黄羽扇豆怀特酮对SH-SY5Y细胞的防癌抗癌作用机制研究

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1、学号：12212112常州大学硕士学位论文黄羽扇豆怀特酮对SH-SY5Y细胞的防癌抗癌作用机制研究研究生杨洁任杰指导教师胡昆学科、专业名称生物化工研究方向药理学2015年4月TheCancerPreventiveandAnticancerActivityofLupiwighteoneonSH-SY5YcellsADissertationSubmittedtoChangzhouUniversityByJieYangBiologicalChemicalDissertationSupervisor:RenJieHuKunApril，2015II中文摘要黄羽扇豆怀特酮(以下简称Lup)是

2、一种具抗肿瘤活性的天然产物，属于异黄酮类化合物。目前经研究证实了异黄酮类物质具有抗癌抗氧化方面的活性。但关于Lup的药理效应和活性机制很少报道。本论文对本实验室合成Lup主要通过以细胞凋亡途径探究抗癌机制和以Nrf2为靶点研究抗氧化、防癌机制。研究其是否为疗效好，毒副作用低的防癌抗癌活性化合物。PI3K/Akt途径探究抗癌机制：利用MTT法检测Lup对SH-SY5Y、Vero和HUVEC细胞的毒活性，并研究Lup作用于SH-SY5Y细胞24、48和72小时后的增殖抑制率，结果表明，Lup表现出较高的细胞增殖抑制活性且呈现一定的时间和浓度依赖性。进一步的研究发现不同浓度的化合物Lu

3、p处理SH-SY5Y细胞，经DAPI染色，利用流式细胞术(FCM)定量结果表明Lup能够使SH-SY5Y细胞生长停留在G2/M期且Westernblot印迹法检测到相关周期蛋白CyclinB1/D1和周期蛋白依赖性激酶CDK1/2/4/6的表达也下调。Lup处理后的细胞经AnnexinⅤ-FITC/PI荧光双染后通过FCM分析凋亡情况，发现Lup可诱导发生凋亡。在显微镜下拍照分析经Hoechst33258处理的形态变化，发现Lup处理的SH-SY5Y细胞染色质皱缩，且出现凋亡的典型特征凋亡小体。同时westernblot结果表明Lup可诱导SH-SY5Y细胞的PI3K/Akt途径

4、中相关凋亡蛋白表达发生变化，Lup能使p-Akt、Bcl-2、procaspase9、PARP-1的表达水平下降，上调Bax、cytochromec、cleavedcaspase-9、cleavedcaspase-3、cleavedPARP-1蛋白的表达。此外，凋亡出现的时候常常会伴随着线粒体膜电位(ΔΨm)崩溃及其内部ROS的增加，FCM分析检测到经Rhodamine123染色Lup可以引起ΔΨm的缺失和利用DCFH-DA探针发现其能增加细胞内ROS的生产。Nrf2为靶点探究防癌机制：核转录因子Nrf2介导的抗氧化信号通路在预防癌症上是关键的靶向基因。利用Westernblot

5、检测不同浓度的化合物Lup处理细胞后，SH-SY5Y细胞中的Nrf2与Keap1蛋白表达的变化，以及对细胞核中的Nrf2蛋白表达影响，发现Lup能使Keap1蛋白的表达降低，增加全细胞和核内Nrf2蛋白的表达。通过免疫荧光实验检测Lup对Nrf2基因从胞浆到胞核迁移的作用，结果显示随着给药浓度的增加Nrf2向核内迁移的数量增多。随后通过ARE-GFP报告因子检测试剂盒检测ARE活性发现随着化合物Lup浓度的增加，荧光强度逐渐增加，说明IIILup可激活Nrf2且呈现剂量依赖性。关键词：黄羽扇豆怀特酮；细胞周期；PI3K/Akt；Nrf2IVABSTRACTLupiwighteon

6、e(Lup)belongstonaturalisoflavone.Presentstudiesconfirmedisoflavonesexhibitedanticancerandcancerpreventiveactivities.ButLupwererarelyreportedinthestudyofpharmacologyincellswithanticancereffects.Thispapermainlythroughapoptosispathwaytoexploretheanticancermechanismandantioxidantmechanismwhichtar

7、getonNrf2ofLupsynthesizedbyourlab.ResearchwhetherLupisamorepotentcompoundwithmuchlowercytotoxicity.ThecompoundLupinducedapoptosisinSH-SY5YcellsviaPI3K/Aktsignalingpathwaywereinvestigated.TheantitumoractivitiesofLupweredetectedinvitrobyMTTmeth