脂肪间充质干细胞pd-l1基因沉默对大鼠肝移植急性排斥反应影响

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1、华中科技大学硕士学位论文脂肪间充质干细胞PD-L1基因沉默对大鼠肝移植∗急性排斥反应的影响华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆外科硕士研究生杨青峰导师万赤丹教授摘要目的：构建PD-L1基因RNA干扰慢病毒表达载体，稳定转染脂肪间充质干细胞（ADSCs）实现PD-L1基因沉默；研究肝移植术前输注PD-L1基因沉默ADSCs对大鼠肝移植急性排斥反应的影响及机制。方法：设计针对PD-L1的shRNA序列,应用基因重组技术插入到pFU-GW-iRNA慢病毒表达载体，重组病毒质粒及其3种辅助包装原件载体质粒通过共转染293T细胞，

2、包装产生的病毒感染ADSCs；利用两套管吻合技术行SD大鼠对Wistar大鼠异种原位肝移植模型，将受体Wistar大鼠随机分为4组，每组10只：对照组（A组），供体组（B组），第三方组（C组），第三方转染组（D组），行肝移植前7天，对照组输注71mlPBS，实验组分别输注1ml含有1×10个供体SD大鼠ADSCs、第三方SD大鼠ADSCs和第三方SD大鼠PD-L1基因RNA干扰ADSCs的PBS。术后7天处死大鼠，观察各组肝功能情况，IL-2和IL-10水平，肝脏病理变化，TUNEL检测细胞凋亡，Westernblot检测

3、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果：通过测序证实PD-L1干扰序列正确插入pFU-GW-iRNA载体,成功构建PD-L18基因RNAi慢病毒表达载体，病毒滴度为5×10TU/ml，在转染后48h，即可在荧光显微镜下见明亮的绿色荧光，最佳感染复数（MOI）为20；与A组相比，其它各组大鼠术后血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素和白介素2水平明显降低（P<0.05），D组高于C组；白介素10明显升高（P<0.05），D组低于C组；HE染色显示，A组大鼠肝组织呈急性重度排斥反应，B组、C组大鼠肝组织呈急性轻度排斥反应，D组大鼠肝

4、组织呈急性中度排斥反应；TUNEL染色显示A组大鼠的肝脏组织切片上凋亡∗本课题受国家自然科学基金资助(NO.30772053)1华中科技大学硕士学位论文细胞大量存在，而B组和C组相对较少，D组可见较多凋亡细胞。Westernblot结果显示：A组Bcl-2蛋白低表达，B组和C组表达较高，D组表达低于C组；A组Bax蛋白高表达，B组和C组表达较低，D组表达高于C组。结论：PD-L1基因RNAi慢病毒表达载体构建成功，ADSCsPD-L1基因敲减成功，术前输注PD-L1基因沉默的ADSCs对异基因大鼠肝脏移植引起的急性排斥反应

5、抑制作用减弱，PD-1/PD-L1通路是ADSCs下调免疫反应的一个重要通路。关键词：脂肪间充质干细胞；慢病毒载体；PD-L1；肝移植；急性排斥反应2华中科技大学硕士学位论文EffectsofPD-L1genesilencinginadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellsonacuterejectioninratlivertransplantationDepartmentofHepatobiliarySurgery,UnionHospital,TongjiMedicalColleg

6、e,HuazhongUniversityofScience&TechnologyM.Candidate:YangQingfengSupervisor:Prof.WanChidanAbstractObjective:ToconstructalentiviralvectorforRNAinterference(RNAi)ofthePD-L1gene,andtosilencePD-L1geneofadiposetissue-derivedmesenchymalstemcells(ADSCs);Tostudytheeffectan

7、dmechanismofpreoperativeinfusionofadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellsofPD-L1genesilencingonacuterejectioninratlivertransplantation.Methods:ApairofcomplementarysmallhairpinRNA(shRNA)oligonucleotidestargetingthePD-L1geneweredesignedandinsertedintothelinearized

8、pFU-GW-iRNAvectorusinggenerecombinationtechnology.Therecombinantplasmidandalentiviruspackagingmixwereco-transfectedinto293Tcellstoobtainpackagedlentivir