htert-逆转录病毒载体构建及其介导脐血间充质干细胞基因转移的研究

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1、郑州大学2005年硕士学位论文hTERT．逆转录病毒载体构建及其介导的脐血问充质干细胞基因转移研究hTERT．逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间充质干细胞基因转移研究研究生刘瑞敏导师邢莹郑州大学医学院生理学教研室郑州450052摘要间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是指一群具有向成骨细胞、成脂肪细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞。MSCs不仅存在于骨髓，也存在于脐血和外周血中。与骨髓相比，脐血来源更为充足，免疫原性更弱，能耐受更大程度的HLA配型不

2、符。但是脐血中的间充质干细胞含量较低，扩增困难，对于临床的应用是很大的阻碍。因此我们试图在脐血原代培养和纯化的基础上，通过导入基因的方法，延长细胞的生长周期，为组织工程学打下基础。延长细胞寿命甚至使细胞达到永生化的方法有很多，目前发现导入外源性人端粒酶逆转录酶基因(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)可以激活细胞内端粒酶的活性，该酶可使端粒长度保持恒定从而极大的扩张细胞的增殖能力，我们设想将外源性hTERT基因转入正常的细胞中，有可能激活端粒酶使细胞增殖能力增强，

3、不易衰老甚至有可能超越细胞增殖的危机获得永生化。然而问题是怎么把hTERT基因转入正常的细胞中?目前转基因的方法有很多包括病毒载体如逆转录病毒和腺病毒等：非病毒载体如阳离子脂质体介导法、钙离子沉淀法、电穿孔法等。方法不同，转化效率不同。脂质体转染法等效率很低，而逆转录病毒和腺病毒载体有比较高的转染效率，但腺病毒介导的外源性基因表达是暂时的，因为腺病毒DNA通常不能整合入细胞基因组。逆转录病毒能使目的基因稳定地整合于靶细胞的染色体，最终实现基因的转移，可以广泛用于高效的单一或多基因的转导，例如各种类型的原代细胞，

4、体内细胞等【23】。目前用逆转录病毒作为转基因的载体是最常用，效率比较高而且相对简单的方法。塑型点堂!!堕手堕主兰垡望文hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血问充厦干细胞基因转移研究本实验的目的是要构建hTERT-逆转录病毒载体，在脐血MSCs原代培养和纯化的基础上导入hTERT基因，观察该基因对脐血MSCs细胞端粒酶活性的影响，是否能够延长细胞的生命周期，并观察转基因细胞的分化能力。为进一步研究脐血MSCs的生物学特性及为组织工程学打下基础。方法1．采集健康正常分娩产妇志愿捐献的脐血，用PBS(phos

5、phate-bufferedsalinePH7．4)进彳亍1：1稀释，密度梯度离心分离单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，PBS洗涤2次后重悬于含15％胎牛血清的HlDMEM中，以1×10r／ml接种于50ml培养瓶中，三天后换液，以后隔“sd全量换液。长至80％融合后用0．25％的胰酶和0．02％EDTA混合液消化后传代。2．用PCR法从质粒pEGFP．hTERT．Cl扩出h11ERT的全部cDNA片断，用DNA重组技术将hTERT基因定向克隆／N．pLNCX2载体。3．用阳离子脂质体介

6、导法将病毒质粒导入包装细胞内，用0418筛选出阳性产毒细胞克隆，测定病毒滴度。取阳性克隆的病毒上清感染脐血MSCs，筛选出转基因细胞，我们将其命名为hTERT-MSCs细胞。采用反转录多聚酶链反应(reverse·transcriptpolyrnemsechainreaction,RT—PCR)方法检测脐血MSCs转染前后hTERT在mRNA水平的表达；采用端粒酶重复序列扩增法(telomererepeatamplificationprotocolassay，TRAP)·酶联免疫吸附试验(ELIsA)法检测人脐

7、位tMSCs转染前后端粒酶活性的变化；采用MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)测转染前后细胞生长曲线，观llTERT转入后对细胞增殖的影响。4．用5一氮杂胞苷罐J：hTERT-MSCs向心肌方向诱导。用细胞免疫组织化学方法检测心肌特异抗体：鼠抗人n横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(鼠抗肌d—Sareomericactin)，兔抗人连接体43多克隆抗体(Connexin．43)的表达。结果1．用BglII和NotI双酶切鉴定构建的质粒，酶切图谱为6．1kb和3．6kb两个片段，证明逆转录病毒载体PLNCX2．hTE

8、RT构建成功。2．用NIH3T3细胞检测病毒滴度，所挑选的4个克隆中，滴度最高为8×107cftl／L。选择该细胞克隆的病毒液转染细胞。Ⅱ郑州大学2005年硕士学位论文hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血阳J充质干细胞基因转移研究3．RT．PCR检测发现，脐血hTERT-MSCs细胞显示阳性，而未转染的细胞为阴性，可见细胞转入hTERT基因后在mRNA水平得到表达。4．TRAP