糖原磷酸化酶表达模式改变和肝癌生物学行为关系的研究

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1、糖原磷酸化酶表达模式改变与肝癌生物学行为关系研究摘要一、糖原磷酸化酶表达模式改变与肝癌生物学行为关系研究研究背景和目的肝癌（LiverCancer）是我国最常见的高发肿瘤之一，其发生发展是由体内多基因多蛋白参与、多步骤协同的复杂过程。临床上我们经常发现同一病理类型、同一分期、采用相同治疗方案的肝癌患者预后完全不同。这种预后差异，与肝癌的分子生物学行为密切相关。传统的肝癌病理诊断、分类、分型方法不能从分子水平反映其生物学行为，无法对肝癌的分子生物学行为做出准确的预测。因此，寻找能够反映肝癌分子生物学特性的标志物，并对其进行功能研究是肝癌研究的重

2、要方向之一。糖原磷酸化酶（Glycogenphosphorylase,GP）是糖原代谢过程中的限速酶，使糖原分解释放出1-磷酸葡萄糖（Glucose-1-phosphate，G-1-P）。GP主要分为三种亚型即肌型(Muscle-typeGP,PYGM)、肝型(Liver-typeGP,PYGL)与脑型(Brain-typeGP,PYGB)。其中PYGL主要位于成人的肝脏，维持血糖稳定；PYGB主要表达于成人大脑及低水平表达于胎肝，为人体应急时提供能量。研究显示，PYGB在肺腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中表达升高，其在鼠肝癌细胞系中表达明显增高，取

3、代PYGL成为主要的糖原磷酸化酶表达亚型，但在正常的肝脏表达极低或不表达。其在人肝癌中的表达未见报道。同时，这种糖原磷酸化酶表达模式的转变，即PYGL向PYGB的转变，是否意味着肝癌具有更加恶性的生物学行为（增殖快、分化低、侵袭性强），至今未见报道。本研究通过研究肝癌中PYGB及PYGL的表达情况及其相关功能，并结合相关临床资料分析其表达与肝癌发生发展的关系，为寻找反映肝癌分子生物学特性的标志物提供了实验和理论依据。研究方法（一）研究PYGL及PYGB在肝细胞癌中的表达情况及其相关功能。1．运用Real-timePCR及Westernblot

4、检测PYGB及PYGLmRNA及蛋白在肝-1-第二军医大学博士学位论文癌细胞中的表达。2．运用RT-PCR、Westernblot、免疫组化技术检测临床HCC组织标本PYGB、PYGL表达情况。3．统计分析实验结果和临床病理资料，明确PYGB或PYGL表达模式改变与肝癌患者预后关系。4．构建PYGL或PYGB过表达质粒，建立PYGL或PYGB稳定细胞系。5．研究PYGL或PYGB表达对肝癌细胞增殖能力、侵袭能力的影响。6．观察PYGL或PYGB表达对肝癌细胞对抗外界刺激能力（缺血缺氧、H2O2）的影响。（二）研究PYGL及PYGB在肝内胆管细

5、胞癌中的表达情况及其与临床预后的关系。1．运用RT-PCR、免疫组化技术检测临床ICC组织标本PYGB、PYGL表达情况。2．统计分析实验结果和临床病理资料，明确PYGB或PYGL表达模式改变与ICC患者预后关系。结果（一）PYGL及PYGB在肝细胞癌中的表达及其相关功能研究。1.PYGB基因转录水平与蛋白表达水平与肝癌细胞系的恶性程度密切相关，接近正常的肝癌细胞系以及低度恶性肝癌细胞系表达水平较低，在高度恶性的肝癌细胞系表达水平明显升高。2.PYGL基因转录水平与蛋白表达水平与肝癌细胞系恶性程度密切相关，在中度恶性肝癌细胞系表达增高，但在高

6、度恶性的肝癌细胞系表达明显降低或缺失。3.PYGB与PYGL基因mRNA比值及蛋白比值与肝癌细胞系的恶性程度密切相关，随肿瘤恶性程度增强，比值增大。4.PYGB与PYGL基因mRNA比值与肝细胞癌患者BCLC分期呈正相关。5.在HCC样本中，PYGL在癌旁组织中均为强阳性，而癌组织则存在不同程度的高低表达。PYGB也主要表达于癌旁组织中，而癌组织表达则要低于癌旁。-2-糖原磷酸化酶表达模式改变与肝癌生物学行为关系研究PYGB高表达的患者生存期和无瘤生成期均较短。6.构建了表达PYGL和PYGB的质粒，并分别构建和鉴定了Hep1-6和NIH3T

7、3高低表达的稳定细胞系。7.过表达PYGB后细胞增殖、克隆形成及迁移能力明显增强。8.过表达PYGB后细胞抗氧化应激能力增强，相反上调PYGL表达，肝癌细胞抗氧化应激能力减弱。（二）PYGL及PYGB在肝内胆管细胞癌中的表达情况及其与临床预后的关系1.与正常胆管组织相比，PYGB的mRNA在ICC的表达水平明显增高，而PYGL的mRNA表达水平则明显降低。2.PYGBmRNA表达与γ-GT值负相关；而PYGLmRNA的表达与AFP呈正相关。3.免疫组化检测发现，PYGB表达相对较低的更容易发生淋巴结转移，并且预后相对较差，且PYGB低表达是O

8、S的独立风险因素。结论1.在肝细胞癌中，PYGB、PYGL的表达模式，与肝癌细胞系的恶性程度密切相关。PYGB或PYGB与PYGL比值与患者预后密切相关，尤其是后者