivities．Someofthemappearedascitesandscrotaledema．ComparingwithNG．t11eother3groupsratsweredistinctlymuchthinner，smaller，andbaldnessinthelastweekofexperiment．neMGwasthemostobvious．Duringthemodeling．theratsofmodelgrouphadthreeratsdeath．ThecauseofdeathmightbeanaphylacticreactionofC-BSAandseriousinfection，whichledtoorganfailure．⋯⋯●●2tgomparlsonof24-hoururinaryproteinAfter4weeks’injectionofC·BSA，the24．hoururinaryproteinofMGwererisedobviousthantheseofNG(尸<0．05)；after4weeks’administration．24-hoururinaryproteinofBGandZGweredeclinedthanMG(P<0．05)，buttherewasnodifferencebetweenBGandZG(P>0．05)．3BloodbiochemicalindexComparedwithNG，t11eTPandALBweredeclinedmarkedly．andtheTCandTGwereincreasedsignificantlyinMG，BGandZG．Thereweresignificantdifferencesamongthem(P0．05)．BUNandScrofallgroupshadnostatisticalsignificance(胗0．05)．4PathomorphismofrenaltissuesT】resultof"9flu‘changesinheresultsorimmunofluorescence：Therehadnoevidentchan(,esinN一⋯G上DifmsegranularIgGandC3depositedalongglomerularcapillarywallinMG．ZGandBGshowedalittleIgGandC3deposition．Theresultsoflightmicroscopy：NGhavenoobviouslyabnormal————————————————————————————————————————————————一一一5 英文摘要changes．MGshowedthatthebasementmembraneofglomerularcapillaryloopshadthickenedevidently，theendothelialcellnucleusincreasedsignificantly，andretepegsbecamelarger．Comparingwithmodelgroup，thethickenedbasementmembraneofcapillaryloopsinBGandZGrelativelyrelieved，theendothelialcellnucleusincreasedslightly，asmallamountofretepegshadformed．Theresultsofelectronmicroscopy：TheratsofNGhadaclearstructureofpodocyteandalignedfootprocesses．MGshowedglomerularcapillarybasementmembranethickenedobviously，amountofsimilarelectron—densematerialdepositedundertheglomerularepithelium，footprocessesfused，andretepegsformed．TheglomerularcapillarybasementmembranethickenedslightlyinZGandBG．Therewerealittleelectron-densematerialdepositedundertheglomerularepithelium．Partofpodocytefootprocessesbegantofuse．5TheexpressionofrenalNeplwinmRNA、PodocinmRNAStatisticalanalysisshowed：comparedwithNG,NephrinmRNA、PodocinmRNAofMGhadalowlevelexpression，andhadsignificantdifferences(P<0．05)．ComparedwithMGtheexpressionofNephrinmRNA、PodocinmRNAofZGandBGmadesomethingincrease，andhadmarkedstatisticaldifferences衅0．05)．Therewerenoobviousdifferencesbetweenthetwotreatmentgroups咿0．05)．Conclusions：iYishenTongluodecoctionCandeclineurineprotein，increaseserumalbumin，improvebloodfatofMNrats．2YishenTongluodecoctioncaninhibitthedepositionofimmunecomplexinmembranousnephropathyglomerularbasementmembraneandthickeningofbasementmembraneofrats，relieverenalpathologicalinjury，anddelaythefurthergrogressofmembranousnephropathy．3YishenTongluodecoctioncanrevisetheexpressionofNephrinmRNA、PodocinmRNAinrenaltissueofmembranousnephropathyratsupwards．Thetherapeuticactionisprobablyrelativetoprotectingpodocyte，maintainingtheintegralityofpodocyteslitmembranestructureand6 英文摘要theglomerularfiltrationfunction．Keywords：YishenTongluodecoction；MembranousNephropathy；Nephrin；Podocin；Real—timePCR7 研究论文益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用以及对肾组织NephrinmRNA、PodocinmRNA表达的影响前言膜性肾病(membranonsnephropathy，M／'0为临床上常见的慢性肾小球疾病，本病以肾小球上皮细胞下弥漫性的免疫复合物沉积伴肾小球基底膜增厚以及“钉突”形成为主要病理特点。临床上大多数患者以肾病综合征起病，大约20％的患者表现为无症状的蛋白尿。目前膜性肾病的治疗主要以激素、免疫抑制剂等药物为主，这些药物虽然可以发挥作用，但其长期应用的治疗效果并不理想，并且存在着毒副作用大、不良反应多、停药后容易复发的缺点，经过大量的研究证实中医中药在膜性肾病的治疗中有一定的优势。膜性肾病是现代医学名词，在古代的医籍中并没有明确的记载，大体上可以归属于中医“水肿"、“尿浊”、“虚劳”等范畴，吾师檀金川教授根据多年的临床实践经验，认为“脾肾亏虚、肾络瘀阻”是贯穿本病始终的基本病机，并结合膜性肾病的发病特点和现代药理学研究，以健脾益肾、化瘀通络为基本治疗原则，创立了益肾通络方，为中医中药治疗膜性肾病开辟了新思路和新方法。本研究通过给大鼠注射阳离子化牛血清白蛋白的方法建立膜性肾病大鼠模型，并选用具有降低尿蛋白作用的ACEI类降压药盐酸贝那普利为对照，通过观察膜性肾病大鼠24小时尿蛋白定量、血清总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血肌酐、尿素氮等生化指标、肾脏病理形态学变化以及大鼠肾组织NephrinmRNA、PodocinmRNA的表达情况，来探讨研究益肾通络方对于膜性肾病大鼠的肾保护作用以及从足细胞裂孔膜蛋白分子的角度研究其作用机制，从而为临床上治疗原发性膜性肾病提供新的实验基础和理论支持。 研究论文材料与方法1实验材料1．1实验动物选用健康雄性Wistar大鼠60只，清洁级，体重为160-2009／只，(由河北医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证书编号为：1205030)。60只大鼠在实验前均予普通饲料适应性喂养一周。实验动物饲养环境：温度控制在25℃左右、湿度在70％左右。1．2主要实验试剂牛血清白蛋白第五组分(bovineserumalbuminfractionBSA．V)：美国Sigma公司。无水7,-胺(EDA)：阿法埃莎(天津)化学有限公司。碳化二亚胺(EDC)：美国sigma公司。弗氏不完全佐剂：美国Sigma公司。磷酸盐缓冲液(PBS)：上海双螺旋生物科技有限公司。总蛋白测定试剂盒(双缩脲终点法)：北京金豪制药有限公司。白蛋白试剂盒(溴甲酚绿法)：北京中生北控生物科技股份有限公司。总胆固醇试剂盒(酶比色法)：北京中生北控生物科技股份有限公司。甘油三脂试剂盒(酶比色法)：北京中生北控生物科技股份有限司。血肌酐、尿素氮测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。羊抗大鼠IgG：美国sigma公司。小鼠抗大鼠C3：美国SantaCruz公司。FITC标记抗山羊IgG；=jg京中杉金桥生物技术有限公司。FITC标记抗小鼠IgG：Jt京中杉金桥生物技术有限公司。Trizol试剂：Invitrogen公司RT试剂盒：美国Thermo公司real．timePCR试剂盒：大连TAKARA公司PCR引物：北京华大基因科技有限公司氯仿，乙醇，异戊醇等试剂为分析纯水合氯醛：天津市瑞金特化学品有限公司1．3主要实验仪器 研究论文电热恒温水浴箱：I-In．W21．600，天津太斯特仪器有限公司。透析袋：美国Fisherscientific公司。LGJ一10冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司。高速离心机：TDL．5．A，上海安亭科技仪器厂。全自动生化分析仪：Hitachi，7170A型，日本日立。尿蛋白(24h)分光光度计：712型，上海第三分析仪器厂。切片机：AS．325，英国姗顿公司。CX41光学显微镜：日本OLYMPUS。HPIAS，1000型全自动彩色病理图像分析系统：武汉千屏影像技术有限公司。电子天秤：FA2004，上海精科天秤厂。Sigma高速低温离心机Sigma3K30：SIGMA公司。JJ．1型定时电动搅拌器：江苏金埴国华仪器厂。HITACHl05PR．22低速离心机：HITACHI公司。超低温冰箱：日本三洋。LX．200迷你离心机：海门市其林贝尔仪器。QL．901漩涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂。恒温磁力加热搅拌器(85．2)：江苏荣华仪器制造有限公司。PCRPX2ThermalCycler：美国Thermo公司。real-timePCR仪：Gene公司Rotor-Gene3000。ND．1000核酸定量仪：美国Thermo公司。凝胶成像分析系统：南京捷达公司。制冰机：SANYO公司。SZ．93型自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂。高温灭菌器：SANYO公司。1．4实验药物西药对照组(盐酸贝那普利组)：盐酸贝那普利(Benazeprilhydrochloride)(={L京诺华制药有限公司生产，批号：X1902)。中药组：益肾通络方，由黄芪、当归、党参、绞股蓝、炒白术、莪术、仙灵脾、地龙、水蛭组成。(以上药物由河北省中医院制剂室提供。)2实验方法 研究论文2．1实验动物分组60只雄性Wistar大鼠适应性喂养一周后，测其24小时尿蛋白定量均在正常范围。然后采用完全随机法选取15只作为正常组大鼠，45只为造模组。造模组大鼠用于膜性肾病大鼠模型的制备。确认造模成功后，将造模组大鼠随机分为三组：模型组、盐酸贝那普利组及中药组。2．2阳离子化牛血清白蛋白的制备方法参照改良Border法【l】，将67ml的EDA与500ml双蒸水混合，然后用6N盐酸350ml将其PH值调整为4．75，并将上述溶液放置于冰水浴中使其温度降低至25。C。随后，将59牛血清白蛋白溶于25rIll双蒸水中并加入到EDA溶液中。然后加入1．89EDC并均匀搅拌，使反应在恒温于25℃和PH值为4．75的条件下进行。上述反应持续120分钟后加入30ml4MPH值为4．75的醋酸盐缓冲液以终止反应。最后，将上述溶液在4。C的双蒸水中连续透析72小时后在真空冷冻干燥机内干燥成粉末状，装入袋中备用，即制成C．BSA。将制备好的C．BSA密封保存于．70℃冰箱内。2．3膜性肾病大鼠模型的建立【2】将lmgC—BSA加入到O．5mlPBS(PH为7．4)中配制成溶液，然后与同等量的弗氏不完全佐剂混匀使其充分乳化。除正常组外，造模组大鼠的背部、双侧腹股沟及腋下作多点皮下注射进行预免疫(隔日一次)，一周三次。预免疫1周后，开始正式免疫，即每只大鼠隔日一次尾静脉注射C—BSA16mg／kg／d(注射前用lmlPBS配成溶液)，每周注射3次，连续注射4周。2．4给药方法盐酸贝那普利组：将盐酸贝那普利片研磨成细粉，按10mg／kg／d给药，用3ml的蒸馏水配成混悬液，每日灌胃一次，共给药4周。中药组：将益肾通络方各药物经水浸泡后浓煎，浓煎后的原液每毫升含生药2．09，按20．09／kg／d给药，3ml／只，每日灌胃一次，连续4周。正常组：给予生理盐水灌胃，3ml／只，每日一次，连续4周。模型组：给予生理盐水灌胃，3ml／只，每日一次，连续4周。3指标的留取与检测方法3．1观察指标的留取实验各组大鼠分别于造模前，造模后以及药物干预4周后放入代谢笼中，留取24小时尿液并记录尿量，离心后取上清液，测24小时尿蛋 研究论文白定量。给药4周后，用10％的水合氯醛按照0．3ml／1009的剂量腹腔注射麻醉大鼠，开腹，腹主动脉取血，离心10分钟后分离出血清，测血清生化指标。迅速摘取双肾，留取相应肾组织标本进行免疫荧光、光镜、电镜的观察以及Real．timePCR的检测。3．2各指标的检测方法3．2．1各组大鼠一般状态的观察观察各组大鼠精神状态、反应情况、饮食及尿量情况、毛发等。3．2．2尿蛋白定量及生化指标的检测24小时尿蛋白定量采用双缩脲法测定；留取好的血清标本用7170A型全自动生化分析仪测定血清总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血肌酐以及尿素氮。3．2．3间接免疫荧光法检测lgG和补体C3取新鲜肾皮质组织，在冰上制成切片后经冷丙酮固定5至10分钟，晾干；然后用0．01MPBS(pH7．4)漂洗3次，每次5分钟；滴加1滴(5rtl)一抗(1：50)，置湿盒内于37℃孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟；滴加l滴(5肚1)FITC标记二抗(1：50)，置湿盒内于37。C孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟；甘油磷酸缓冲液封片，根据显微镜下荧光强度评级观察标本的荧光强度，一般用“+”表示。其中，(一)为无荧光；(+)为极弱的可疑荧光；(++)为荧光较弱，但清楚可见；(+++)为荧光明亮；(+卅)为荧光闪亮；拍照记录。3．2．4光镜标本制备．处死大鼠留取部分肾组织，10％的多聚甲醛溶液固定，酒精梯度逐级脱水，石蜡包埋制成2}trn的切片，行HE、PAS、Masson染色，观察肾小球及肾间质的变化情况，并拍照记录。3．2．5电镜观察取大鼠的肾皮质用4％戊二醛固定液固定2~4小时以上，然后再用1％四氧化锇固定l～2小时，梯度丙酮逐级脱水，包埋，聚合，切片，醋酸双氧铀与柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察肾小球基底膜、足突的改变情况，并照相记录。3．2．6Real．timePCR法检测肾组织nephrinmRNA、podocinmRNA的表达 研究论文3．2．6．1提取RNA采用Trizol法提取RNA：每50—100mg组织加入lmlTrizol，静置5min，冰浴匀浆。然后加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，静置3min，4℃12000ffl5min离心，吸取上层液，移至另一EP管中。每个EP管中加入500ul的异丙醇，颠倒混匀15s后静置10min。4℃12000r／10min后弃上层液体，留RNA沉淀。然后每管加入lml的75％乙醇(DEPC水配制，临配临用)，将RNA沉淀弹起，清洗RNA沉淀，7500r／5min。然后，弃75％乙醇，留RNA沉淀，用适量DEPC水溶解。最后进行组织RNA的鉴定和定量。3．2．6．2RNA鉴定(1)取1“l的RNA溶液并加入2ulRNA—buffer混匀，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察RNA的纯度和完整性。若可见18S及28S条带完整、清晰，28S带的宽度及亮度是18S的2倍，则表明RNA是完整的没有降解。(2)取2“lRNA溶液，用NanoDropND．1000紫J'b／可见光光度计进行定量，测定RNA的浓度，测定OD260／280比值在1．8．2．O的范围内。3．2．6．3反转录反应(1)反转录反应体系(101．t1)5xPrimeScriptTMBUffer21APrimeScriptTMRTEnzymeMix10．5uJ随机引物(O．2蚓斗1)O．5p1总RNA0．599DEPC水至10LLl终浓度lxbuffer0．01gmol／肚l50ng／lLd(2)反转录反应过程将上述成分加入到0．2ml的EP管中，混匀，37。C／15min，85℃／5s，然后将其放置于冰水浴中冷却，得到cDNA，一20。C保存，备用。3．2．6．4Real．timePCR反应 研究论文PCR反应体系(20“1)体积终浓度59℃20s卜40cycles72℃20Sj95℃5S159℃20s产40cycles72℃20SJ95℃5s’172℃20SI／以为13-actin内参，采reACt(ACt目的．ACt内参)法进行相对定量分析，以2-ACt作为目的RNA的相对表达量。分析NephrinmRNA以及Podocin14 研究论文行两两组间的多重比较，P<0．05为有统计学意义。结果1大鼠一般状况的观察进入造模阶段后，除正常组外，造模组大鼠出现精神萎靡，体形消瘦，食少抱团，便溏，毛发欠光泽，甚至出现毛发脱落，尿量增多，部分大鼠出现腹部胀大及阴囊水肿。尾静脉注射C．BSA后，部分大鼠出现尾巴溃烂坏疽。造模期间，共有三只大鼠死亡，推测其死亡原因可能为预免疫期间因过敏而死亡，反复尾静脉注射导致大鼠尾巴溃烂进而严重感染而死亡。给药4周后，各治疗组大鼠与模型组比较精神状态、饮食量、尿量、毛发脱落、水肿等一般情况明显有所好转，而模型组大鼠未见明显改善。224小时尿蛋白定量的检测结果(见Fig．1、Tablel)尾静脉注射C．BSA4周后，除正常组外，造模组出现明显的蛋白尿，留取24小时尿蛋白定量结果提示造模成功。给药4周后，模型组24小时尿蛋白定量较之前相比有所上升，且与盐酸贝那普利组及中药组相比，有明显差异(PO．05)。5血清BUN、Scr的检测结果(，见Fig．4、Table4)给药4周后，模型组、盐酸贝那普利组、中药组与正常组相比，无明 研究论文显差异f尸>O．05)；盐酸贝那普利组和中药组与模型组之间比较，无明显差异胗0．05)。6肾组织病理形态学观察结果免疫荧光观察：正常组荧光强度(一)，无明显的免疫复合物沉积的改变；模型组、盐酸贝那普利组及中药组免疫荧光均可见lgG和C3呈现为颗粒状沿着毛细血管袢及系膜区呈弥漫性沉积，其中模型组荧光强度较其他组最为明显，约为(+++一++++)；而盐酸贝那普利组和中药组的荧光强度约为(+．++)，IgG和C3较模型组沉积明显减少。(见Fig．6～。9)光镜观察：正常组大鼠肾组织结构无明显的异常病变；模型组大鼠可见肾小球体积明显增大，毛细血管内皮细胞核显著增大，肾小球毛细血管袢基膜弥漫性增厚，上皮侧大量的“钉突”形成；盐酸贝那普利组及中药组肾小球毛细血管内皮细胞核轻微增大，肾小球毛细血管袢基膜增厚较模型组减轻，可见少量“钉突”形成。(见Fig．10"--'21)电镜观察：正常组大鼠足细胞结构清楚，未见明显异常；模型组大鼠可见肾小球基底膜增厚，基膜间隙增宽，上皮下可见大量电子致密物沉积，上皮细胞足突出现广泛融合或消失，并可见钉突形成；盐酸贝那普利组及中药组基底膜轻度增厚且不规则，上皮下电子致密物呈少量沉积，部分足突出现融合。(见Fig．22"--'25)7大鼠肾组织NephrinmRNA、PodocinmRNA表达情况的比较：(见Fig．5、Table5)7．1NephrinmRNA的表达情况与正常组相比，模型组、盐酸贝那普利组、中药组大鼠肾组织中NephrinmRNA的表达降低，统计学有显著性差异伙0．05)。与模型组相比，盐酸贝那普利组及中药组大鼠肾组织中NephrinmRNA的表达升高，有显著性差异俨O．05)。此结果提示益肾通络方和盐酸贝那普利能够起到上调膜性肾病大鼠肾组织中PodocinmRNA的作用。 研究论文附图Fig．1Thechangesof24hurineproteininfourgroups(X±S)Fig．21PandALBofbloodserminfourgroups(X±S) 研究论文Fig．3TCandTGofbloodserminfourgroups(X±S)Fig．4ComparisonofBUNandScrinfourgroups(X±S) 研究论文Fig．5TheexpressionofNephrinmRNAandPodocinmRNAineachgrouprats(X±S、)Fig．6Normalgroup(IMFx400)20 研究论文Fig．7Modelgroup(IMFx400)Fig．8Benazeprilgroup(IMFx400)21 研究论文Fig．9TraditionalChineseMedicinegroup(IMFx400)Fig．10Normalgroup(HE染色x400) 研究论文Fig．11Modelgroup(HE染色x400)Fig．12Benazeprilgroup(HE染色x400) 研究论文Fig．13TraditionalChineseMedicinegroup(HE染色x400)Fig．14Normalgroup(PAS染色x400)24 研究论文Fig．17TraditionalChineseMedicinegroup(PAS染色×400)Fig．18Normalgroup(MASSON染色X400) 研究论文Fig．19Modelgroup(MSSON染色×400)Fig．20Benazeprilgroup(MASSON染色X400) 研究论文Fig．21TraditionalChineseMedicinegroup(MASSON染色×400)Fig．22Normalgroup(mesangialregionx20000) 研究论文Fig．23Modelgroup(mesangialregionx20000)Fig．24Benazeprilgroup(mesangialregionx20000)29 研究论文Fig．25TraditionalChineseMedicinegroup(mesangialregionx20000)30 研究论文附表Table1Thechangesof24htlrineproteininfourgroups(X一+S)Note：MG、BG、TCMGVSNG：△P<0．05BG、TCMGVSMG：+P<0．05AftermodelVSbeformodel：▲P《0．05AftertreatmentVSbefortreatment：·P<0．05TCMGVSBG：撑P>0．05Table2ComparisonofbloodsermTPandALB(X±S)Note：MG、BG、TCMGVSNG：△P<0．05BG、TCMGVSMG：伙O．05TCMGVSBG：群P>0．053l 研究论文Table3ComparisonofbloodsermTCandTG(X±S)Note：MG、BG、TCMGVSNG：△尸<0．05BG、TCMGVSMG：+氏O．05TCMGVSBG：群P>0．05Table4ComparisonofbloodsermBUNandScr(X±S)Note：MG，BG、TCMGVSNG：e胗0．05BG、TCMG、VSMG：*t9>0．0532 研究论文Table5TheexpressionofNephrinmRNA、PodocinmRNA(X+S)GroupNNephrinPodocinNGMGBG6O．0804±0．1350O．0687+0．021560．0114"-_0．0023△0．0201±O．0027△60．0263_0．0114∥0．0345+0．0046△4TCMG60．0273_0．0135△牲0．0372---0．0058△奉撑_——————————————————————————————————————————————————————————一Note：MG、BG、TCMGVSNG：≈)<0．05BG、TCMGVSMG：+PO．05)。这种实验结果说明，益肾通络方能起到降低膜性肾病大鼠24小时尿蛋白定量的作用，其疗效与盐酸贝那普利相当。分析其作用机理，大量蛋白尿为机体水谷精微物质的流失，归因于“虚损”的范畴，这可能与益肾通络方中健脾益肾药物在免疫调节方面起到的作用有关，并可能通过改善肾小球滤过膜的通透性，来达到减少蛋白尿的目的。4．1．2升高血清白蛋白及总蛋白，减轻水肿膜性肾病的病人大约80％伴有不同程度的低蛋白血症，并出现水肿的症状。给予药物干预治疗后的大鼠与模型组大鼠相比一般状况得到改善，腹水以及阴囊水肿有所减轻。实验末血清TP、ALB检测结果显示：模型组、盐酸贝那普利组、中药组与正常组相比血清TP、ALB均明显降低，有显著性差异(氏O．05)；中药组、盐酸贝那普利组与模型组相比，血清TP、ALB均明显升高，有显著性差异(尸