apoe亚型特异性影响继发性神经细胞损伤实验的研究

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1、重庆医科大学博士研究生学位论文英汉缩略语名词对英文缩写英文全称apoEAPOETBICNSNSCsKrIDADEGFPbFGFEGFFCSGal．CGFAPDIVmg肛g“lSeCmlnhdWrpmapolipoproteinEapolipoproteinEgenetraumaticbraininjurycentralnervoussystemneuralstemcellsdelayedrectifierK+channeldelayedrectifierK+currentalzheimefsdiseaseenhancedgre

2、enfluorescentprotein昭Jt’、中文名称载脂蛋白E载脂蛋白E基因创伤性脑损伤中枢神经系统神经干细胞延迟整流钾通道延迟整流钾电流阿尔茨海默病增强型绿色荧光蛋白basicfibroblastgrowthfactor碱性成纤维细胞生长因子epidermalgrowthfactor表皮细胞生长因子fetalcalfserum胎牛血清galactocerebroside半乳糖脑苷脂glialfibrillaryacidicprotein胶质纤维酸性蛋白daysinvitromilligrammlcrogrammicro

3、litersecondminutehourdayweekrevolutionsperminute体外培养时间毫克微克微升秒钟分钟小时天周每分钟转数重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一

4、切相关责任．学位论文作者签名：主三i盔日期：．二∞g．々．二l学位论文版权使用授权书本入完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期问论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学．学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文．论文作者签名：童兰至缩指导教师签名：圣螋日重庆医科大学博士研究生学位论文APOE亚型特异性影响

5、继发性神经细胞损伤的实验研究摘要创伤性脑损伤(traumaticbraininjury,TBI)是神经外科最常见的一种疾病，其死亡率、致残率居各类创伤之首。脑伤后以细胞凋亡为主要特征的继发性脑损伤是影响伤情转归的主要因素。载脂蛋白E基因(apolipoproteinE，APOE)主要有￡2、￡3、￡4三个等位基因，我们前期工作和国外研究显示，携带￡4的患者对脑损伤的耐受性降低，更易出现伤情加重及不良预后。但是，APOE影响脑损伤病情转归的机制尚未阐明。Ca2+超载是细胞死亡的“最终共同通路”，Caz+超载实质是细胞内外离子失衡

6、的结果。K+是维持细胞内离子环境最主要的阳离子，目前认为钾通道也是细胞凋亡的重要环节之一。本课题以APOE亚型特异性与延迟整流钾通道的关系作为切入点，构建人源性￡2、￡3、￡4的真核表达载体，分别转染APOE敲除鼠胚神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)，筛选稳定表达细胞株，建立神经元／胶质细胞共培养划痕损伤模型，采用流式细胞技术及膜片钳技术分析伤后APOE亚型特异性与细胞早期凋亡、延迟整流钾通道的关系，探讨APOE影响继发性神经细胞损伤的作用机制。一、人源性APOE基因真核细胞表达载体的构建和鉴定人源胎脑组织

7、中提取TotalRNA后，设计引物调取APOEe3基因项目资助：重庆市教委科学技术研究项目(编号：040311)：重庆市卫生局重点科研课题资助项目(编号：05．1．017)：重庆市科委自然科学基金项目(编号：2007BB5299)；重庆医科大学优秀博上学位论文资助项目。2重庆医科大学博士研究生学位论文CDS区域，克隆至pMDl9一Tsimple载体中并测序验证，采用定点突变技术，得到APOE￡2及APOEe4的重组突变体载体。EcoRI／BamHI双酶切切下编码APOE的片段，插入真核表达载体pEGFP—N1。对重组质粒进行双

8、酶切、PCR和测序验证后，采用阳离子脂质体Lipofectamine2000将重组质粒转染至真核细胞(293．T细胞)中，用荧光显微镜观察基因在239一T细胞中的表达情况。结果：双酶切、PCR和质粒测序结果证明APOE各等位基因正确地克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，并能