三疣梭子蟹鳃表达谱分析及3个神经肽基因在低盐适应中的功能研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M150107146上海海洋大学硕士学位论文三疣梭子蟹鳃表达谱分析及3个神经肽基题目：因在低盐适应中的功能研究Analysisofgillexpressionprofileandfunctional英文题目：studyofthreeneuropeptidegenesinlowsaltadaptationinPortunustrituberculatus专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：三疣梭子蟹遗传育种姓名：孙东方指导教师：刘萍研究员二O一八年四月五日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作

2、单位职称备注战文斌中国海洋大学教授主席宋协法中国海洋大学教授委员王芳中国海洋大学教授委员王清印黄海水产研究所研究员委员李玉全青岛农业大学教授委员翟倩倩黄海水产研究所助理研究员秘书答辩地点黄海所1号楼3楼会议室答辩日期2018.05.19上海海洋大学硕士学位论文三疣梭子蟹鳃表达谱分析及3个神经肽基因在低盐适应中的功能研究摘要三疣梭子蟹Portunustrituberculatus属于甲壳纲Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae，是重要的海洋经济动物，在我国分布广泛。三疣梭子蟹属大型广盐性水生甲壳动物，

3、可在盐度为13.7-47.7的环境中生存，具有生殖洄游习性，其产卵地多位于港湾或河口低盐区，并在深海高盐区越冬。盐度成为影响三疣梭子蟹生长发育至关重要的环境因子之一，对其摄食、蜕皮、生长、代谢、免疫等具有重要作用。因此，进行盐度适应机制研究对三疣梭子蟹耐盐良种的培育具有重要意义。为解析三疣梭子蟹盐度适应机制，本论文设计了以下研究内容：首先，通过新一代测序技术对盐度耐受性性状差异三疣梭子蟹鳃组织进行高通量表达谱测序，通过比较转录组分析发掘盐度适应相关基因；其次，在比较转录组分析基础上，我们发现神经肽家族基因在三疣梭子蟹盐度耐受性性状差

4、异家系间以及盐度胁迫后显著差异表达，推测神经肽可能在三疣梭子蟹盐度适应中具重要作用。因此，挑选了蝗抗利尿肽、甲壳动物心激肽、甲壳动物高血糖素等基因，通RCAE、染色体步移等技术获得cDNA或基因组全长序列，并进一步通过qPCR、RNAi及酶活测试等分子生物学技术解析其在低盐适应中的分子机制，主要研究结果如下：1.低盐胁迫下三疣梭子蟹鳃表达谱分析采用新一代测序技术对盐度耐受性性状差异三疣梭子蟹鳃组织进行高通量表达谱测序，测序10个样本平均产生23,941,392条cleanreads，与参考序列比对率为86.74%。利用比较转录组学方

5、法发掘差异表达基因9,475条，涉及离子转运蛋白基因、离子通道蛋白基因、神经肽基因和氨基酸代谢相关基因等。比较低盐耐受型家系和低盐敏感型家系差异基因发现，离子转运基因显著差异表达，包括Na+/K+-ATPase（上调）、V-ATPase（上调）、碳酸酐酶（上调）、几丁质酶（下调）和钙网蛋白（下调）等，此外热休克蛋白、代谢相关的精氨酸激酶等均显著上调。GO富集分析结果显示，差异基因主要富集于生物调节、细胞过程、代谢过程、单有机体I上海海洋大学硕士学位论文过程、细胞组分、细胞膜、细胞器、结合、催化活性、转运活性等GO条目。KEGG信号通

6、路富集结果显示，差异基因主要富集于代谢通路，吞噬小体通路，癌通路和核糖体蛋白通路。此外我们从转录组中筛选到33个神经肽基因及相关受体基因，从表达谱中筛选到三个盐度相关的神经肽基因（蝗抗利尿肽、甲壳动物心激肽、甲壳动物高血糖素），并且显著差异表达，为我们后续研究提供了实验基础。2.低盐胁迫下蝗抗利尿肽基因的表达分析采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因（PtNP）。PtNP基因全长1920bp，5’非编码区237bp，3’非编码区1373bp，开放阅读框309bp，编码102个氨基酸，预测分子量10.8kDa，理论等电点7.4

7、2。PtNP含有12个半胱氨酸残基，具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明，PtNP与拟穴青蟹NP4的同源性最高（89%），并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现，PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高，其次是鳃和眼柄，在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达模式发现，低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达变化，整体呈上调表达趋势，其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调7.7倍、2.8倍和2.6倍（P<0.05）。去除眼柄后，PtNP

8、基因在鳃中的表达成上升趋势，且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组（P<0.05）。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。3.甲壳动物心激肽基因克隆及在低盐适应中的功能验证采